一種包裹細胞生長因子的脂質磷酸鈣納米粒的制備及應用

一種包裹細胞生長因子的脂質磷酸鈣納米粒的制備及應用
【專利摘要】本發明公開了一種脂質體磷酸鈣納米粒(Lipide calcium phosphate nanoparticles LCP NP)，具體是以脂質體包裹的磷酸鈣納米粒為載體及傳遞介質，在其中包裹細胞生長因子(FGF)制備成化妝品原料或活性添加成分，并可進一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑或膏霜劑。所述組合物具有滋潤、保濕、修復、抗衰的作用，脂質體磷酸鈣納米粒還能使攜帶的活性成分深入深層皮膚，活化深層皮膚細胞，起到重建皮膚屏障，修復敏感肌膚，抗皺嫩膚的作用。
【專利說明】
-種包裹細胞生長因子的脂質磯酸巧納米粒的制備及應用
技術領域
[0001] 本發明提供一種W脂質磯酸巧核必的組合物，具體是W脂質體磯酸巧納米粒為主 要材質，其可單獨使用，和/或作為載體及傳遞介質，包裹細胞重組人成纖維細胞生長因子 (FGF)生物活性蛋白制備成化妝品原料或活性添加成分，并可進一步制備成泡沫劑、水劑、 乳劑、凝膠劑、膏霜劑。屬于美容護膚品的技術領域。 技術背景
[0002] 生物護膚品的主要成分生物活性多膚大部分是細胞生長因子，而成纖維細胞生長 因子（FGF)無疑是當中的伎伎者。它們在體內含量極微，但生物活性極高，對多種細胞生理 功能和代謝活動發揮生物調節作用，直接或間接地影響多種類型細胞的生長、分裂、分化、 增殖和遷移，在美容護膚、整形外科、燒傷潰瘍W及各種皮膚病的傷口修復與愈合中有重要 作用。但是皮膚致密的屏障功能使大分子FGF的經皮吸收率低，無法發揮其優良的生物活 性。提高FGF體外皮膚給藥的生物利用度一直是生物美容領域亟待解決的一個關鍵問題。
[0003] 現代制劑技術水平的提高，微囊包裹技術在醫藥行業的廣泛運用，然而因其 在外用皮膚給藥方面的顯著優勢也使其近年來在化妝品行業嶄露頭角。脂質磯酸 巧化(P)納米粒是一種新型的基因轉染非病毒載體，已經不僅成功用于體外將核酸遞 送入細胞內并表達，且有報道用于負載吉西他濱和Trp2多膚等抗腫瘤成分能顯著地 增強其抑制腫瘤細胞增殖的作用[Zhang Y，Kim WY，Huang L. Systemic delivery of gemcit曰bine triphosphate vi曰 LCP nanoparticles for NSCLC 曰nd pancreatic cancer therapy [Jl.Biomaterials，2013, 34(13) ;；3447 ~；3458 ;Xu Z, Ramishetti S, Tseng YC,. Multifunctional nanoparticles co-delivering trp2peptide and CPG adjuvant induce potent cytotoxic t-lymphocyte response 曰g曰inst mel曰nom曰曰nd its lung metastasis[J].J Control Release, 2013,172(1) :259 ~26 引。該納米粒不但具備了脂質 體和磯酸巧良好的生物粘附性和生物相容性，生物利用度及安全性高等特點，而且改變了 單純磯酸巧納米粒容易聚合的特點，大大提高了大分子活性成分的包封率和穩定性，從而 提高內含活性成分的療效。
[0004] 本發明公開了一種W脂質磯酸巧納米粒為核必的組合物，具體是W脂質磯酸巧納 米粒作為載體及傳遞介質，包裹細胞生長因子（FG巧生物活性蛋白制備而成的化妝品原料 或活性添加成分，并可進一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑、膏霜劑。具有滋潤、保濕、 巧角質、抗衰、抗氧化的作用。與市場上現有的產品比較，本發明的脂質磯酸巧納米粒還能 使攜帶的活性成分深入深層皮膚，清除皮膚內部自由基，活化深層皮膚細胞，特別適用于敏 感肌膚，起到重建表皮，修復敏感肌膚，抗皺嫩膚的作用。

【發明內容】

