穗花杉雙黃酮在制備治療血小板減小癥藥物的應用
【專利摘要】本發明涉及一種治療血小板減少癥的藥物的用途，具體涉及穗花杉雙黃酮在制備治療血小板減少癥的藥物的應用。可通過添加藥學上可接受的常規輔料，將穗花杉雙黃酮制備成口服制劑或注射制劑。藥效學試驗表明穗花杉雙黃酮能有效抑制因化療藥物導致的血小板減少和血小板減少性紫癜的治療，療效顯著，毒副作用小。
【專利說明】
穗花杉雙黃酬在制備治療血小板減小癥藥物的應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于藥物技術領域，設及一種治療血小板減少癥的藥物，具體地說，設及穗 花杉雙黃酬在制備治療血小板減小癥的藥物的應用。
【背景技術】
[0002] 血小板是從骨髓成熟的巨核細胞胞質裂解脫落下來的具有生物活性的小塊胞質。 血小板具有特定的形態結構和生化組成，在正常血液中有較恒定的數量，健康人血小板數 量為100 X 10 VL~300 X 1 oVl。血小板在止血、傷口愈合、炎癥反應、血栓形成及器官移植排 斥等生理和病理過程中有重要作用。
[0003] 正常外周血小板計數< 10 0 X 10 Vl稱為血小板減少癥。因血小板減少而導致的出 血大約占臨床出血性疾病的30%。一般情況下，血小板計數<20 XIOVl時，可出現自發性 內臟出血，煩內出血等致命性出血。血小板減少可W由多種原因引起，按病因分類主要有化 療所致血小板減少癥（。11日1]1〇1:11日拘9廠;[]1山1。日(11:111'〇1]113〇。八〇9日]11日，〔11')、免疫性血小板減 少性紫齋（idiopathic th;romboc5ftopenic pu巧ura，ITP)、脾功能亢進癥等。由于血小板一 旦減少至病理狀態，恢復較慢，臨床上又沒有特效藥，因此如何解決血小板減少癥是臨床迫 切需要解決的難題。
[0004] 輸注血小板是治療血小板減少癥的傳統方法，但輸注血液制品不僅有感染血源性 傳播疾病的危險，而且反復輸注可誘發患者發生同種異體免疫反應，從而降低輸注效果，引 發其他嚴重不良反應。血小板保存時間短、高昂的輸血費用和緊缺的血源更使得該種治療 方法受到了較大的限制。
[0005] 治療血小板減少癥，除了傳統的血液制品輸注外，目前應用于臨床的還有重組人 白介素-11 (rhIL-11)、重組人白介素-11衍生物（rhix-l lAla^)和重組人血小板生成素 (riiTPOKrh化-11雖然對血小板減少有不錯的效果，但較高的不良反應發生率限制了其應 用，比如肌肉關節痛、結膜充血、下肢水腫、皮疹、屯、惇、屯、律失常、水腫、發熱、注射局部疼 痛、頭痛頭暈、乏力等。
[0006] 重組人血小板生成素雖能有效地促進非造血系統腫瘤化療后血小板生成，但對造 血系統腫瘤化療后的血小板生成作用并不理想。臨床研究中發現，rhTPO常見的副作用有發 熱、乏力、肌痛、頭痛、關節痛、呼吸困難、腹瀉、肺栓塞，少數癌癥患者在治療中出現了血栓 栓塞，W及不可逆骨髓網狀纖維增生等多種并發癥或后遺癥。
[0007] 中醫認為血小板減少屬于"發斑"、"血證"范疇，其病因在于熱毒識盛，氣不攝血， 致使血妄行或可能為肝實脾虛，肝木凌±，脾不統血而引發該病。不同病因導致的血小板減 少癥的中醫治療方案有著明顯區別。對于血小板減少性紫齋（ITP)，常用藥物有江南卷柏 片、血小板膠囊、維血寧顆粒等。針對化療后引起的血小板減少癥，常用中藥有人參、黃巧、 白術、當歸、地黃、阿膠、雞血藤、補骨脂、構杞子、女貞子、仙鶴草、花生衣等，也有些復方制 劑如復方皂抓丸、升板方等。
