通過調節微RNAmiR-130a和miR-130b治療與PGC1-α相關的疾病的制作方法

通過調節微RNA miR-130a和miR-130b治療與PGC1-α相關的疾病的制作方法
【專利摘要】本發明涉及調節PGC1α和/或PGC1β或治療與PGC1α和/或PGC1β相關的疾病的方法，其使用miR?130a RNA、miR?130b RNA或其組合，或使用可呈微RNA海綿或鎖核酸LNA形式的miR?130a的拮抗miR、miR?130b的拮抗miR或兩者。
【專利說明】通過調節微RNA m i R-130a和mi R-130b治療與PGC1 -a相關的 疾病
[0001 ] 相關申請
[0002] 本申請案依據35U.S.C.§119(e)要求2013年9月20日提出的美國臨時專利申請案 第61/880,508號的優先權，所述臨時專利申請案以全文引用的方式并入本文中。
【背景技術】
[0003] 人類過氧化物酶體增殖劑活化的受體y共活化劑l-a(PGC-la)為由PPARGC1A基因 編碼的蛋白質。PGC-la為調節與能量代謝有關的基因的轉錄共活化劑。其還調節線粒體生 物合成和功能。除肝葡糖新生外（尹等人，自然413 :131-138;2001(￥〇〇]1，6丨31.他1：1^6413: 131-138; 2001 ))，已知PGCla參與棕色脂肪適應性產熱(普索維等人，細胞92:829-839; 1998 (卩1^886"6^6丨&1.〇611 92:829-839;1998))、線粒體生體合成和呼吸（霍騰等人，細胞 119: 5-7 ; 2004(Houten，et al. Cell 119: 5-7; 2004))和神經變性病（圣-皮爾等人，細胞 127:397-408;2006(St-Pierre，et al.，Cell 127:397-408;2006))。
[0004]微RNA(miRNA)在分化和發育中起著重要的調節作用（阿姆博斯，遺傳學與發育新 見21:511-517,2011(Ambros，Curr Opin GenetDev 21:511-517,2011))。近來，微RNA已經 顯現為代謝的一種重要轉錄后調節因子(羅替爾等人，自然評論:分子細胞生物學13:239_ 250 2012(Rottiers,et al.Nat Rev Mol Cell Biol 13:239-250 2012))〇

【發明內容】

[0005] 本公開是基于miR-130a通過直接靶向其mRNA的：y UTR下調PGCla、PGC10和PPARy 的意外發現。
[0006] 因此，本公開的一個方面提供一種調節PGCla或PGC10的方法，所述方法包含使細 胞接觸有效量的以下各物：（a)miR-130a RNA、miR-130b RNA或其組合;或(b)miR-130a RNA 的拮抗miR、miR-130b RNA的拮抗miR或其組合。在一些實例中，細胞與有效下調PGCla或 PGC10的量的miR-130a、miR-130b或其組合接觸。在其它實例中，細胞與有效上調PGCla或 PGC10的量的miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或其組合接觸。miR-130a的拮抗miR、 miR-130b的拮抗miR或兩者可為微RNA海綿或鎖核酸(LNA)。
[0007] 在任一本文所述的方法中，miR-130a RNA、miR-130b RNA中的一或多者為雙螺旋 RNA分子或單股RNA分子。miR-130a的拮抗miR和miR-130b的拮抗miR可為雙螺旋RNA分子或 呈微RNA海綿或LNA形式。在一些實施例中，拮抗miR中的一或多者可為微RNA海綿或LNA。 miR-130a RNA、miR-130b RNA或兩者可包含AGUGCAA的核苷酸序列。舉例來說，miR-130a RNA可包含CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU的核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)。在另一個實例中，miR-130b RNA可包含CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU的核苷酸序列（SEQ ID N0:2)。
[0008] 在任一本文所述的方法中，有效量的miR-130a RNA、miR-130b RNA或其拮抗miR可 投與有需要的個體以治療與PGCla或PGC1P相關的疾病。任選地，疾病不與PPARy相關。
[0009] 在一些實例中，個體為患有或懷疑患有糖尿病或脂肪變性的人類患者。可投與個 體有效量的miR-130a、miR-130b或兩者以治療所述疾病。
[0010]在其它實例中，個體為患有或懷疑患有例如肌肉功能障礙、心力衰竭或神經退化 性疾病（例如帕金森氏病(Parkinson disease)、亨廷頓氏病(Hungtinton disease)或阿爾 茨海默病(Alzheimer disease)等與反應性氧物質(R0S)相關的疾病的人類患者。或者，個 體可為患有或懷疑患有糖尿病或發炎的人類患者。可投與此類患者有效量的miR-130a的拮 抗miR、miR-130b的拮抗miR或其組合以治療所述疾病。
[0011]以下各物也在本公開的范圍內：（a)用于治療與PGCla和/或PGC1P相關并且可不與 PPARy相關的疾病的醫藥組合物，所述組合物包含醫藥學上可接受的載劑和miR-130a RNA、miR-130b RNA中的一或多者或如本文所述的那些miRNA的拮抗miR中的一或多者；以及 (b)任一醫藥組合物或微RNA分子的用途，其用于制造供治療任一目標疾病的藥劑，所述疾 病包括(但不限于)糖尿病、脂肪變性、與反應性氧物質(R0S)相關的疾病(例如肌肉功能障 礙、心力衰竭或神經退化性疾病(例如帕金森氏病、亨廷頓氏病或阿爾茨海默病））和發炎。
[0012] 在下文描述中闡述本發明的一或多個實施例的細節。本發明的其它特征或優點自 以下圖式和若干實施例的詳細描述以及所附權利要求書將顯而易見。
【附圖說明】
[0013] 圖1.在用miR-130a表達載體穩定轉染的HepG2細胞系中，通過RNA印跡分析，檢測 miR_130a的表達。
[0014] 圖2.通過RNA印跡分析測量穩定的表達miR-130a的細胞系中PGCla和PPARymRNA 的同時減少。
[0015]圖3.蛋白質印跡分析檢測穩定的表達miR_130a的細胞中PGCla、PPARy和脂肪細 胞因子蛋白質的減少。
[0016] 圖4為如通過RT-qPCR分析測量，展示穩定的表達miR_130a的HepG2細胞系中PGCla 和PPAR y mRNA的減少的圖（上圖）。通過蛋白質印跡分析，SP1、PPARa t、CEBPb和HNF4的蛋白 質水平無明顯差異(下圖）。
[0017]圖5.還通過ELISA檢測分泌的脂肪細胞因子的減少。
[0018] 圖6.HepG2細胞經LNA-miR_130a或LNA加擾對照轉染。分別通過實時RT-qPCR(上 圖）和蛋白質印跡分析(下圖），LNA-miR-130a處理增加PGClamRNA和蛋白質。
[0019] 圖7.轉基因小鼠顯示在肝中？6(：1€^￡?0(、66?&86、？?41?丫和脂肪細胞因子蛋白質 的表達增加(左圖）和在血清中脂肪細胞因子的表達增加(右圖）。
[0020]圖8.PGCla和PPARy表達載體的共轉染對脂肪細胞因子分泌產生高度有效的協同 效應。