[0005] 本發明公開了一種W脂質磯酸巧納米粒的組合物，具體是W脂質磯酸巧納米粒作 為載體及傳遞介質，包裹細胞生長因子（FG巧生物活性蛋白制備而成的化妝品原料或活性 添加成分，并可進一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑、膏霜劑。所述組合物具有滋潤、保 濕、修復的作用，脂質體磯酸巧納米粒還能使攜帶的活性成分深入深層皮膚，活化深層皮膚 細胞，起到重建皮膚屏障，修復受損及敏感肌膚，抗皺嫩膚的作用。
[0006] 在本發明的第一個方面，提供了一種W脂質磯酸巧為核必的組合物，其包含1~ 50重量％的脂質體，1~50重量％磯酸巧，0. 0001~1重量％的細胞生長因子FGF。
[0007] 其中所述脂質磯酸巧是W納米粒的形態存在，其粒徑為50nm~200nm。
[0008] 其中所述的FGF為成纖維細胞生長因子，優選自基因工程技術獲得的重組人 FGF(rhFGF)。主要包括重組人酸性成纖維細胞生長因子（rhaFGF)，和重組人堿性成纖維細 胞生長因子（riibFG巧中的一種。所述重組人酸性成纖維細胞生長因子（rhaFG巧的氨基酸 序列（GenBank N0;AAB29057. 2)。所述的重組人堿性成纖維細胞生長因子（riibFG巧的氨 基酸序列為（GenBank NO ;AAB21432. 2)。
[0009] 在本發明的第二個方面，提供了一種脂質磯酸巧納米粒為載體的包裹FGF的活性 半成品及其制備方法。
[0010] 其中所述包裹FGF脂質磯酸巧納米粒的制備方法為：
[0011] (1)將表面活性劑、助表面活性劑和有機溶劑A按照混合，構成油相Η元體系。將 氯化巧水溶液（10~250mM)、磯酸鹽水溶液（10~250mM) W及FGF水溶液（0. 1~0. 5mg/ mL)混合，制成水化將水相緩慢加入油相充分攬拌，制成油包水的微乳，室溫靜置5~ 15min產生磯酸巧沉淀，將巧樣酸鋼溶液巧~50mM)逐滴加入微乳中，攬拌混合均勻，體系 又恢復澄清透明。微乳過Ig 60~200目的硅膠填充的硅膠柱，用體積比1~5 : 1的己 醇/水為洗脫，洗脫液用旋轉蒸發儀揮干己醇后即得磯酸巧納米粒水溶液。
[0012] (2)取磯脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機溶劑B中，于5(TC旋轉蒸發，除 去有機溶劑，形成均勻脂質薄膜。加入同溫的蒸傭水室溫賠育0. 5~化，過0. 22 μ m微孔濾 膜，得到脂質體溶液。
[001引 做將（1)、似巧[J備所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。
[0014] 步驟（1)中所述的有機表面活性劑為泊洛沙姆、聚己二醇辛基苯基離、十二烷基 硫酸鋼或聚山梨醇中的一種或幾種；
[0015] 所述的助表面活性劑為正己醇、丙二醇、丙Η醇、己醇、異丙醇中的一種或幾種；
[0016] 所述的有機溶劑A為環己焼、正己焼、正辛焼中的一種；
[0017] 所述的表面活性劑；助表面活性劑：有機溶劑A=1~5 : 1~5 : 1~5。
[0018] 所述的磯酸鹽水溶液為磯酸二氨鋼、磯酸氨二鋼、Η聚磯酸鋼中的一種或幾種。
[0019] 所述的riiFGF為重組人成纖維細胞生長因子，優選自基因工程技術獲得的重組 人FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纖維細胞生長因子（rhaFG巧和堿性成纖維細胞生長因子 (riibFG巧中的一種。
[0020] 所述的氯化巧水溶液：磯酸鹽水溶液：FGF水溶液=10~200 : 10~ 200 : 10 ~50。
[0021] 步驟（2)中所述的有機溶劑B為氯仿、二氯甲焼、己醇中的一種或幾種混合；
[0022] 所述的磯脂為大豆磯脂、卵磯脂、氨化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、 1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0TAP)、聚己二醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺 (DS陽-PEG2000)中的一種或幾種，優選1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0ΤΑΡ);