[000引江南卷柏（Selaginella Moellendorfii Hieron.)屬于卷柏科 (Selaginellaceae)卷柏屬（Selaginella)植物，別名石柏、巖柏草、黃痘卷柏，主要分布于 我國長江流域W及長江W南各地，北至秦嶺山區。江南卷柏具有清熱解毒、止血生肌、抗癌 等功能，臨床上用于治療原發性血小板減少性紫齋、肺炎、癌癥、眼結膜炎、急性扁桃體炎和 乳腺炎等癥。江南卷柏單味藥制劑江南卷柏片臨床適用于血熱妄行所致的皮下紫擁，癥見 皮膚出現散在青紫斑點或斑塊，舌紅、苔黃、脈數等，原發性血小板減少性紫齋見上述血熱 癥候者。但江南卷柏治療原發性血小板減少性紫齋的活性成分尚不明確。為了掲示江南卷 柏治療原發性血小板減少性紫齋的藥效物質基礎，本課題組對江南卷柏進行了較為系統的 化學成分研究，分離鑒定了穗花杉雙黃酬(Amentof lavone)、棲雙黃酬化ayaf lavone)、羅漢 松雙黃酬A(F*odoca;rpusflavone A)、扁柏雙黃酬化inokiflavone)等單體化合物。采用人巨 核細胞株Dami增殖分化的體外藥效篩選模型考察分離得到的單體化合物對血小板生成的 影響，結果發現本植物分離得到的穗花杉雙黃酬(0.5,2.5,12.5μΜ)具有促進巨核細胞增殖 分化、釋放血小板入血的的作用，初步提示穗花杉雙黃酬為傳統中藥江南卷柏促進血小板 生成的藥效活性成分。為了進一步驗證穗花杉雙黃酬的促進血小板生成的藥效活性，采用 注射卡銷致BALB/c小鼠血小板減少模型，及原發免疫性血小板減少性紫齋小鼠模型等兩種 藥效試驗模型，結果顯示穗花杉雙黃酬口服給藥對卡銷導致BALB/c小鼠血小板減少及原發 免疫性血小板減少性紫齋小鼠的血小板減少均具有明顯的改善作用，具有升血小板、改善 血小板功能、及增加血小板聚集率等藥效活性。安全性試驗表明，W6.0g/kg劑量給SD大鼠 單次灌胃給藥，穗花杉雙黃酬最大耐受劑量為6 . Og/kg，未發現與藥物有關的毒理學異常， 本品安全性較好。
[0009] 目前，已有少量穗花杉雙黃酬用于抗癌、抗紫外線導致的皮膚損傷、治療認知障 礙、降血糖、舒張血管等的報道。申請號為201510303792.4的專利申請中介紹，藥物組合物 包括穗花杉雙黃酬、當藥苦巧、下香苦巧、猜牙菜巧，可W治療肝癌、肺癌、胃癌。
[0010] 申請號為200910066695.2的專利申請中介紹，穗花杉雙黃酬具有抗屯、肌缺血，可 用于治療由屯、肌缺血等引起的屯、血管疾病。
[0011] 申請號為200910066524.X的專利申請中介紹，穗花杉雙黃酬具有α-葡萄糖巧酶抑 制作用、降血糖作用和調血脂作用，可用于預防和治療高血糖及高血脂癥。
[0012] 申請號為2009100640581的專利申請中介紹，通過CC^致肝損傷小鼠模型體內實 驗證實，穗花杉雙黃酬能降低肝損傷小鼠的血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶水平，達到保肝 降酶的作用。
[0013] 但是，上述現有技術并未報道將穗花杉雙黃酬用于血小板減少癥的治療，更未公 開穗花杉雙黃酬在治療血小板減小癥的應用。
[0014] W上所示穗花杉雙黃酬的植物來源可W是卷柏科卷柏屬江南卷柏 (S.Moellendo;rfii)、卷柏（S.Tamariscina)，墊狀卷柏（S.pulvinata)等，也可 W是卷柏科 其他植物中分離，其來源也可W是化學合成，也可W是在某個黃酬類化合物的基礎上進行 結構修飾或生物轉化。
【發明內容】
[0015] 本發明的目的在于提供一種穗花杉雙黃酬在制備治療血小板減小癥的藥物組合 物的用途。
[0016] 具體的，本發明設及一種治療血小板減少癥的藥物組合物的用途，其中所述血小 板減少癥包括由化療藥物所致的血小板減少、原發性和繼發性血小板減少性紫齋、再生障 礙性貧血及骨髓增生異常綜合癥。
[0017] 進一步，本發明所述的血小板減少癥為化療藥物所致血小板減少癥。
[0018] 本發明提供了一種藥物組合物，其包含穗花杉雙黃酬和一種或多種藥學上可接受 的藥用賦形劑。
[0019] 本發明還提供了一種藥物組合物，其含有有效治療劑量的穗花杉雙黃酬與其它藥 物制成的制劑。其中，所述其它藥物包括但不限于羅漢松雙黃酬A^odoca巧usflavone A)、 棲雙黃酬化ayaf lavone)、扁柏雙黃酬化inokif lavone)等。
[0020] 本發明提供了一種藥物組合物，其為由含有1%-99%的穗花杉雙黃酬或其它可組 方的藥物和99%-1 %的藥用賦形劑制成的口服制劑或注射制劑。優選含有5%-50%的穗花 杉雙黃酬或其它可組方的藥物和95 % -50 %的藥用賦形劑制成的口服制劑或注射制劑。
[0021] 本發明通過添加藥學尚可接受的常規輔料，將穗花杉雙黃酬制備成口服制劑或注 射制劑，應用于臨床治療血小板減少癥。