[0021 ]圖9 ?為展示在PGCla (匪_〇13261)和PPAR y (NM_005037)的3' UTR而非SP1 (匪_ 003109)的31TR的報導體共轉染分析中MiR-130a顯著降低熒光素酶活性的圖。
[0022] 圖10.通過補償性突變誘發，MiR_130a展示直接靶向PGCla的3' UTR。（*p<0.05)。 在序列比對中突變位點帶下劃線。hsa-miR-130a WT:SEQ ID NOdAsa-PGClc^UTR WT: SEQ ID N0:68;hsa-miR-130a種子序列突變體：SEQ ID N0:69;以及hsa-PGClc^UTR標靶位 點突變體：SEQ ID NO:70。
[0023]圖11.為展示PGC1Q31TR熒光素酶報導體與遞增量的miR-130a共轉染以劑量反應 方式降低報導體活性的圖（上圖）。相反，用遞增量的LNA-miR-130a質粒處理以劑量反應方 式增加報導體活性(下圖）。
[0024] 圖12.此圖強調葡萄糖代謝中的關鍵酶。通過RNA印跡分析，G6Pase和PEPCK的mRNA 表達在穩定的表達miR-130a的HepG2細胞中減少。
[0025]圖13.通過蛋白質印跡分析也檢測到PEPCK和G6Pase的蛋白質表達減少。注意穩定 的表達miR-130a的HepG2細胞中葡糖激酶(GCK)的水平增加，并且穩定的表達miR-130a的 Huh7細胞中丙酮酸激酶(PKLR)的水平增加。
[0026] 圖14.通過RT-qPCR分析，穩定的表達miR_130a的細胞中PKLR和GCK特異性mRNA的 水平增加。
[0027] 圖15 ?通過蛋白質印跡分析，在產生HBV的HepG2細胞(UP7-4和UP7-7)中PGCla和葡 萄糖異生酶PEPCK和G6Pase的蛋白質表達增加。但是，注意到PPARy無顯著改變。
[0028]圖16.HepG2細胞中PPARy的穩定表達減少葡萄糖輸出，并且相反，PGCla的表達刺 激葡萄糖產生。
[0029] 圖17.穩定的HBV復制和PPARy拮抗劑GW9662(20yM)可增加HepG2細胞中葡萄糖產 生。
[0030] 圖18.在兩種穩定的表達PGCla的細胞系中miR-130a的表達不受影響。
[0031] 圖19.此圖概括PGCla、miR-130a和HBV之間的關系。+/_:既非正面也非陰性負面作 用。
[0032] 圖20.上圖：在表達PPARy的HepG2細胞系中，使用莖環qPCR，觀測到miR_130a的減 少。U6snRNA用作內部對照。羅格列酮而非GW9662進一步減少miR-130a的表達。下圖：通過蛋 白質印跡，檢測到穩定的表達PPAR y的HepG2細胞系中PPAR y蛋白質的量增加。
[0033] 圖21 ?此三元草圖概括PPARy、PGCla、miR-130a和HBV之間的關系。HBV和PGCla和 PPARy中前饋擴增回路可通過miR-130a中間物介導。
[0034] 圖22為展示治療策略的示意性說明。
【具體實施方式】
[0035] 本公開是基于miR-130a通過直接靶向其信使RNA的3'UTR下調PGCla、PGC10和PPAR y的意外發現。因而，miR-130微RNA(例如miR-130a和miR-130b)以及其詰抗miR可用于調節 這些蛋白質并因此有效治療與這些蛋白質中的一或多者相關的疾病(例如與R0S相關的疾 病或與線粒體功能障礙相關的疾病）。并且，miR_130a對PGCla(葡糖新生)和PPARy (抑制葡 糖新生)的同時作用可有助于葡萄糖穩態。
[0036] miR-130a RNA、miR-130b RNA或其拮抗miR可用于調節對應微RNA的活性并因此調 節其標靶基因的表達。調節微RNA意謂在微RNA的標靶基因表達中影響微RNA的生物功能的 任何方法。在一些實例中，調節微RNA為調節微RNA的細胞水平。在其它實例中，調節微RNA為 調節(例如增強或阻斷)其與微RNA標靶(例如mRNA或基因）的相互作用。
[0037]因此，本文描述用于與PGClcuPGClP或兩者相關或治療與所述蛋白質中的一或多 者相關的疾病的方法，其使用miR-130a RNA、miR-130b RNA或兩者或miR-130a或miR-130b 的拮抗miR;以及用于本文所述的治療和用于制造達成那些目的的藥劑的醫藥組合物。miR-130b含有與miR-130a相同的AGUGCAA序列用于與標靶基因進行堿基配對。
[0038] 微RNA分子
[0039] 微RNA為在許多物種中發現的小的非編碼RNA分子(例如22個核苷酸），其調芐基因 表達。miR-130a和miR-130b在許多物種中，例如人類中發現。例示性miR-130a和miR-130b (前驅物和成熟）的核苷酸序列可見于MiRBase的寄存編號M10000448(人類miR-130a)和 MI0000748(人類miR-130b)。這些miRNA分子的示例性核苷酸序列提供于下文中：
[0046] 如本文所述的miR-130a RNA為具有與野生型miR-130a，例如人類miR-130a相同的 生物活性，例如調節PGC1 a、PGC1P和/或PPAR y的表達的寡核苷酸(例如RNA分子）。此類寡核 苷酸可包含miR-130a的核苷酸序列或其一部分(例如AGUGCAA或CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU (SEQ ID NOiDhmiR-lSOa RNA可包括至多 150個（例如 100、80、60、50、40、30個或更少個） 核苷酸殘基。在一些實例中，miR-130a可為雙螺旋RNA分子。在其它實例中，其可為發夾分 子，所述發夾分子可包括21-23有義序列（例如CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ ID N0:1))、 短連接子、與有義序列互補的反義序列和polyT尾。
[0047] 如本文所述的miR-130b RNA為具有與野生型miR-130b，例如人類miR-130b相同的 生物活性的寡核苷酸，例如RNA分子。因為miR-130b與miR-130a共享相同的序列用于與標靶 基因進行堿基配對，所以miR-130b將具有與miR-130a相同的生物功能，例如調節PGCla、 PGC1I3和/或PPARy的表達。此類寡核苷酸可包含miR-130b的核苷酸序列或其一部分(例如 AGUGCAA或CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU(SEQ ID 勵：2))。砧1?-13(^ RNA可包括至多 150個（例 如100、80、60、50、40、30個或更少個)核苷酸殘基。在一些實例中，1^1?-13013可為雙螺旋1?祖 分子。在其它實例中，其可為發夾分子，所述發夾分子可包括21-23有義序列（例如 CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU(SEQ ID N0:2))、短連接子、與有義序列互補的反義序列和po 1 yT 尾。