[0023] 所述的包裹FGF脂質磯酸巧納米粒亦可通過W下制備方法獲得：
[0024] (1)將氯化巧水溶液（10~500mM)、FGF水溶液（0. 1~5mg/mL) W及油相混合， 作為混合液A。將磯酸溶液（10~50mM，pH = 9. 0)，油相W及磯脂混合，作為混合液B。將 A、B混合20min，加入10~50血己醇，12000g離必5~30min，己醇洗2-3遍后揮干己醇， 加1~lOmL去離子水制成包含FGF的磯酸巧納米粒混懸液。
[00巧](2)取磯脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機溶劑B中，于5(TC旋轉蒸發，除 去有機溶劑，形成均勻脂質薄膜。加入同溫的蒸傭水室溫賠育0. 5~化，過0. 22 μ m微孔濾 膜，得到脂質體溶液。
[002引 做將（1)、似巧[J備所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。
[0027] 步驟（1)中所述的油相為環己焼/壬基酪聚氧己帰離巧0-80% : 50-20% )。氯 化巧水溶液；FGF水溶液：油相=0. 05~1 : 0. 05~1 : 10~30。
[0028] 所述的磯酸鹽水溶液為磯酸二氨鋼、磯酸氨二鋼、Η聚磯酸鋼中的一種或幾種。
[0029] 所述的FGF為成纖維細胞生長因子，優選自基因工程技術獲得的重組人 FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纖維細胞生長因子（rhaFG巧和堿性成纖維細胞生長因子 (riibFG巧中的一種。
[0030] 步驟（1)中所述的磯脂為1,2-油醜磯脂酸值0PA)，1,2-二油醜基磯脂醜膽堿 值0PC)、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧中的一種，優選1,2-油醜磯脂酸值0PA)。
[0031] 所述的磯酸鹽水溶液：油相：磯脂=0. 05~1 : 10~30 : 0. 05~1。
[0032] 步驟（2)中所述的有機溶劑為氯仿、二氯甲焼、己醇、己離中的一種或幾種混合；
[0033] 所述的磯脂為大豆磯脂、卵磯脂、氨化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、 1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0TAP)、聚己二醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺 (DSPE-PEG2000)中的一種或幾種，優選1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0ΤΑΡ);
[0034] 本發明所述包裹細胞生長因子的脂質磯酸巧納米粒可進一步制備成泡沫劑、水 劑、乳劑、凝膠劑或膏霜劑。
[0035] 因此，本發明提供下述：
[0036] 1. -種W脂質磯酸巧納米粒為核必的組合物，其包含1~50重量％的脂質體， 1~50重量％磯酸巧，0. 0001~1重量％的細胞生長因子FGF。
[0037] 2.根據第1項所述的組合物，其中所述脂質磯酸巧納米粒的粒徑為lOOnm~ 500nm。
[0038] 3.根據第1項所述的組合物，其中FGF為通過基因工程技術獲得的重組人 FGF (rhaFGF 和 rlAFG巧。