[0022] 進一步優選的，所述口服制劑為片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、丸 劑、口服液體制劑當中的任何一種;所述的注射制劑為注射液或粉針劑。其中，口服制劑為 普通片劑、膠囊劑、分散片、口腔崩解片或緩釋片;所述的注射制劑為注射液。
[0023] 本發明的技術效果:本發明首次發現了穗花杉雙黃酬能夠用于血小板減少癥的治 療。藥效學試驗證實穗花杉雙黃酬能有效抑制因化療藥物導致的血小板減少和血小板減少 性紫齋的治療，療效顯著，毒副作用小。
【附圖說明】
[0024]
[0025] 圖1:江南卷柏雙黃酬類化合物對人巨核細胞株Dami細胞活性的影響
[0026] 與對照組比較，沖< 0.05，*沖< 0.01。
[0027] 圖2 :MTT法檢測江南卷柏雙黃酬類化合物對Dami細胞的增殖作用 [002引與對照組比較，沖< 0.05，*沖< 0.01。
[0029] 圖3:江南卷柏雙黃酬類化合物對Dami巨核細胞集落生成的影響。
[0030] 圖4:江南卷柏雙黃酬類化合物對Dami巨核細胞多倍體的影響
[0031] 與對照組比較，沖<0.05，*沖<0.01。
[0032] 圖5:江南卷柏雙黃酬類化合物對Dami巨核細胞表面CD41表達率的影響
[0033] 與對照組比較，沖<0.05，*沖<0.01。
【具體實施方式】
[0034] W下是關于江南卷柏雙黃酬類化合物的體外促進血小板生成的細胞活性篩選研 究，W及穗花杉雙黃酬單體化合物的注射卡銷致BALB/c小鼠血小板減少模型，及原發免疫 性血小板減少性紫齋小鼠模型的藥效學試驗研究。
[0035] 實施例1江南卷柏黃酬類化合物的體外細胞活性篩選
[0036] 1.1試驗材料與儀器
[0037] 1.1.1試驗材料
[0038] Dami細胞，廣州吉妮歐生物科技有限公司；RPMI-1640培養基，南京凱基生物科技 發展有限公司；胎牛血清，美國ScienCell公司；雙抗(青霉素、鏈霉素)南京凱基生物科技有 限公司；臺吩藍，加拿大BioBasic有限責任公司；嚷挫藍(methyl thiazolyl tetrazolium， MTT)，南京凱基生物科技發展有限公司;β-琉基乙醇，美國Amresco公司；姬姆薩(Giemsa)色 素，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉，美國PeproTech公司；人血小板生成素化uman thrombopoietin，TPO)，美國PeproTech公司；CD41-FITC，美國BioLegend公司；艦化丙晚 (propidium iodide，PI)染料、RNA酶，美國Sigma公司；穗花杉雙黃酬、棲雙黃酬、羅漢松雙 黃酬A、扁柏雙黃酬等均從江南卷柏(S.Mollendo計ii)中分離得到，NMR，MS等波譜方法鑒定 結構，純度均>95 %。
[0039] 1.1.2試驗儀器：
[0040] 酶標儀，瑞±Tecan公司；倒置巧光顯微鏡，日本Nikon公司；FACS Calibar流式細 胞儀，美國抓公司。
[0041 ] 1.2試驗方法
[0042] 1.2.1細胞培養及分組
[0043] RPMI-1640培養基中添加體積分數10%胎牛血清和1 %雙抗配成完全培養基，于37 °C、5%C02、95%相對濕度條件下培養人巨核細胞株Dami，取對數生長期的細胞用于實驗。 取穗花杉雙黃酬、棲雙黃酬、羅漢松雙黃酬A、扁柏雙黃酬等單體化合物分別溶解于二甲基 亞諷(DMS0)中，使儲備液濃度為lOmmol/L，存放于-80°C冰箱中，使用時用完全培養基稀釋 至所需濃度。細胞分組:按受試藥在細胞培養液終濃度為0.5、2.5、12.5ymol/L分別與Dami 細胞共同培養，將完全培養基培養的細胞設為對照組。
[0044] 1.2.2臺吩藍染色實驗檢測細胞活性
[0045] 將按照1.2.1節方法常規培養4她的各組細胞懸液與質量分數0.4%的臺吩藍染液 按體積比9:1混合后，滴入計數板。靜置Imin，使懸浮細胞下沉，在顯微鏡下計數。未著色的 為活細胞，呈藍色的為死細胞。按照下式計算活細胞比例。