[0048] 11111?-13〇3或11111?-13013的詰抗11111?可為能夠例如經由阻斷標革巴11111?祖與標革巴1111?祖分 子的結合遏制細胞中標靶(例如內源性)miR-130a或miR-130b的活性的工程化寡核苷酸。拮 抗miR可為完全或部分與標祀miRNA或其一部分互補，例如在Ag〇2的裂解位點具有任一錯配 的小的合成寡核苷酸。其還可以包括一些修飾以抑制Ago裂解。在一些實例中，拮抗miR可包 括至多150個(例如100、80、60、50、40、30個或更少）核苷酸殘基。在一些實例中，拮抗1^1?可 為微RNA海綿，其可為從強啟動子表達并且含有多個與相關微RNA的串聯結合位點的轉錄 物。當編碼這些海綿的載體短暫轉染到培養的細胞時，海綿將至少與化學修飾的反義寡核 苷酸同等強烈地遏制微RNA標靶。其特異性地抑制具有互補七聚種子的微RNA，使得單一海 綿可用于阻斷整個微RNA種子家族。RNA聚合酶II啟動子(Pol II)驅動的海綿含有用于鑒別 和分選經海綿處理的細胞的熒光報導基因。此類微RNA海綿的穩定表達可用于疾病治療中。 埃伯特等人，自然方法? 2007年9月；4(9): 721-6 ?電子版2007年8月12日（Ebert et al ?，Nat Methods.2007Sep；4(9)：721-6.Epub 2007Aug 12)〇
[0049] 必要時，微RNA分子或其拮抗miR可包括非天然存在的核堿基、糖或共價核苷間鍵 (主鏈）。此類經修飾的寡核苷酸賦予所希望的特性，例如增強的細胞吸收、提高的對標靶核 酸的親和力和增加的體內穩定性。
[0050] 在一個實例中，本文所述的寡核苷酸/RNA分子具有經修飾的主鏈，包括保留磷原 子的主鏈（參見例如美國專利第3,687,808號；第4,469,863號；第5,321，131號；第5,399， 676號；和第5,625,050號）和不具有磷原子的主鏈(參見例如美國專利第5,034,506號、第5， 166,315號和第5,792,608號）。含磷的經修飾的主鏈的實例包括(但不限于)硫代磷酸酯、手 性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯（包 括3'-亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯）、亞膦酸酯、氨基磷酸酯（包括3'-氨 基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯）、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸 三酯、硒代磷酸酯和具有3Z-5'鍵或2Z-5'鍵的硼烷磷酸酯。此類主鏈還包括具有反向極性 的主鏈，即3'至3'、5'至5'或2'至2'鍵。不包括磷原子的經修飾的主鏈通過短鏈烷基或環烷 基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵 形成。此類主鏈包括具有嗎啉基鍵(部分由核苷的糖部分形成）的主鏈;硅氧烷主鏈;硫醚、 亞砜和砜主鏈；甲乙酰基和硫代甲乙酰基主鏈;亞甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主鏈;核糖 乙酰基主鏈;含有烯烴的主鏈;氨基磺酸酯主鏈;亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈;磺酸酯 和磺酰胺主鏈;酰胺主鏈；以及其它具有混合N、0、S和CH 2組成部分的主鏈。
[0051 ]在另一個實例中，本文所述的微RNA分子或拮抗miR分子包括一或多個經取代的糖 部分。此類經取代的糖部分可在其位包括以下基團中的一者:OH; F; 0-烷基、S-烷基、N-烷 基、0-烯基、S-烯基、N-烯基;0-炔基、S-炔基、N-炔基和0-烷基-0-烷基。在這些基團中，烷 基、烯基和炔基可為經取代或未經取代的CdljC 1Q烷基或(：2到&〇烯基和炔基。其還可以在其 2'位包括雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷氨基、聚烷基氨基、經取代的硅烷基、RNA裂解基團、 報導基團、嵌入劑、用于提高寡核苷酸的藥物動力學特性的基團或用于提高寡核苷酸的藥 效學特性的基團。優選的經取代的糖部分包括具有2'-甲氧基乙氧基、2'-二甲基氨基氧基 乙氧基和二甲基氨基乙氧基乙氧基的那些糖部分。參見馬丁等人，瑞士化學學報，1995， 78,486-504(Martin et al.，Helv.Chim.Acta，1995,78,486_504)。
[0052]在又一實例中，本文所述的微RNA分子或拮抗miR包括一或多個經修飾的天然核堿 基（即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）。經修飾的核堿基包括以下中所述的核 堿基:美國專利第3，687，808號；高分子科學與工程科學的簡明百科全書，第858-859頁，克 羅維茲編輯，約翰?威利父子公司，1990(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering?pages 858-859，Kroschwitz，J?I?，ed?JohnWiley&Sons， 1990);英格利希等人，應用化學國際版，1991，30,613(Englisch et al ?，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613);和桑維，第15章，反義研究和應用，第289-302頁，CRC出版社，1993 ( Sanghvi，Y ? S ?，Chapter 15, Antisense Research and Applications，pages 289-302，CRC Press，1993) D這些核堿基中的某些尤其適用于增加微 RNA分子對其靶向位點的結合親和力。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6 取代的嘌呤(例如2-氨基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶）。參見桑維等人 編，反義研究和應用，CRC出版社，波卡拉頓，1993,第276-278頁
[0053] 在一些實例中，任一拮抗miR分子為鎖核酸（LNAhLNA為含有至少一種經修飾的 RNA核苷酸的經修飾的RNA分子，其中核糖部分經連接氧和V碳的額外橋修飾以便將核糖 牢牢鎖在3'內。參見例如詹森等人，新英格蘭醫學雜志368(18): 1685-94(2013)(Janssen et al.，NEngl J Med.368(18):1685-94(2013));蘭福德等人，科學327(5962):198-201 (2010)(Lanford et al.，Science 327(5962):198-201(2010));希爾德布蘭特-埃里克森 等人，核酸治療學22(3):152-61(2013)(Hildebrandt-Eriksen et al.，Nucleic Acid Ther.22(3):152-61(2013));以及奧羅姆等人，基因 372:137-41(2006)(〇rom et al.， Gene. 372:137-41 (2006))。在一些實施例中，如本文所述的LNA為針對miR-130a或miR-130b 的經修飾的DNA硫代磷酸酯反義寡核苷酸。
[0054]任一本文所述的微RNA和拮抗miR可通過常規方法，例如化學合成或體外轉錄制 備。如本文所述的其所期望生物活性可通過常規方法，例如以下實例中所述的方法檢驗。
[0055] miR-130或其拮抗miR調節PGCla或PGClg的用途