[0039] 4.根據第1項所述的組合物，其中所述脂質體磯酸巧W納米粒形式存在，所述納 米粒負載有FGF，形成包裹有FGF的脂質體磯酸巧米粒，其制備方法為；（1)將表面活性劑、 助表面活性劑和有機溶劑A按照混合，構成油相Η元體系。將氯化巧水溶液（10~250mM)、 磯酸鹽水溶液（10~250mM) W及FGF水溶液（0. 1~0. 5mg/mL)混合，制成水相，將水相緩 慢加入油相充分攬拌，制成油包水的微乳，室溫靜置5~15min產生磯酸巧沉淀，將巧樣酸 鋼溶液巧~50ml)逐滴加入微乳中，攬拌混合均勻，體系又恢復澄清透明。微乳過Ig 60~ 200目的硅膠填充的硅膠柱，用體積比1~5 : 1的己醇/水為洗脫，洗脫液用旋轉蒸發儀 揮干己醇后即得磯酸巧納米粒水溶液。（2)取磯脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機 溶劑B中，于5(TC旋轉蒸發，除去有機溶劑，形成均勻脂質薄膜。加入同溫的蒸傭水室溫賠 育0. 5~化，過0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質體溶液。（3)將（1)、（2)制備所得的溶液按照 0. 1~10 : 1混合即得。
[0040] 5.根據第4項步驟（1)中所述的有機表面活性劑為泊洛沙姆、聚己二醇辛基苯基 離、十二烷基硫酸鋼或聚山梨醇中的一種或幾種；所述的助表面活性劑為正己醇、丙二醇、 丙Η醇、己醇、異丙醇中的一種或幾種；所述的有機溶劑A為環己焼、正己焼、正辛焼中的一 種；所述的磯酸鹽水溶液為磯酸二氨鋼、磯酸氨二鋼、Η聚磯酸鋼中的一種或幾種。所述的 riiFGF為重組人成纖維細胞生長因子，優選自基因工程技術獲得的重組人FGF(rhFGF)。主 要包括酸性成纖維細胞生長因子（rhaFG巧和堿性成纖維細胞生長因子（riibFG巧中的一 種。步驟（2)中所述的有機溶劑B為氯仿、二氯甲焼、己醇中的一種或幾種混合；所述的磯 脂為大豆磯脂、卵磯脂、氨化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、1，2-二油帰氧基3-Η甲 氨基丙焼值0ΤΑΡ)、聚己二醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺值SPE-PEG2000)中的一種或幾 種，優選1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0ΤΑΡ);
[0041] 6.根據第1項所述的組合物，其還可W通過下述制備所得；（1)將氯化巧水溶 液（10~500mM)、FGF水溶液（0. 1~5mg/mL) W及油相混合，作為混合液Α。氯化巧水溶 液：FGF水溶液：油相=0. 05~1 : 0. 05~1 : 10~30。將磯酸溶液（10~50mM，pH = 9. 0)，油相W及磯脂混合，作為混合液B。磯酸鹽水溶液：油相：磯脂=0. 05~1 : 10~ 30 : 0. 05~1。將A、B混合20min，加入10~50血己醇，12000g離必5~30min，己醇洗 2- 3遍后揮干己醇，加1~10血去離子水制成包含FGF的磯酸巧納米粒混懸液。（2)取磯 脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機溶劑B中，于5(TC旋轉蒸發，除去有機溶劑，形成 均勻脂質薄膜。加入同溫的蒸傭水室溫賠育0. 5~化，過0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質體溶 液。做將（1)、似巧[J備所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。
[004引 7.根據第6項步驟（1)中所述的油相為環己焼/壬基酪聚氧己帰離 巧0-80% : 50-20% )。氯化巧水溶液：FGF水溶液：油相=0. 05~1 : 0. 05~1 : 10~ 30。所述的磯酸鹽水溶液為磯酸二氨鋼、磯酸氨二鋼、Η聚磯酸鋼中的一種或幾種。所述 的FGF為成纖維細胞生長因子，優選自基因工程技術獲得的重組人FGF(rhFGF)。主要包括 酸性成纖維細胞生長因子（rhaFG巧和堿性成纖維細胞生長因子（riibFG巧中的一種。步驟 (1)中所述的磯脂為1,2-油醜磯脂酸值0PA)，1,2-二油醜基磯脂醜膽堿值0PC)、二油醜基 磯脂醜己醇胺值0P巧中的一種，優選1,2-油醜磯脂酸值0PA)。步驟（2)中所述的有機溶 劑為氯仿、二氯甲焼、己醇、己離中的一種或幾種混合；所述的磯脂為大豆磯脂、卵磯脂、氨 化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、1,2-二油帰氧基3-H甲氨基丙焼值0TAP)、聚己二 醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺值S陽-PEG2000)中的一種或幾種，優選1,2-二油帰氧基 3- H甲氨基丙焼值0TAP);