[0046] 活細胞比例（％ )=(細胞總數-死細胞數)/細胞總數X 100%
[0047] 1.2.3 MTT細胞增殖實驗
[004引細胞達到對數生長期后按5X 104個/mL的密度接種于96孔板中，每孔體積20化L， 每組設6個復孔。放入培養箱中常規培養4她后離屯、，棄去上清液，每孔加入20化質量分數 0.5 %MTT溶液，繼續培養4h后棄去上清液，每孔加入150μΙ DMS0，在微量振蕩儀上振蕩 5min，于酶標儀上570nm波長處測定吸光度。
[0049] 1.2.4細胞集落培養實驗
[0050] 取無菌離屯、管5支，按體積分數依次加入60%RPMI-1640培養基、10%β-琉基乙醇 α0mmol/L)、10%FBS、10%各組細胞懸液（調整細胞密度為104個/mL)、50ng/mLTP0，混勻 后在37°C條件下預熱。取預熱的瓊脂迅速按10%體積分數加入到各組細胞懸液中，混勻后 接種于3.5cm培養皿上。數十分鐘后待其凝固，放入培養箱中常規培養。5天后取出，在顯微 鏡下觀察細胞集落生長情況，每個培養皿底米"字等分為8份，每份中選取兩個視野，記 錄每組集落數目之和，大于或等于10個細胞記為一個集落。
[00引]1.2.5細胞6161113日染色實驗
[0052] 細胞常規培養2天后取各組細胞涂于載玻片上。待自然驚干后，于甲醇中固定 5min，然后在Giemsa染色液中浸染20min，流水沖洗后驚干，中性樹膠封固并在顯微鏡下觀 察，選取每張載玻片的4個頂角及載玻片中間共5個視野拍照。
[0053] 1.2.6流式細胞儀定量檢測細胞DNA多倍體
[0054] 收集常規培養天的各組細胞于潔凈的EP管中，調整細胞密度為1 X 106個/mL。細胞 固定15min后用體積分數70%乙醇通透細胞化，洗涂細胞兩次，取lOOmL細胞懸液于流式細 胞上樣管中，加入RNA酶，37°C條件下解育20min，再加入PI染料（對照組不加），避光作用 20min后每管加入憐酸鹽緩沖液(PBS)至500mL，用流式細胞儀檢測細胞DNA濃度分析其多倍 體生成情況。
[0055] 1.2.7流式細胞術測定細胞表面CD41含量
[0056] 流式細胞術細胞樣本收集同1.2.6節，細胞洗涂兩次后取lOOmL細胞懸液于流式細 胞上樣管中，分別加入流式抗體CD41-門TC，每組設兩個平行樣并設IgG同型對照組。細胞與 抗體避光解育15min后，每管加入400mL PBS，在流式細胞儀上檢測其表達情況。
[0057] 1.2.8數據分析
[0化引每項實驗至少重復3次，數值采用SPSS 16.0軟件包進行統計分析，結果Wx +S 表示。多組均數的比較采用單因素方差分析(One-Way AN0VA)，兩組間的比較采用t檢驗分 析。
[0化9] 1.3試驗結果
[0060] 1.3.1江南卷柏雙黃酬類化合物對人巨核細胞株Dami活性的影響
[0061] 各組細胞在培養箱中培養2d后，計算其活細胞比例，結果見附圖1。2.5、12.扣Μ的 穗花杉雙黃酬和12.5μΜ的羅漢松雙黃酬A與細胞共同培養后，活細胞比例顯著高于對照組， 其他雙黃酬類化合物對細胞活性沒有顯著影響。
[0062] 1.3.2江南卷柏雙黃酬類化合物對人巨核細胞株增殖能力的影響
[0063] 采用MTT法檢測江南卷柏雙黃酬類化合物對Dami細胞增殖能力的影響，如附圖2所 示，0.5、2.5、12.5μΜ的穗花杉雙黃酬和12.5ιχΜ的羅漢松雙黃酬A與細胞共同培養后，可顯著 增強dami細胞的增殖能力，其他雙黃酬類化合物對細胞增殖能力沒有顯著影響。
[0064] 1.3.3江南卷柏雙黃酬類化合物對Dami巨核細胞集落生成的影響
[0065] Dami巨核細胞集落培養結果見附圖3，與對照組相比，0.5、2.5、12.5ιχΜ的穗花杉雙 黃酬共同培養的細胞集落生成數目明顯高于對照組，具有顯著性差異(ρ<0.01)，其他雙黃 酬類化合物各劑量組的細胞集落生成數目與對照組相比沒有統計學差異。
[0066] 1.3.4江南卷柏雙黃酬類化合物對Dami細胞DNA多倍體生成的影響