[0056] 單獨或組合的miR-130a RNA、miR-130b RNA或如本文所述的miR-130a或miR-130b 的拮抗miR可用于調節PGCla和/或PGC1P并治療與所述蛋白質中的一者或兩者相關的疾病。 舉例來說，miR-130a和/或miR-130b可用于下調PGCla和/或PGC10，因而有效治療其中需要 PGCla和/或PGC10下調的疾病。或者，miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或兩者可用 于上調PGCla和/或PGC10，因而有效治療其中需要PGCla和/或PGC10上調的疾病。PGCla可充 當反應性氧物質(R0S)的解毒酶(圣皮爾等人，（2006)細胞127:第397-408頁（St Pierre et &1.，（2006)0611127$&86 397-408))。如3引起大量人類疾病，例如癌癥、神經退化性疾病 (帕金森氏病或亨廷頓氏病）、心力衰竭、肌肉功能障礙。因此，miR-130a或miR-130b的拮抗 miR可用于治療此類疾病。此類疾病的實例和其與PGCla的相關展示圖23中。
[0057]如本文所用，術語"治療"是指向患有與PGCla、PGC1P或兩者相關的疾病、具有所述 疾病的癥狀或具有患所述疾病的傾向性的個體施用或投與包括一或多種活性劑的組合物 以治愈、醫治、緩解、解除、改變、補救、減輕、改善或影響所述疾病、所述疾病的癥狀或患有 所述疾病的傾向性。
[0058] 為進行本文所述的方法，有效量的miR-130a RNA、miR-130b RNA或兩者或有效量 的miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或兩者可接觸其中需要PGCla和/或PGClfH周節 的細胞。在一些實施例中，所述方法可在體外，例如在培養的細胞中進行。
[0059] 在其它實施例中，有效量的一或多種如本文所述的微RNA分子或拮抗miR可經由適 合的途徑投與需要治療的個體。此類個體可為患有、懷疑患有與PGCla、PGC10或兩者失調相 關的疾病或處于其風險下的人類患者。在一些實施例中，疾病不與PPARy相關。一或多種微 RNA分子或拮抗miR可直接或間接(例如使用裸寡核苷酸或使用適于表達微RNA分子或拮抗 miR的表達載體)投與需要治療的個體。此類表達載體可通過將微RNA的一或多種核苷酸序 列或一或多種詰抗miR插入適合的表達載體中來構筑，在表達載體中微RNA序列與適合的啟 動子可操作連接。
[0060] miR-130a RNA和miR-130b RNA中的一或多者或miR-130a RNA和miR-130b RNA的 拮抗miR中的一或多者或適合于表達其的一或多種表達載體可與醫藥學上可接受的載劑混 合以形成醫藥組合物。"可接受的載劑"為與組合物的活性成分相容(并且優選使活性成分 穩定)并且對待治療的個體無害的載劑。適合的載劑包括(但不限于）(a)用陽離子(例如鈉、 鉀、銨、鎂、鈣)和多元胺(例如精胺和亞精胺)形成的鹽；（b)用無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、硫 酸、磷酸、硝酸)形成的酸加成鹽；（C)用有機酸(例如乙酸、乙二酸、酒石酸、丁二酸、順丁烯 二酸、反丁烯二酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、丹寧酸、棕櫚酸、褐藻酸、聚 谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸)形成的鹽；以及(d)由元素 陰離子(例如氯、溴和碘)形成的鹽。其它適合的載劑包括微晶纖維素、甘露糖醇、葡萄糖、脫 脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉和其組合。參見例如雷明頓的藥物科學，第18版，馬克出版公 司，伊斯頓，賓夕法尼亞州（lggsKRemingtor/s Pharmaceutical Sciences，Edition 18， Mack Publishing Co.，Easton，Pa(1995));以及古德曼和吉爾曼的"治療學的藥理學基 礎"，第十版，吉爾曼，哈得曼和利姆伯德編，麥格勞-希爾出版社，155-173,2001 (Goodman and Gilman7s"The Pharmacological Basis of Therapeutics，>,Tenth Edition,Gilman, J.Hardman and L.Limbird,eds.,McGraw-Hill Press，155-173,2001)〇 [0061]為促進傳遞，微RNA分子、拮抗miR或其表達載體可與伴侶試劑結合。如本文所用， "結合"意謂兩種實體相關聯，優選親和力足夠實現兩種實體之間的關聯的治療效益。結合 包括共價或非共價鍵結以及關聯的其它形式，例如一個實體陷于另一實體上或內，或任一 或兩個實體陷在第三個實體(例如膠束)上或內。
[0062] 伴侶試劑可為天然存在的物質，例如蛋白質(例如人類血清白蛋白、低密度脂蛋白 或球蛋白）、碳水化合物(例如聚葡萄糖、普魯蘭、甲殼素、聚葡萄胺糖、菊塘、環糊精或玻尿 酸)或脂質。其也可以為重組或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的 實例包括聚賴氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-順丁烯二酸酐共聚物、聚(L-丙交酯_共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-順丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基）甲基丙烯酰 胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸）、N-異 丙基丙烯酰胺聚合物和聚磷嗪。
[0063] 在一個實例中，伴侶試劑為膠束、脂質粒、納米粒子或微球體，其中囊封微RNA分子 或表達載體。用于制備此類膠束、脂質粒、納米粒子或微球體的方法是本領域中眾所周知 的。參見例如美國專利第5，108,921號、第5,354,844號、第5,416,016號和第5,527,5285號。
[0064] 在另一個實例中，伴侶試劑充當附接融合劑或縮合劑中一或多者的基質。
[0065] 融合劑對局部pH值起反應。舉例來說，在遇到內體內的pH值時，其可引起其緊靠環 境的物理改變，例如滲透特性改變，此破壞或增加內體膜滲透性，從而促進本文所述的微 RNA釋放到宿主細胞的細胞質中。一種優選的融合劑改變電荷，例如在低于生理范圍的pH值 下(例如在pH 4.5-6.5下)變得質子化。融合劑可為含有能夠在暴露于特定pH值范圍時改變 電荷(例如質子化）的氨基的分子。此類融合劑包括具有聚氨基鏈的聚合物(例如聚乙二亞 胺)和膜分裂劑(例如蜂毒素）。其它實例包括聚組氨酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙烯亞胺和聚縮 醛物質(例如陽離子聚縮醛）。
[0066]縮合劑與任一微RNA、任一詰抗miR或用于表達其的任一表達載體相互作用，使其 縮合(例如減少寡核苷酸尺寸），因此保護其避免降解。優選地，縮合劑包括經由例如離子相 互作用與寡核苷酸相互作用的部分(例如帶電部分）。縮合劑的實例包括聚賴氨酸、精胺、亞 精胺、多元胺或其季鹽、偽肽-多元胺、肽模擬多元胺、樹枝狀聚合物多元胺、精氨酸、脒、魚 精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉和a螺旋肽。