[0043] 8.第1-7項中任一項所述的脂質磯酸巧組合物可作為化妝品原料或活性添加成 分，并可進一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑、膏霜劑。
[0044] 9.根據第8項所述的脂質磯酸巧納米粒在其它制劑中的添加量為1~5重量％。
[0045] 10. -種皮膚修護系列化妝品，其包含有效量的1-9項中任一項的包裹細胞生長 因子的脂質磯酸巧納米粒組合物。
[0046] 與現有技術相比，本發明所述的一種包裹FGF的脂質磯酸巧納米粒具有下述優 點：
[0047] 1、細胞生長因子常溫穩定性差，易降解，易失活；生物利用率低、半衰期短、代謝迅 速等特點，在常規劑型應用中存在諸如穩定性差，給藥方式單一、用藥損傷大、生物利用度 低等眾多特點。由于穩定性的限制，市售的FGF主要有凍干制劑和液體制劑，其他劑型較為 少見。磯酸巧W其良好的穩定性目前已被廣泛應用于口腔正崎護理、骨替代物、藥物遞送材 料及血管支架中，而脂質體近年來也同樣被廣泛利用于多膚和蛋白的載體。W脂質包裹磯 酸巧納米粒為載體極大程度地提高FGF的穩定性。
[0048] 2、脂質體與磯酸巧均為緩釋制劑載體，使內含物緩慢釋放，延長內含物作用時間， 在細胞內外持久的發揮作用。減少使用量，提高使用安全性。
[0049] 3、極高的組織相容性，脂質磯酸巧納米粒增加皮膚對FGF的吸收，外層脂質的生 物膜類似結構與皮膚角質層磯脂結構相互作用，改變角質層對藥物的屏障作用，通過吸附、 融合等方式將藥物釋放到皮膚細胞間隙。
【附圖說明】
[0050] 附圖1FGF脂質磯酸巧納米粒制備流程圖。
[0051] 附圖2FGF脂質磯酸巧納米粒制備流程圖。
[0052] 附圖3Bal b/c 3T3細胞增殖實驗倒置顯微鏡下（40X)細胞狀態圖對比。（1)為 aFGF脂質磯酸巧納米粒組；（2)為空白對照組。（1)組比（2)組細胞顯著增加。表明aFGF 在制備成脂質磯酸巧納米粒后仍然保持極高的增值活性。
[0053] 附圖4Bal b/c 3T3細胞增殖實驗細胞增殖情況對比圖。
[0054] 附圖5aFGF脂質磯酸巧納米粒與aFGF原液穩定性比較。（1)為4°C條件下存放時 兩種樣品的活性變化；（2)為25Γ條件下存放時兩種樣品的活性變化；（3)為4(TC條件下 存放時兩種樣品的活性變化。
【具體實施方式】
[0055] 下面參照具體的實施例進一步描述本發明，但是本領域技術人員應該理解，本發 明并不限于送些具體的實施例。
[0056] 本領域技術人員應該理解，如無特別說明，下述實施例中所用的試劑均為市售分 析純級別的試劑。
[0057] 實施例1FGF脂質磯酸巧納米粒的制備（方法一）
[0058] (1)將聚己二醇辛基苯基離燈riton X-l)2. 52mL、正己醇1. 68mL、環己焼2. 8血混 合，構成油相Η元體系7血。將250mM氯化巧水溶液100 μ L，250mM磯酸氨二鋼100 μ L W 及25 μ L0.1 mg/mL的aFGF或bFGF混合，制成水相，將水相緩慢加入油相充分攬拌，制成油 包水的微乳，室溫靜置15min產生磯酸巧沉淀，將125 μ L 15mM的巧樣酸鋼溶液逐滴加入微 乳中，攬拌混合均勻，體系又恢復澄清透明。微乳過Ig 60~200目的硅膠填充的硅膠柱， 用體積比3 : 1的己醇/水為洗脫，洗脫液用旋轉蒸發儀揮干己醇后溶于5mL的蒸傭水中。
[0059] 似取D0TAP (購自西安瑞樓生物科技有限公司）與膽固醇按質量比4 : 1的比例 混合，溶于無水己醇5mL中，于5(TC旋轉蒸發，除去有機溶劑，形成均勻脂質薄膜。加入同溫 的5mL蒸傭水水合化，過0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質體溶液。
[0060] 做將（1)、似巧[J備所得的溶液按照1 : 1的體積混合即得aFGF或bFGF脂質磯 酸巧納米粒。