[0067] 如附圖4所示，流式細胞儀檢測細胞DNA多倍體數目結果顯示，與對照組相比，12.5 μΜ穗花杉雙黃酬與細胞共同培養后>8N細胞比例明顯增加。其他雙黃酬類化合物各劑量組 對巨核細胞多倍體的影響與對照組相比沒有統計學差異。
[006引1.3.5江南卷柏雙黃酬類化合物對Dami巨核細胞表面CD41表達量的影響 [0069]流式細胞術檢測細胞表面CD41陽性表達率結果見附圖5，與對照組相比，穗花杉雙 黃酬（0.5、2.5、12.541)^個劑量組與細胞共同解育后表面〔041表達率明顯增加（口< 0.01)。說明穗花杉雙黃酬可增加細胞成熟度，其他雙黃酬類化合物各劑量組與對照組相比 沒有統計學差異。
[0070] 綜上所述，巨核細胞增殖分化是血小板產生的前提，巨核細胞經過成熟、前血小板 的產生、細胞內外環境作用等一系列過程后最終將血小板釋放到血液中。促進巨核細胞增 殖分化可W維持體內血小板活化調亡后數目的穩定。
[0071] 本研究首次發現穗花杉雙黃酬能明顯增強Dami細胞活性，細胞增殖能力也明顯增 強，細胞Giemsa染色實驗與細胞DNA多倍體檢測結果分別定性、定量地說明了細胞在穗花杉 雙黃酬作用下分化能力顯著增強，與此同時細胞的成熟度也相應增加。因此，穗花杉雙黃酬 能夠在體外有效促進人巨核細胞的增殖分化。
[0072] 實施例2穗花杉雙黃酬對注射卡銷致BALB/c小鼠血小板減少模型的影響
[0073] 2.1試驗材料與儀器
[0074] 2.1.1試驗藥品及配制方法：
[00對卡銷注射液，規格100mg:10ml，齊魯制藥有限公司，批號：9080082ES，臨用前用生 理鹽水配成6.25mg/ml。
[0076] 注射用重組人白介素-ll(IL-ll)，規格100mg:10ml，齊魯制藥有限公司，批號： 201412061SM，臨用前用生理鹽水配成0.05mg/ml。
[0077] 試藥穗花杉雙黃酬，實驗室自制，臨用前用生理鹽水配置成0.5、1.5、5mg/ml，用于 灌胃給藥。
[007引 2.1.2試驗儀器：
[00巧]血球計數板，上海求精生化試劑有限公司；0LYMPUS-CH普通光學顯微鏡，日本 OLYMPUS公司。
[0080] 2.1.3試驗動物：
[0081 ] 清潔級BALB/C小鼠，雄性，體重24-28g，揚州大學比較醫學中屯、，合格證號：SCXK (蘇）2012-0004。
[0082] 2.2試驗方法
[0083] 2.2.1動物分組及給藥方法
[0084] 60只BALB/C小鼠，隨機分為6組，每組10只，分別為：正常對照組、模型組、陽性藥 比-11組、穗花杉雙黃酬組低、中、高劑量組（10、30、100111肖/1^)。化療前7天((1-7)，正常對照 組、模型組和陽性藥化-11組分別灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g/d，穗花杉雙黃酬低、中、高 組按0.2ml/10g體積分別灌胃給予10、30、lOOmg/kg/d穗花杉雙黃酬混懸溶液，各組每天給 藥，連續7天(d-7~d-1);化療前最后1天灌胃后(d-1)，開始化療，模型組、陽性藥IL-11組和 穗花杉雙黃酬低、中、高劑量組分別一次性腹腔注射125mg/kg卡銷，正常對照組腹腔注射等 體積生理鹽水;次日（dl)，正常對照組和模型組繼續分別灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g/d， 陽性藥化-11組按0.2ml/10g皮下注射化-11 0.25mg/kg/d，穗花杉雙黃酬低、中、高組按 0.2ml/10g體積分別灌胃給予10、30、100mg/kg/d穗花杉雙黃酬溶液，各組每天給藥，連續14 天(dl~dl4)。
[0085] 2.2.2指標檢測方法
[00化]2.2.2.1試驗動物一般狀況
[0087] 觀察小鼠精神狀況、活動及死亡情況。
[0088] 2.2.2.2試驗動物體重變化
[0089] 于d-8、d-4、d-1、d3、d7、dl 0、dl 4稱量體重，記錄體重變化。
[0090] 2.2.2.3外周血小板計數
[0091] 各組動物分別于(1-8、(1-4、(1-1、(13、(17、(110、(114，尾部取血，參照徐叔云編寫的1994 版《藥理實驗方法學》第1106~1107頁方法，用血細胞計數板，手工計算外周血小板數量。