[0067] 在一些實施例中，有效量的miR-130a RNA、miR-130b RNA或其組合投與罹患、懷疑 患有與異常上調的PGCla、PGC10或兩者相關的疾病或處于其風險下的個體（例如人類患 者）。此類疾病包括(但不限于)糖尿病和脂肪變性。參見圖22。在一些實例中，微RNA或用于 產生其的表達載體的量有效下調PGCla、PGC10或兩者。
[0068]在其它實施例中，有效量的miR-130a或miR-130b的拮抗miR或用于產生其的表達 載體投與罹患、懷疑患有與異常下調的PGCla、PGC10或兩者相關的疾病或處于其風險下的 個體(例如人類患者）。此類疾病包括(但不限于）與R0S相關的疾病(例如神經退化性疾病， 例如帕金森氏病、亨廷頓氏病或阿爾茨海默病）、發炎、肌肉功能障礙、心血管疾病，例如心 力衰竭。參見圖22。在一些實例中，微RNA或用于產生其的表達載體的量有效上調PGCla、 PGC1P或兩者。
[0069] 如本文所用，"有效量"是指單獨或與其它劑量或一或多種其它活性劑一起的微 RNA分子、其拮抗miR或用于表達其的表達載體產生所需反應，例如增強或抑制PGCla、PGC10 或兩者和/或緩解目標疾病(例如本文所述的疾病）的一或多種癥狀的量。此可包括僅僅暫 時減緩疾病的進展，不過更優選地，其包括永久中斷疾病的進展。此可通過常規方法，例如 體檢和適合的實驗室測試監測。對任一本文公開的目標疾病治療的所需反應也可為延遲疾 病發作或甚至阻止疾病發作。
[0070] 如本領域的技術人員所認知，有效量可變化，取決于以下:所治療的具體病狀、病 狀嚴重程度、個別患者參數(包括年齡、身體狀況、體型、性別和體重）、治療持續時間、并行 療法(如果存在）的性質、特定投藥途徑以及健康從業者的知識和專長范圍內的類似因素。 這些因素為本領域普通技術人員眾所周知并且可僅用常規實驗便可解決。通常優選使用個 別組分或其組合的最大劑量，即根據合理醫學判斷的最高安全劑量。然而本領域普通技術 人員應了解，患者因醫學原因、心理原因或實際上任何其它原因可堅持較低劑量或可耐受 劑量。
[0071] 本領域中眾所周知動物與人類之間的劑量的相互關系(例如基于每平方米身體表 面的毫克數或每一體重的毫克數）。參見例如弗賴雷克等人（1966)癌癥化學治療報告50: 219(Freireich et al(1966)Cancer Chemother Rep 50:219)。體表面可大致地從患者的 身高和體重確定。
[0072] 需要上述治療的個體可為罹患、懷疑患有任一本文所述的目標疾病或處于出現其 風險下的個體(例如人類）。實例包括(但不限于)糖尿病(例如I型糖尿病、II型糖尿病以及 例如視網膜病等與糖尿病相關的綜合癥）、與R0S相關的疾病，例如肌肉功能障礙、心力衰竭 和神經退化性疾病（例如帕金森氏病、亨廷頓氏病）。此類個體可經由常規醫療程序，包括 (但不限于)體檢和病理分析來鑒別。糖尿病的常見癥狀包括(但不限于)頻繁排尿、感覺口 渴、感到饑餓、異常重量減輕或重量增加、疲乏和視覺模糊。此類個體可經由常規的醫學程 序鑒別。處于出現如本文所述的疾病，例如與R0S相關的疾病的風險下的個體具有一或多種 與疾病或病癥相關的風險因子。
[0073] 醫學領域普通技術人員已知的常規方法可用于向需要治療的個體投與上述醫藥 組合物。舉例來說，上述醫藥組合物可經口或不經腸傳遞。不經腸投與包括靜脈內、動脈內、 皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注;或顱內投與(例如鞘內或腦室內）。
[0074] 含有本文所述的微RNA分子、本文所述的拮抗miR或其表達載體的可注射組合物可 含有各種載劑，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、十四烷酸 異丙酯、乙醇和多元醇(丙三醇、丙二醇、液體聚乙二醇等）。對于靜脈內注射來說，可通過滴 注方法投與寡核苷酸，由此輸注含有寡核苷酸和生理學上可接受的賦形劑的醫藥調配物。 生理學上可接受的賦形劑可包括例如5%右旋糖、0.9%生理鹽水、林格氏溶液或其它適合 賦形劑。肌肉內制劑，例如肽的適合可溶性鹽形式的無菌調配物，可在例如無菌水、0.9%生 理食鹽水或5 %葡萄糖溶液等醫藥賦形劑中溶解并且投與。
[0075]當經口投與時，優選地，寡核苷酸包括至少一種Y -0-甲氧基乙基修飾。用于經口 投與的組合物可為任何口服可接受的劑型，包括(但不限于)膠囊、錠劑、乳液和水性懸浮 液、分散液和溶液。在口服使用的片劑的情況下，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還添 加如硬脂酸鎂等潤滑劑。對以膠囊形式經口投與來說，適用的稀釋劑包括乳糖和干燥玉米 淀粉。當水性懸浮液或乳液經口投與時，活性成分可懸浮或溶解于與乳化劑或懸浮劑組合 的油相中。必要時，可添加某些甜味劑、調味劑或著色劑。經鼻氣溶膠或吸入組合物可根據 醫藥調配領域中眾所周知的技術來制備。本文所述的醫藥組合物也可呈用于直腸投藥的栓 劑形式投與。
[0076]試劑盒
[0077] 本公開還提供了用于調節（例如抑制或增強)PGCla、PGClf3和/或PPARy或治療如 本文所述的疾病的與PGCla、PGC10或兩者相關的疾病的試劑盒。此類試劑盒可包括一或多 個包含一或多種微RNA分子、拮抗miR或其表達載體的容器。
[0078] 在一些實施例中，試劑盒可包含根據本文所述方法中的任一者的使用說明書。所 包括的說明書可包含投與微RNA、拮抗miR或其表達載體以治療所希望的目標疾病的描述。 試劑盒可進一步包含基于鑒別個體是否具有目標疾病，選擇適合于治療的個體的描述。
[0079] 與如本文所述的微RNA或拮抗miR的使用相關的說明書大體上包括關于所期望治 療的劑量、給藥時程和投與途徑的信息。容器可為單位劑量、散裝(例如多劑量包裝)或亞單 位劑量。雖然本發明試劑盒中供應的說明書通常為在標記或藥品說明書(例如試劑盒中包 括的紙片)上的書面說明書，但機器可讀說明書(例如磁盤或光盤存儲盤上載有的說明書） 也是可接受的。
[0080] 標記或藥品說明書指示組合物用于抑制或增強PGCla、PGCie或兩者且用于治療任 一本文所述的目標疾病，可提供用于實施任一本文所述的方法。
[0081] 本發明的試劑盒呈適合包裝形式。適合的包裝包括(但不限于）小瓶、瓶子、罐、柔 性包裝(例如密封的邁拉(Mylar)或塑料袋)等等。還涵蓋用于與特定裝置(例如吸入器、經 鼻投藥裝置(例如霧化器)或輸注裝置(例如小型栗））組合的包裝。試劑盒可具有無菌進入 孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶）。容器也可具有 無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶）。組合 物中的至少一種活性劑為如本文所述的微RNA分子或其表達載體。
[0082] 試劑盒可任選地提供額外組分(諸如緩沖劑)和說明性信息。通常，試劑盒包含容 器和在容器上或與容器相聯的標記或藥品說明書。在一些實施例中，本發明提供了包含上 述試劑盒的內含物的制品。
[0083] 在不進一步詳細描述的情況下，相信本領域的技術人員可基于以上描述，最大程 度地利用本發明。因此，以下特定實施例僅視為說明性的，并且決不以任何方式限制本發明 的其余部分。本文中引用的所有公開案以引用的方式并入用于本文中提及的目的或主題。
[0084] 實例：用 MiR-130 調節 PGCl-a
[0085] 材料與方法
[0086] miRNA質粒的構筑