[0061] 實施例2FGF脂質磯酸巧納米粒的制備（方法二）
[0062] (1)取 300 μ L 500mM 的氯化巧水溶液，100 μ L 2mg/mL aFGF 或 bFGF 溶液，15血環 己焼/壬基酪聚氧己帰離（71 : 29)混合作為溶液A。將300 μ L25mM磯酸氨二鋼溶液（pH =9. 0),15血環己焼/壬基酪聚氧己帰離（71 : 29)混合后加入200uL，20mg/血D0PA(購 自西安瑞樓生物科技有限公司）攬拌均勻作為溶液B。將溶液A和溶液B混合20min，加入 30血己醇，12000g離必15min，己醇洗2~3遍后揮干己醇，用1血去離子水溶解。即得包 含FGF的磯酸巧納米粒混懸液。
[006引 似取D0TAP與膽固醇（均購自西安瑞樓生物科技有限公司）按質量比4 : 1的 比例混合，溶于無水己醇中，于5(TC旋轉蒸發，除去有機溶劑，形成均勻脂質薄膜。加入 同溫的5mL蒸傭水水合化，過0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質體溶液。
[0064] (3)將500 μ L磯酸巧納米粒（Ca巧加入50 μ L脂質體溶液，混合均勻即得。
[0065] 實施例3aFGF脂質磯酸巧納米粒凝膠劑的制備
[0066] 按照實施例1制備包含aFGF的脂質磯酸巧納米粒凍干粉備用，并按照下述方法制 備凝膠劑：
[0067] 各組分的質量百分比如下（質量％ ):
[0068]
[0069]
[0070] 將aFGF脂質磯酸巧納米粒凍干粉lOg用蒸傭水溶解備用，加入卡波姆Ig、甘油 8邑、山梨酸鐘0. 1 Ig，攬拌溶解，加入Η己醇胺2g調節抑值到6-7,加入蒸傭水至全量，攬拌 均勻，制成凝膠lOOg，即得到包含aFGF的脂質磯酸巧納米粒凝膠劑。
[0071] 該凝膠劑同樣具有良好的創面修復作用，由于凝膠的膠黏特性，作用時間更持久， 保濕效果更好，并能有效的隔絕作用部位與空氣的接觸，避免傷口的感染發炎，并降低過敏 的發生率。使用方便，清洗簡單。
[0072] 實施例4皮膚修復乳液
[0073] 組成乳液的產品的組分及百分數含量為：
[0074]
[00巧]制備方法：
[0076] (1)將A組加熱到8(TC后攬拌5min溶解均勻，靜置冷卻至4(TC。
[0077] (2)按照實施例1所述方法制備aFGF脂質磯酸巧納米粒。將事先混合溶解的B組 分加入上述A組分的混合溶液攬拌均勻。
[0078] (3)將C組分的加入上述兩組分的混合溶液，攬拌均勻即得。
[0079] 實施例5皮膚修復霜
[0080] 組成霜的產品的組分及百分數含量為：
[0081]
[0082] 制備方法：
[008引 （1)將A組加熱到8(TC后攬拌5min溶解均勻，靜置冷卻至4(TC。
[0084] (2)將C組分用適量去離子水溶解備用，將C組分加入A組分中，攬拌3min使其均 勻。
[0085] (3)按照實施例1所述方法制備aFGF脂質磯酸巧納米粒。將事先混合溶解的B組 分加入上述兩組分的混合溶液攬拌均勻即得。
[0086] 實施例6aFGF脂質磯酸巧納米粒促進3T3細胞增殖作用
[0087] 將處于對數生長期的3T3細胞（3T3細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中必） 用含10% FBS(FBS購自杭州四季青生物工程材料有限公司）的DMEM培養基（DMEM培養基 購自美國Gibco公司）常規培養至80%~90%匯合，用0. 25%膜酶消化，W 0. 5X 105個/ ml的細胞數目接種于96孔板，培養2地后，換無血清DMEM培養基培養，24h后將培養基吸出 后分別加入濃度為50、25、12. 5、6. 25、3. 125 μ g/mL的實施例1制備的包裹aFGF脂質磯酸 巧納米粒、aFGF原液W及空白的脂質磯酸巧納米粒（不含aFGF)，每個濃度設3個復孔，空 白組為六個復孔。給藥后放入培養箱繼續培養2地，加入10 μ 1喔哇藍（MTT) (0. 5mg/ml)， 培養箱中賠育地后，吸出孔中溶液并加入150 μ 1 DMS0,振蕩后于570皿波長下檢測吸光度 0D值。結果見圖3和圖4。