[0092] 2.2.2.4統計學方法
[0093] 統計描述用"平均值±標準差"（x±s)表示，多組間均值比較采用單因素方差分 析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。
[0094] 2.3試驗結果
[00巧]2.3.1試驗動物一般狀況
[0096] 造模前，各組小鼠毛色發亮，活動自如，行為、精神狀態正常;造模后的小鼠毛色枯 橘，出現身體發軟、扎堆、精神萎靡、瞇眼、反應遲純、軟便等，陽性藥IL-11組和穗花杉雙黃 酬低、中、高劑量組的小鼠，行為及精神狀態較模型組有所改善。
[0097] 2.3.2試驗動物體重的變化
[0098] 各組試驗動物化療前后體重變化見表1。化療前，正常對照組、模型組、陽性藥IL- 11組、不同劑量的穗花杉雙黃酬組，小鼠體重均正常增長，各組與空白對照組比較，均無顯 著性差異。化療后，模型組小鼠體重明顯減輕，與正常對照組有顯著性差異；陽性藥IL-11組 小鼠在化療初期體重明顯減輕，化療后第1〇、14天，體重趨于穩定，與模型組相比有顯著性 提高;給予不同劑量的穗花杉雙黃酬組小鼠在化療初期體重明顯減輕，化療中、后期，體重 趨于穩定，并有所回升，其中高劑量組最為明顯，與模型組相比體重顯著性提高。
[0099] 表1試驗動物體重的變化（x±s)
[0100]
[0101] 注:與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
[0102] 2.3.3外周血小板計數
[0103] 由表2可見，試驗前各組動物的血小板計數無明顯差異。化療前，穗花杉雙黃酬組 預給藥一周后，中劑量和高劑量組小鼠的血小板計數明顯高于正常對照組。化療后，模型組 小鼠的血小板計數顯著下降。陽性藥IL-11組和穗花杉雙黃酬低、中、高劑量組小鼠的血小 板計數均出現不同程度的回升，其中穗花杉雙黃酬高劑量組效果最為明顯。
[0104] 表2各組試驗動物外周血小板計數的變化（XlOVUx ±s)
[0105]
[0106] 注:與模型組相比，*p<0.05,料p<0.01。
[0107] 2.4 結論
[0108] 由W上結果可知，分別連續21天灌胃給予10、30、100mg/kg穗花杉雙黃酬溶液，可 W顯著抑制化療藥物卡銷導致的BALB/C小鼠外周血中血小板降低，其中30、100mg/kg劑量 組療效優于〇.25mg/kg劑量的IL-11組。說明穗花杉雙黃酬可W用于化療導致血小板減少癥 的治療。
[0109] 實施例3穗花杉雙黃酬對特發性血小板減少性紫齋的影響
[0110] 3.1試驗材料與儀器
[0111] 3.1.1試驗藥品及配制方法：
[0112] 醋酸潑尼松片，規格:5mg/片，天津藥業集團新鄭股份有限公司，批號：150126,臨 用前研成粉末，用生理鹽水配成Img/ml的混懸液。試藥穗花杉雙黃酬，實驗室自制，臨用前 用生理鹽水配置成〇.5、1.5、5mg/ml，用于灌胃給藥。
[0113] 3.1.2試驗儀器：
[0114] 血球計數板，上海求精生化試劑有限公司；0LYMPUS-CH普通光學顯微鏡，日本 OLYMPUS公司。
[0115] 3.1.3試驗動物：
[0116] 清潔級BALB/C小鼠，雄性，體重18-22g，揚州大學比較醫學中屯、，合格證號：SCXK (蘇）2012-0004:健康普通級豚鼠，體重250-350g，青龍山動物繁殖場，許可證號：SYXK(蘇） 2010-0006。
[0117] 3.2試驗方法
[011引 3.2.1豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗血清的制備
[0119] 抗原的制備:取BALB/C小鼠斷頭取全血，肝素抗凝，800巧m離屯、lOmin后，取上層富 含血小板血漿(PRP)3000rpm離屯、lOminW沉淀血小板。用0.15moL/L pH7.4的憐酸鹽緩沖液 (PBS)洗涂血小板，每次均W300化pm離屯、lOmin，棄去上層液體，連續3次。然后W〇.15moL/ LpH7.4PBS懸浮血小板，計數后備用。