[0087] 如上所述，人類miRNA的序列從Ensembl數據庫和miRbase(16版)檢索得到。用于克 隆全長前驅miRNA的引物序列在以下表1中列出：
[0088]表1.用于本研究的合成寡核苷酸和PCR引物的DNA序列

[0091]其它地方詳述構筑miRNA表達載體的方法。陳H.L.等人，公共科學圖書館?綜合7， e34116(2012)(Chen，H.L.et al.PloS one 7,634116(2012))。卩〇?產物通過Hind III消化 從TA克隆載體(RBC)亞克隆到pSuper(奧利工程公司（OligoEngine，Inc))。所有質粒都通過 測序證實。通過轉染和莖環RT-PCR分析檢測大約8-400倍更高的微RNA表達水平。PPARy和 PGCla表達載體來自復能基因（GeneCopoeia) 〇 [0092] 抗體來源
[0093]抗HBc(達科公司（Dako))、抗PPARy (圣克魯茲（Santa Cruz))、抗GAPDH、抗PKLR、 抗G6Pase、抗微管蛋白、抗脂肪細胞因子（臺灣基因特斯(GeneTex，Taiwan))、抗PGCla(傲銳 基因（Origene))、抗PCK1 (亞諾法(Abnova))、抗GCK(生物視野(Biovision))，二級抗體包括 小鼠抗兔-HRP、山羊抗小鼠-HRP (臺灣基因特斯(GeneTex，Taiwan))和驢抗山羊-HRP (圣克 魯茲）。
[0094]合成 RNA
[0095 ] 所用的合成miRNA (吉瑪制藥(Genepharma))為不具有修飾的RNA雙螺旋。有義股與 miRNA的成熟形式相同。模擬miR-130a(CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ ID N0:1))、模擬 miR-204 (UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU( SEQ ID NO : 6 5 ))、模擬m i R-1 2 3 6 (CCUCUUCCCCUU⑶CUCUCCAG (SEQ ID NO: 66))、模擬陰性對照（UUCUCCGAACGUGUCACGUTT (SEQ ID NO:67))。針對PGCla的siRNA寡核苷酸來自法瑪克恩(Dharmacon)。
[0096] MiR_130a 海綿
[0097]每個有義和反義寡核苷酸(參見以上表1)經設計以含有miR_130a的合成標靶位點 的四個拷貝。退火的寡聚產物在PCR擴增前進行凝膠純化。凝膠純化的PCR產物在Hindlll位 點亞克隆到DsRedCl載體中。群落通過PCR篩選并且通過測序證實插入物的取向和標靶位點 的拷貝數。
[0098] 細胞培養
[0099]人類肝瘤Huh7和HepG2細胞如以下先前所描述維持:蔡等人，病毒學雜志84,2340_ 2351(2010)(Chua，P.K.，et al.Journal of virology 84,2340-2351(2010));勒?伯蓋姆 等人，病毒學雜志79，1871_1887(2005)(Le Pogam，S.，et al.，Journal of virology 79， 1871-1887(2005))。一般來說，病毒復制的表現型和微RNA的作用在HepG2中比Huh7細胞中 更強。但是，Huh7細胞易于傳代和轉染。因此，可互換使用此兩個細胞系。
[0100] PPAR y促效劑和拮抗劑
[0101] 羅格列酮和GW9662來自西格馬（Sigma) AepGS和Huh7細胞在6孔組織培養盤中以5 X 10個細胞/孔接種(奎斯多夫等人，病毒性肝炎雜志17,527-536(2010) (Quasdorff，M.et al.Journal of viral hepatitis 17,527-536(2010)))。在轉染24小時后，含羅格列酮或 GW9662的0.1%DMS0添加到培養基。在采集前兩天不時改變培養基。
[0102] ELISA
[0103] 分泌的脂肪細胞因子的濃度通過ELISA(生物視野)測量。HBsAg和HBeAg的ELISA來 自臺灣的通用生物制品有限公司（General Biologicals Co.，Taiwan)〇 [0104]測量葡萄糖產生
[0105] 使用DRI-CHEM SLIDE GLU-PIII試劑盒（日本富士（FUJIFILM，JAPAN))測量HBV轉 基因小鼠的葡萄糖含量。十微升小鼠血清沉積在富士DRI-CHEM SLIDE GLU-PIII上。葡萄糖 氧化酶(G0D)催化樣品葡萄糖氧化，產生過氧化氫，接著過氧化氫與染料前驅物反應并形成 紅色染料。光學反射密度在505nm下通過富士 DRI-CHEM分析器測量并轉化為葡萄糖濃度 (mg/L)。為測量細胞培養物中的葡萄糖濃度，產生HBV的細胞(HepG2和Q7細胞）用PPAR y拮 抗劑GW9662在指示濃度下處理。在葡萄糖測量前二十四小時，培養基被lml補充有2mM丙酮 酸鈉的無葡萄糖的DMEM替換。在培育16小時后，收集50yl培養基且使用葡萄糖比色分析(生 物視野(Biovision))測量葡萄糖濃度(mM) 〇
[0106] 定量實時PCR
[0107]簡單來說，在37°C下2yg總RNA使用隨機引物和高容量cDNA反轉錄試劑盒(應用生 物系統(Applied Biosystem))逆轉錄成cDNA，歷時120分鐘。接著cDNA產物稀釋100倍，使用 Power SYBR綠色PCR主混合物(應用生物系統）和默認條件，在20yl反應體積中通過應用生 物系統7500實時PCR系統進行實時PCR分析。通過相對定量方法（A A Ct方法)使用7500軟件 V2.0.1分析數據。
[0108] miRNA 的莖環 qCR
[0109] 塔克曼（Taqman)RT和莖環實時分析來自應用生物系統公司：miR_31(分析ID: 002279)、miR-130a(分析ID:000454)、miR-204(分析ID:000508)和miR-1236(分析ID: 002752)。簡單來說，100ng RNA通過特定莖環引物逆轉錄并且通過塔克曼實時PCR分析使用 默認設置進一步分析。U6snRNA(分析ID:001973)用作內部內參考物。數據通過應用生物系 統公司7500軟件V2.0.1分析。
[0110] DNA 和 RNA 印跡
[0111] HBV核心粒子相關DNA、總細胞質RNA和微RNA通過如先前所描述的RNA印跡分析。蔡 等人，病毒學雜志84,2340-2351(2010);勒?伯蓋姆等人，病毒學雜志79,1871-1887 (2005)。
[0112] 焚光素酶報導體分析
[0113] 3'UTR或增強子/啟動子的分析如先前所描述。陳H.L.等人，公共科學圖書館?綜 合7，e34116(2012)。
[0114] 天然瓊脂糖凝膠電泳和蛋白質印跡
[0115] 用于檢測HBV核心粒子的天然瓊脂糖凝膠電泳和蛋白質印跡如所描述。蔡等人，病 毒學雜志84，2340-2351 (2010)。
[0116] 穩定的表達miR_130a的細胞系
[0117]大約一百萬的Huh7和 HepG2細胞經3ug質粒 DNA(pSuper 和 pSuper_miR-130a)與 Polyjet (西格納金(SignaGen))短暫轉染，接著進行G418選擇，歷時三周。將G418抗性群落 匯集在一起。
[0118] LNA-miR-130a阻斷基因表現