[0088] 圖3結果顯示與空白脂質磯酸巧納米粒對照組比較，aFGF脂質磯酸巧納米粒具有 顯著的促細胞增殖作用。圖4結果顯示aFGF脂質磯酸巧納米粒與aFGF細胞原液同樣具有 顯著的細胞增殖效果，且具有良好的濃度依賴性，表明w脂質磯酸巧納米粒為載體包裹的 FGF仍然保持著良好的細胞增殖活性。
[0089] 實施例7包裹重組人細胞生長因子的脂質磯酸巧納米粒穩定性考察
[0090] 分別將上述3批aFGF脂質磯酸巧納米粒化CP-aFG巧和aFGF水溶液于溫度4°C、 25°C和4(TC的條件下密閉放置。于放置后0、1、3、5、10、30、60、90天分別檢測兩者活性。結 果見圖5。
[0091] 圖5中（1)為4°C條件下存放時兩種樣品的活性變化；（2)為25°C條件下存放時 兩種樣品的活性變化；（3)為4(TC條件下存放時兩種樣品的活性變化。實驗結果顯示4Γ、 25°C和4(TC的條件下的aFGF脂質磯酸巧納米粒組比aFGF原液組降解速度顯著降低。表明 脂質磯酸巧納米粒作為載體具有顯著提高內含物細胞生長因子的穩定性，使活性成分在常 溫使用條件下仍能保持較高活性，便于長期儲存，延長產品有效期。
[0092] 應該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經對本發明進行具體地顯示和描述， 但是本領域的普通技術人員應該理解，在不背離由后附的權利要求所定義的本發明的精神 和范圍的條件下，可W在其中進行各種形式和細節的變化，可W進行各種實施方案的任意 組合。
【主權項】
1. 一種以脂質磷酸鈣納米粒為核心的組合物，其包含1~50重量％的脂質體，1~50 重量％磷酸鈣，0. 0001~1重量％的細胞生長因子FGF。2. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述脂質磷酸鈣納米粒的粒徑為50nm~ 200nm〇3. 根據權利要求1所述的組合物，其中FGF為通過基因工程技術獲得的重組人FGF，主 要為重組人酸性成纖維細胞生長因子（rhaFGF)和重組人堿性細胞生長因子（rhbFGF)。4. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述脂質體磷酸鈣以納米粒形式存在，所述納 米粒負載有FGF，形成包裹有FGF的脂質體磷酸鈣米粒，其制備方法為：（1)將表面活性劑、 助表面活性劑和有機溶劑A按照混合，構成油相三元體系。表面活性劑：助表面活性劑： 有機溶劑A=I~5 : 1~5 : 1~5。將氯化鈣水溶液（10~250mM)、磷酸鹽水溶液 (10~250mM)以及FGF水溶液（0. 1~0. 5mg/mL)混合，制成水相，氯化鈣水溶液：磷酸鹽 水溶液：FGF水溶液=10~200 : 10~200 : 10~50。將水相緩慢加入油相充分攪拌， 制成油包水的微乳，室溫靜置5~15min產生磷酸鈣沉淀，將檸檬酸鈉溶液（5~50mM)逐滴 加入微乳中，攪拌混合均勻，體系又恢復澄清透明。微乳過Ig 60~200目的硅膠填充的硅 膠柱，用體積比1~5 : 1的乙醇/水為洗脫，洗脫液用旋轉蒸發儀揮干乙醇后即得磷酸鈣 納米粒水溶液。（2)取磷脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機溶劑B中，于50°C旋轉蒸 發，除去有機溶劑，形成均勻脂質薄膜。加入同溫的蒸餾水室溫孵育0. 5~3h，過0. 22 μ m 微孔濾膜，得到脂質體溶液。（3)將（1)、（2)制備所得的溶液按照0.1~10 : 1混合即得。5. 根據權利要求4,步驟（1)中所述的有機表面活性劑為泊洛沙姆、聚乙二醇辛基苯基 醚、十二烷基硫酸鈉或聚山梨醇中的一種或幾種；所述的助表面活性劑為正己醇、丙二醇、 丙三醇、乙醇、異丙醇中的一種或幾種；所述的有機溶劑A為環己烷、正己烷、正辛烷中的一 種；所述的磷酸鹽水溶液為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三聚磷酸鈉中的一種或幾種。所述的 rhFGF為重組人成纖維細胞生長因子，優選自基因工程技術獲得的重組人FGF (rhFGF)。主 要包括酸性成纖維細胞生長因子（rhaFGF)和堿性成纖維細胞生長因子（rhbFGF)中的一 種。