[0120] 免疫方法:取上述制備好的BALB/C小鼠血小板分別與等量完全弗氏佐劑和不完全 弗氏佐劑混合成油包水型乳劑。取完全弗氏佐劑抗原于ο周皮下注射于豚鼠足掌、腹部、背 部、蔽窩等處，至少四點，每點〇.2mL。取不完全弗氏佐劑抗原于1、2、4周皮下注射于豚鼠足 掌、腹部、背部、蔽部等處，每次至少四點，每點〇.2mL。每次注射完后在注射點用艦酒消毒W 防感染。第五周乙酸麻醉豚鼠，股動脈取不抗凝全血，室溫放置化，然后置4 °C過夜，此時血 清已與血塊分離，吸出血清，150化pm離屯、20min，取上清液即為豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗 血清(GP-APS)，膽存于-20°C冰箱中待用。
[0121] 抗血清(APS)效價的檢測:參照化ISA法加 W改進，用國產凍干酶聯A蛋白純品代替 堿性憐酸酶-蛋白A酶標抗體，原理相同。
[0122] 抗血清(APS)的處理:將APS從-20°C中取出，于56°C水浴30min，用等量BALB/C小鼠 紅細胞(5%)吸附至少兩次，用生理鹽水稀釋成1:4的AI^待用。
[0123] 3.2.2動物分組及給藥方法
[0124] 60只BALB/C小鼠，隨機分為6組，每組10只，分別為:正常對照組、模型組、陽性藥醋 酸潑尼松組、穗花杉雙黃酬組低、中、高劑量組（10、30、100111肖/1^)。造模第5天((15)開始按 0.2mL/10g/d灌胃給藥，至造模后第14天(dl4)。正常對照組、模型組灌胃生理鹽水，陽性藥 醋酸潑尼松組按20mg/kg劑量灌胃醋酸潑尼松混懸液，穗花杉雙黃酬組低、中、高劑量組分 另峨10、30、100mg/kg劑量給藥。
[0125] 3.2.3原發免疫性血小板減少性紫齋模型的建立
[01%] 于(11、(13、(15、(17、(19、(111、(113，正常對照組腹腔注射0.11111720旨生理鹽水，其余5組 小鼠分別腹腔注射0. lmL/20g的1:4豚鼠抗血小板血清(APS)。
[0127] 3.2.4指柄;檢測方法
[012引 3.2.4.1小鼠一般狀況
[0129] 觀察小鼠精神狀況、活動及死亡情況。
[0130] 3.2.4.2 脾臟系數
[0131 ]于dl4給藥后處死，剝取脾臟，用生理鹽水沖洗，吸去水分，精密稱量，計算臟器系 數，脾臟系數=脾臟質量/小鼠體重X 100 %。
[0132] 3.2.4.3外周血小板計數
[0133] 各組動物分別于造模前(do)、給藥前(d4)、試驗結束時(dl4)，尾部取血，參照徐叔 云編寫的1994版《藥理實驗方法學》第1106~1107頁方法，用血細胞計數板，手工計算外周 血小板數量。
[0134] 3.2.4.4統計學方法
[0135] 統計描述用"平均值±標準差"（x±s)表示，多組間均值比較采用單因素方差分 析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。
[0136] 3.3試驗結果
[0137] 3.3.1小鼠一般狀況
[0138] 正常對照組小鼠反應靈活，毛色光亮，大便呈條狀。模型組在造模后第3天出現軟 便，大部分均表現出反應遲純、虛弱、瞇眼、豎毛、扎堆、體重減輕等癥狀，小部分消化道出 血、便血。各給藥組與模型組小鼠比較，一般狀況有所好轉。
[0139] 3.3.2脾臟系數
[0140] 試驗結束時，將各組試驗小鼠處死、解剖后可見，各臟器未見明顯異常。由表4可 見，與正常對照組相比，模型組小鼠的脾臟指數明顯下升高。與模型組相比，陽性藥醋酸潑 尼松組小鼠脾臟指數顯著降低，接近正常水平;穗花杉雙黃酬低、中、高劑量組小鼠的脾臟 指數有所降低，高劑量組具有顯著性差異。
[0141] 表4各組試驗動物脾臟指數比較（X ±s)
[0142]
[0143] 3.3.3外周血小板計數
[0144] 各組動物在造模前(do)、給藥前(d4)、試驗結束時(dl4)的外周血小板計數結果見 表5。由結果可見，造模前各組動物的血小板計數無明顯差異。造模后，與正常對照組相比， 模型組、陽性藥醋酸潑尼松組和穗花杉雙黃酬低、中、高劑量組小鼠的外周血小板計數顯著 下降。給藥10天后，與模型組相比，陽性藥醋酸潑尼松組、穗花杉雙黃酬低、中、高劑量組小 鼠的外周血小板計數顯著升高，其中穗花杉雙黃酬高劑量組效果最為明顯。