[0119] HepG2和Huh7細胞與抗嘌呤霉素質粒（pTRE2pur)和LNA-加擾對照或LNA抗miR-130a(鎖核酸，艾斯昆(Exiqon))，使用脂染胺2000(英杰公司（Invitrogen))共轉染。轉染后 十二小時，經轉染的培養物用嘌呤霉素（2μg/ml)處理2天，接著降低嘌呤霉素濃度(0.5yg/ ml)，2天后，采集用于蛋白質印跡分析。陳H.L.等人，公共科學圖書館?綜合7，e34116 (2012)。
[0120]生物信息學分析
[0121] 包括 Targetscan(http: // www.targetscan.org/)>Pictar(http：//pictar.mdc-ber1 in?de/)、Microinspector(http://bioinfo?uni-plovdiv?bg/microinspector/)、 RNAhybrid(http://www?bibiserv?techfak?uni-bielefeld?de/)和DIANA(http:// diana. cs lab. ece .ntua.gr)在內的基于計算機的程序用于預測miR-1236、miR_l 30a和miR-204的可能標革E。小于_20kcal/mol的最低結合自由能用作截止值。
[0122] 微RNA塔克曼低密度陣列分析
[0123] 通過Trizol (英杰公司）提取產生HBV的細胞的總RNA。通過安捷倫(Agilent)2100 生物分析儀，使用RNA 6000納米試劑盒(安捷倫技術公司(Agilent Technologies，Inc.)) 測定RNA樣品的品質和數量。使用塔克曼微RNA反轉錄試劑盒(應用生物系統)進行反轉錄反 應。m i RNA的表達通過TaqMan?嚙齒動物微RNA陣列A (應用生物系統公司)檢測，并通過含有 381個嚙齒動物miRNA標靶的應用生物系統公司7900HT快速實時PCR系統分析。
[0124] 統計數據
[0125] 使用史都登氏t檢驗測定統計顯著性。在所有圖中，值表示為平均值土標準偏差 (SD)并且統計顯著性(p<0.05)通過星號指示。數據表示來自至少三個獨立實驗的結果。
[0126] 題
[0127] MiR-130a直接靶向PGCla與PPARy 二者
[0128] 四種不同標靶預測算法用于鑒別肝細胞中miR_130a的潛在標靶轉錄因子。 PPARGCl-a(PGCla)鑒別為通過所有四種程序一致預測31TR的此類因子(表2)。
[0129] 表2.已知影響HBV轉錄的人類轉錄因子的Y UTR處miR-130a標靶位點的預測
[0131] ￡在文獻5、6、38中已經報導了這些轉錄因子與HBV RNA合成有關。MiR-130a展示 在脂肪細胞中靶向PPARy的3'UTR。李等人，分子細胞生物學31,626-638(2011) (Lee， E.K.et al.Mol Cell Biol31,626-638(2011))〇
[0132] 為闡明miR_130a與PGCla之間的潛在關系，建立表達miR-130a的穩定細胞系（圖 1)。雖然此處檢驗的大部分肝轉錄因子的表達水平在表達miR-130a的細胞系中保持不變， 但觀測到PPAR y和PGClamRNA和蛋白質同時減少（圖2、3和4)，此表明miR-130a可靶向PPAR y和PGCla二者。已知PPARy刺激脂肪細胞因子產生。余等人生物化學雜志278,498-505 (2003)(Yu et al.The Journal of biological chemistry 278,498_505(2003))。如所預 期，分泌的脂肪細胞因子在表達miR-130a的細胞系中顯著減少（圖5)。在反向實驗中，HepG2 細胞用LNA-miR-130a拮抗mir處理，并且觀測到PGClamRNA和蛋白質顯著增加（圖6)。根據此 發現，陳等人，基因療法 14，ll_19(2007))(Chen，C.C.et al.Gene therapy 14，11_19 (2007))中所述，在轉基因小鼠中砧1?-13(^顯著減少，而?6(：1<1、66?386、？￡?〇(、？?41?丫和血 清脂肪細胞因子都顯著增加（圖7)。因此，miR-130a可通過降低其相應mRNA水平（圖2、6)來 降低PPAR y和PGCla蛋白質水平（圖3)。有趣地，PPAR y與PGCla的組合在不存在任何外源性 配體下對脂肪細胞因子的分泌顯示顯著的協同效應(圖8)。
[0133] 為區別miR_130a對降低PGClamRNA的直接與間接機制，使用來自PPARy或PGCla的 3㈧TR進行報導體分析。結果證明miR-130a與PPAR 丫或PGCla的：^UTR之間的功能相互作用 (圖9)。然后，補償性突變引入到miR_130a的種子序列和對PGCla的其進化上保守的標靶位 點（圖10)。通過共轉染分析，僅僅突變體miR_130a與突變體PGCla的組合可成功地恢復miR-130a對熒光素酶活性的抑制作用。以劑量依賴性方式，miR-130a可降低，而LNA-miR-130a可 增加，含有PGCla的UTR的報導體的熒光素酶活性（圖11)。綜合而言，miR-130a可直接靶向 PGCla和PPARy 二者。
[0134] 肝葡糖新生和脂肪生成中的MiR-130a
[0135] miR_130a雙重靶向PGCla和PPARy強烈表明其在能量代謝中的重要作用。使用穩 定的表達miR-130a的細胞檢驗糖酵解、葡糖新生和脂肪生成中若干關鍵代謝酶（圖12,上 圖）。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)為已知在PGCla的正面控 制下的速率限制葡萄糖異生酶，尹等人，自然413,131-138(2001) (Yoon，J.C.et al .Nature 413，131-138(2001))。因為?6(：1〇11^嫩和蛋白質在表達11^-13(^的細胞中減少（圖2和3)，預 期PEPCK和G6Pase也應減少。實際上，在表達miR-130a的肝細胞中觀測到PEPCK和G6Pase mRNA(圖12)和蛋白質（圖13)同時減少。雖然此結果提出糖酵解而非葡糖新生途徑，但如果 其糖分解對應部分、丙酮酸激酶(PKLR)和葡糖激酶(GCK)不同時減少，那么其將更確定（圖 14) 。實際上，在HepG2或Huh7細胞中GCK和PLKR的蛋白質表達不減少，而是增加（圖13)。此 外，在表達miR-130a的肝細胞中觀測到GCK和PLKR的mRNA表達增加（圖14)。這些結果表明 miR_130a不僅可抑制HBV復制，而且也有助于在肝細胞中經由PGCla下調葡糖新生和上調糖 酵解。因此，miR-130a在與糖酵解失調關聯的疾病和病癥，例如代謝疾病中將是有效的。
[0136] 代謝三要素
[0137] HBV可對PGCla和PPARy發揮作用。與miR-130a減少一致，在產生HBV的UP7-4和 UP7-7細胞中？6(：1€^￡?0(、66? &%、？?41^和分泌的脂肪細胞因子蛋白質都顯著增加（圖 15) 。類似地，葡萄糖產生在穩定的產生PGCla的細胞中顯著增加，并且在產生PPARy的細胞 中減少（圖16)。在對照與產生miR-130a的細胞之間未檢測到葡萄糖水平顯著差異。如所預 期，葡萄糖水平在產生HBV的HepG2細胞中增加，并且當H印G2細胞用PPARy拮抗劑GW9662處 理時進一步增加，與其產生HBV的狀態無關（圖17)。最終，在穩定的表達PGCla的細胞系中 miR-130a表達無明顯改變(圖18)。
[0138] HBV、miR_130a和PGCla之間的三元關系概述在圖19中。與PGCla對比，miR-130a的 表達在穩定的表達PPARy的細胞系中減少，并且通過羅格列酮處理，進一步減少，但通過 GW9662未進一步減少（圖20)。這些結果表明具有正前饋回路的另一三元圖（圖21)。通過此 回路接收的初級弱信號可擴大成更強的表現型結果。