步驟（2)中所述的有機溶劑B為氯仿、二氯甲烷、乙醇中的一種或幾種混合；所述的磷 脂為大豆磷脂、卵磷脂、氫化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)、1，2-二油烯氧基3-三甲 氨基丙烷（D0TAP)、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG2000)中的一種或幾 種，優選1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷（DOTAP)。6. 根據權利要求1所述的組合物，其還可以通過下述制備所得：（1)將氯化鈣水溶 液（10~500mM)、FGF水溶液（0. 1~5mg/mL)以及油相混合，作為混合液A。氯化鈣水溶 液：FGF水溶液：油相=0· 05~I : 0· 05~I : 10~30。將磷酸溶液（10~50mM，pH = 9.0)，油相以及磷脂混合，作為混合液B。磷酸鹽水溶液：油相：磷脂=0.05~I : 10~ 30 : 0.05~1。將A、B混合20min，加入10~50mL乙醇，12000g離心5~30min，乙醇洗 2-3遍后揮干乙醇，加1~IOmL去離子水制成包含FGF的磷酸鈣納米粒混懸液。（2)取磷 脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機溶劑B中，于50°C旋轉蒸發，除去有機溶劑，形成 均勻脂質薄膜。加入同溫的蒸餾水室溫孵育〇. 5~3h，過0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質體溶 液。⑶將（1)、（2)制備所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。7. 根據權利要求6,步驟（1)中所述的油相為環己烷/壬基酚聚氧乙烯醚 (50-80% : 50-20% )。氯化鈣水溶液：FGF水溶液：油相=0· 05~I : 0· 05~I : 10~ 30。所述的磷酸鹽水溶液為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三聚磷酸鈉中的一種或幾種。所述 的FGF為成纖維細胞生長因子，優選自基因工程技術獲得的重組人FGF (rhFGF)。主要包括 酸性成纖維細胞生長因子（rhaFGF)和堿性成纖維細胞生長因子（rhbFGF)中的一種。步驟 (1)中所述的磷脂為1，2-油酰磷脂酸（DOPA)，1，2-二油酰基磷脂酰膽堿（DOPC)、二油酰基 磷脂酰乙醇胺（DOPE)中的一種，優選1，2_油酰磷脂酸（DOPA)。步驟（2)中所述的有機溶 劑為氯仿、二氯甲烷、乙醇、乙醚中的一種或幾種混合；所述的磷脂為大豆磷脂、卵磷脂、氫 化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)、1，2_二油烯氧基3-三甲氨基丙烷（DOTAP)、聚乙二 醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG2000)中的一種或幾種，優選1，2_二油烯氧基 3_三甲氨基丙烷（DOTAP)。8. 權利要求1-7中任一項所述的脂質磷酸鈣組合物可作為化妝品原料或活性添加成 分，并可進一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑、膏霜劑。9. 根據權利要求8,所述的FGF脂質磷酸鈣納米粒在其它制劑中的添加量為1~5重 量％。10. -種皮膚修護系列化妝品，其包含有效量的權利要求1-9中任一項的包裹細胞生 長因子的脂質磷酸鈣納米粒組合物。
【文檔編號】A61Q19/00GK105878047SQ201410815272
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月23日
【發明人】黃亞東, 項琪, 貝煜, 鄭青, 肖巧學
【申請人】廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中心, 廣州市暨鵬生物科技有限公司