[0145] 表5各組試驗動物外周血小板計數的變化（X ±s)
[0146]
[0147] 注：與正常對照組相比，胃p<0.001;與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p< 0.001。
[014引 3.4結論
[0149] 由W上結果可知，分別連續10天灌胃給予10、30、100mg/kg穗花杉雙黃酬溶液，可 W顯著抑制豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗血清導致的BALB/C小鼠免疫性血小板減少，其中 30、100mg/kg劑量組療效優于20mg/kg劑量的醋酸潑尼松組。說明穗花杉雙黃酬可W用于免 疫性血小板減少性紫齋的治療。
[0150] 實施例4穗花杉雙黃酬片劑的制備
[0151] 分別取穗花杉雙黃酬、微晶纖維素、簇甲基纖維素鋼、滑石粉、硬脂酸儀適量，分別 過80目篩網，備用。取過80目篩穗花杉雙黃酬50g、微晶纖維素120g、簇甲基纖維素鋼30g充 分混合均勻，加入適量水做粘合劑，過24目篩網制粒，放入60°C烘箱干燥2小時，過24目篩網 整粒，加入適量硬脂酸儀和滑石粉，混合均勻，壓片，制成1000片，即得。規格:50mg，每次2 片，每日2次。
[0152] 實施例5穗花杉雙黃酬注射劑的制備
[0153] 取穗花杉雙黃酬lOg，加入適量0.9 %氯化鋼溶液溶解后，加入適量增溶劑及穩定 劑，配制至10L，過濾，分裝成每瓶1 OmL，熱壓滅菌，即得。規格：1 Omg: 10ml，每次1支，每日1 次，臨用前用100ml生理鹽水稀釋，靜脈滴注。
【主權項】
1. 穗花杉雙黃酮在制備治療血小板減少癥藥物組合物的用途。2. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于:所述血小板減少癥包括由化療藥物所致的 血小板減少、原發性和繼發性血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血及骨髓增生異常綜合癥。3. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于:所述血小板減少癥為化療藥物所致血小板 減少癥。4. 根據權利要求1-3中所述的用途，其特征在于:所述藥物組合物含有有效治療劑量的 穗花杉雙黃酮和一種或多種藥學上可接受的藥用賦形劑。5. 根據權利要求1-3中所述的用途，其特征在于:所述藥物組合物含有有效治療劑量的 穗花杉雙黃酮與其它藥物制成的制劑。6. 根據權利要求4或5所述的藥物組合物，其特征在于，其為含有1 %-99 %的穗花杉雙 黃酮或其它可組方的藥物和99%-1%的藥用賦形劑制成的口服制劑或注射制劑;優選為含 有5 % -50 %的穗花杉雙黃酮或其它可組方的藥物和95 %-50 %的藥用賦形劑制成的口服制 劑或注射制劑。7. 根據權利要求6所述的藥物制劑，其特征在于，所述的口服制劑選自于片劑、膠囊劑、 軟膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、丸劑、口服液體制劑當中的任何一種。8. 根據權利要求6所述的藥物制劑，其特征在于，所述的注射制劑為注射液或粉針劑。9. 根據權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的片劑為普通片劑、分散片、□腔崩解 片或緩釋片。10. 根據權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的注射制劑為注射液。
【文檔編號】A61P7/06GK105878232SQ201511033033
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年12月31日
【發明人】汪豪, 熊非
【申請人】南京豪創藥物科技有限責任公司