[0139] 論述
[0140] miR-130a的最突出特征為其雙重靶向PPARy和PGCla(圖2、3和5、9、10)，導致HBV 復制減少。相反，HBV可減少miR-130a的表達(表2)，導致PPAR 丫（脂肪細胞因子）和PGCla (卩￡?〇(和66?&86)的表達增加（圖12、13和15)。？?41?丫的過表達降低11111?-130 &的水平，并且 通過羅格列酮（圖20)，或PPAR y與PGCla組合觀測到miR-130a進一步減少。綜合而言，建立 HBV、miR-130a、PGCla和PPARy之間的正前饋回路（圖21)。此三元回路可通過經歷此回路重 復回合，在理論上放大弱的初級信號。
[0141] 其它實施例
[0142] 本說明書中公開的所有特征可以任何組合形式組合。本說明書中公開的每個特征 可經用于達成相同、等效或類似目的的替代性特征置換。因此，除非另外明確陳述，否則所 公開的每個特征僅為一系列通用的等效或類似特征的一個實例。
[0143] 從以上論述中，本領域普通技術人員可容易地確定本發明的基本特征，并且在不 背離其精神和范圍的情況下，可進行本發明的不同變化和修改以使本發明適于不同用途和 條件。因此，其它實施例亦屬于權利要求書內。
【主權項】
1. 一種用于治療與PGCla或PGCli3相關的疾病的醫藥組合物，所述醫藥組合物包含有效 量的一或多種寡核苷酸和醫藥學上可接受的，其中所述一或多種寡核苷酸為： (a)miR-130a RNA、miR-130b RNA或其組合；或 (13)111丨1?-13〇3的詰抗111丨1?、111丨1?-13013的詰抗111丨1?或其組合。2. 根據權利要求1所述使用的醫藥組合物，其中所述一或多種寡核苷酸為雙螺旋RNA分 子或單股RNA分子。3. 根據權利要求1或權利要求2所述使用的醫藥組合物，其中所述寡核苷酸為miR-130a RNA或miR-130b RNA，其包含AGUGCAA的核苷酸序列。4. 根據權利要求3所述使用的醫藥組合物，其中所述m i R - 1 3 0 a RNA包含 CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU的核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)。5. 根據權利要求3所述使用的醫藥組合物，其中所述m i R - 1 3 0 b R N A包含 CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU的核苷酸序列（SEQ ID N0:2)。6. 根據權利要求1至5中任一權利要求所述使用的醫藥組合物，其中所述一或多種寡核 苷酸為miR-130a RNA、miR-130b RNA或其組合;并且所述醫藥組合物用于治療糖尿病或脂 肪變性。7. 根據權利要求1至5中任一權利要求所述使用的醫藥組合物，其中所述一或多種寡核 苷酸為miR_130a的詰抗miR、miR-130b的詰抗miR或其組合;并且所述醫藥組合物用于治療 與反應性氧物質R0S相關的疾病或糖尿病。8. 根據權利要求7所述使用的醫藥組合物，其中所述醫藥組合物用于治療神經退化性 疾病、心血管疾病、發炎或肌肉功能障礙。9. 根據權利要求8所述使用的醫藥組合物，其中所述神經退化性疾病為帕金森氏病 (Parkinson disease)、亨廷頓氏病(Hungtinton disease)或阿爾茨海默病(Alzheimer disease)〇10. 根據權利要求8所述使用的醫藥組合物，其中所述心血管疾病為心力衰竭。11. 根據權利要求1至10中任一權利要求所述使用的醫藥組合物，其中所述一或多種寡 核苷酸為miR_130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或其組合，并且其中所述拮抗miR為微 RNA海綿或鎖核酸。12. -種用于調節PGCla或PGCli3的方法，其包含使細胞接觸有效量的以下各物： (c)miR-130a RNA、miR-130b RNA或其組合；或 ((1)111丨1?-13〇3的詰抗111丨1?、111丨1?-13013的詰抗111丨1?或其組合。13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述細胞接觸有效下調PGC1 α或PGC1 β的量的所 述miR-Ι 30a、所述miR-Ι 30b或其組合。14. 根據權利要求12或權利要求13所述的方法，其中所述miR-130a RNA、所述miR-130b RNA或兩者為雙螺旋RNA分子或單股RNA分子。15. 根據權利要求12至14中任一權利要求所述的方法，其中所述miR-130a RNA或所述 miR-130b RNA包含AGUGCAA的核苷酸序列。16. 根據權利要求1 5所述的方法，其中所述m i R - 1 3 0 a R N A包含 CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU的核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)。17. 根據權利要求1 6所述的方法，其中所述m i R - 1 3 0 b R N A包含 CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU的核苷酸序列（SEQ ID N0:2)。18. 根據權利要求12所述的方法，其中所述細胞接觸有效上調PGCla或PGCli3的量的 miR_130a的詰抗miR、miR_130b的詰抗miR或其組合。19. 根據權利要求18所述的方法，其中所述miR-130a的詰抗miR、所述miR-130b的詰抗 m i R或兩者為雙螺旋RNA分子或單股RNA分子。20. 根據權利要求12至19中任一權利要求所述的方法，其中所述接觸步驟通過向有需 要的個體投與有效量的所述miRNA中的一者或兩者或所述詰抗miR中的一者或兩者進行。21. 根據權利要求20所述的方法，其中所述個體投與所述miR-130a、所述miR-130b或其 組合。22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述個體患有或懷疑患有糖尿病或脂肪變性。23. 根據權利要求20所述的方法，其中所述個體投與所述miR-130a的詰抗miR、所述 miR-Ι 30b的詰抗miR或其組合。24. 根據權利要求23所述的方法，其中所述個體患有或懷疑患有與反應性氧物質ROS相 關的疾病。25. 根據權利要求23所述的方法，其中所述與ROS相關的疾病選自由肌肉功能障礙、心 力衰竭和神經退化性疾病組成的群組。26. 根據權利要求25所述的方法，其中所述神經退化性疾病為帕金森氏病、亨廷頓氏病 或阿爾茨海默病。27. 根據權利要求23所述的方法，其中所述個體患有或懷疑患有糖尿病或發炎。28. 根據權利要求12至27中任一權利要求所述的方法，其中所述miR-130a的拮抗miR、 所述miR-130b的拮抗miR或兩者為微RNA海綿或鎖核酸LNA。
【文檔編號】A61P3/00GK105873617SQ201480051372
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年9月19日
【發明人】施嘉和, 黃鈞源
【申請人】中央研究院