糖蛋白激素長效超激動劑的制作方法

糖蛋白激素長效超激動劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供糖蛋白激素的長效、超活性類似物，其與野生型對應物相比在體外和體內都展示增強的生物活性。所述類似物特別地用于治療顯示低受體表達或差的受體響應性的受試者，且用于治療任何與糖蛋白激素活性相關的病況。
【專利說明】
糖蛋白激素長效超激動劑
技術領域
[0001] 本發明大體涉及具有超激動劑活性的被修飾的糖蛋白激素，以及其在治療與糖蛋 白激素活性相關的病況中的用途。更具體地，本發明涉及被修飾的糖蛋白分子，其與野生型 a亞單位相比在a亞單位中含有氨基酸取代和一個或多個插入的肽，其中此類被修飾的分子 與野生型糖蛋白相比展現增強的藥理學性質。
【背景技術】
[0002] 促性腺素促濾泡素(促卵泡激素，FSH)和絨毛膜促性腺素(CG)、促黃體激素(黃體 化激素，LH)和促甲狀腺素（甲狀腺刺激激素，TSH)構成糖蛋白激素家族。各激素為兩個非共 價連接的亞單位，即a亞單位和0亞單位的雜二聚體。在相同的物種內，a-亞單位的氨基酸序 列在所有激素中都相同，而0 _亞單位的序列是激素特異性的（P i e r c e， Ann. Rev. Biochem. 50:465-495(1981))。所述亞單位的序列從魚到哺乳動物高度保守的事 實暗示這些激素由共同的祖先蛋白進化而來(Fontaine，Gen. Comp. Endocrinol. 32 :341-347(1977))。糖蛋白激素在整個動物譜中的普遍存在也指示所述激素或所述激素的任何修 飾形式被用于各種物種中的巨大潛力。
[0003]之前關于被修飾的糖蛋白激素的研究已揭示令人鼓舞的數據。例如，除了提供具 有增加活性的被修飾的糖蛋白激素之外，進一步的突變還證明受體親和結合的增加(參見 例如W0 2005/089445和W0 2005/101000)。然而，盡管親和力增加，但研究證明被修飾的糖 蛋白激素的清除即使不比它們的野生型對應物快，也與它們的野生型對應物一樣快。為了 產生具有增強活性的臨床有用的超激動劑，被修飾的糖蛋白超激動劑除了應當具有改善的 受體結合親和力之外，還應具有改善的生物半衰期。然而，之前進一步修飾糖蛋白激素以增 加半衰期和改善生物利用度的嘗試不太令人滿意，而是被修飾的糖蛋白激素僅展示減弱的 響應。

【發明內容】

[0004] 本發明涵蓋被修飾的糖蛋白激素，其包含在糖蛋白激素的a亞單位的Q13、E14、P16 或Q20處具有至少一個保守的堿性氨基酸取代且在D3和Q5之間具有VNVTINVT(SEQ ID NO: 20)的插入片段的氨基酸序列。
[0005] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素在Q13、P16和Q20處包含至少兩個或至少 三個堿性氨基酸取代。在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素進一步在E14處包含堿性氨 基酸取代。在一些實施方案中，堿性氨基酸為精氨酸。
[0006] 在一些實施方案中，a亞單位包含與SEQ ID N0:11具有至少85%同一性的氨基酸 序列且進一步包含黃體化激素(LH)的0亞單位、絨毛膜促性腺素(CG)的0亞單位、促卵泡激 素(FSH)的0亞單位或甲狀腺刺激激素(TSH)的0亞單位。在一些實施方案中，a亞單位衍生自 人a亞單位（SEQ ID N0:6)。
[0007] 本發明涵蓋被修飾的糖蛋白激素，其包含在糖蛋白激素的a亞單位的K15、K17、K20 或K24具有至少一個保守堿性氨基酸取代且在F6和T7之間具有NVTINV(SEQ ID N0:1)的插 入片段的氨基酸序列。
[0008] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素在K15、K17、K20和K24處包含至少兩個、 或至少三個或至少四個堿性氨基酸取代。在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素進一步 在E18處包含堿性氨基酸取代。在一些實施方案中，堿性氨基酸為精氨酸。
[0009] 在一些實施方案中，a亞單位包含與SEQ ID N0:7具有至少85%同一性的氨基酸序 列且進一步包含黃體化激素(LH)的0亞單位、絨毛膜促性腺素(CG)的0亞單位、促卵泡激素 (FSH)的0亞單位或甲狀腺刺激激素(TSH)的0亞單位。
[0010] 本發明涵蓋被修飾的糖蛋白激素，其包含在糖蛋白激素的a亞單位的K15、E18、K20 或K24處具有至少一個保守堿性氨基酸取代，且在F6和T7之間具有NVTINV(SEQ ID N0:1)的 插入片段或具有在F6和T7之間NV的插入片段加上T7和T8之間INV的插入片段的氨基酸序 列。
[0011] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素在K15、E18、K20和K24處包含至少兩個、 或至少三個或至少四個堿性氨基酸取代。在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素在a亞單 位的F6和T7之間包含NVTINV(SEQ ID N0:1)的插入片段。在一些實施方案中，被修飾的糖蛋 白激素包含a亞單位的F6和T7之間的NV插入片段加上T7和T8之間的INV插入片段。在一些實 施方案中，堿性氨基酸為精氨酸或組氨酸。在一些實施方案中，堿性氨基酸為精氨酸。
[0012] 在一些實施方案中，a亞單位包含與SEQ ID N0:4具有至少85%同一性的氨基酸序 列且進一步包含黃體化激素(LH)的0亞單位、絨毛膜促性腺素(CG)的0亞單位、促卵泡激素 (FSH)的0亞單位或甲狀腺刺激激素(TSH)的0亞單位。在一些實施方案中，a亞單位衍生自馬 a亞單位（SEQ ID N0:4)。
[0013]本發明還涵蓋被修飾的糖蛋白激素，其包含在a亞單位的a-Ll環中具有至少一個 堿性氨基酸取代且在a亞單位的N-末端附近具有一個或多個插入片段的氨基酸序列，其中 與野生型糖蛋白激素相比所述插入片段向a亞單位中引入NXINXASNNXA糖基化位點， 并且Xi、X 2、X3和X4獨立地為任何氨基酸。
[0014] 在一些實施方案中，每個插入片段包括一個或多個NXiTSNXA糖基化位點，其中Xi 和X2獨立地為除脯氨酸以外的任何氨基酸。在一些實施方案中，插入片段向a亞單位中引入 NXANX2S或NNX 3X4位點，但NXANX2S或NNX3X4引入位點中的至少一個氨基酸不是插入片段 的一部分。在一些實施方案中，插入片段在野生型糖蛋白激素a亞單位的F6和T7之間。在一 些實施方案中，插入片段可以向a亞單位中引入NNX 3X4糖基化位點，其中X3和X4獨立地為T或 So
[0015] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素在野生型糖蛋白激素a亞單位的15、17、 18、20或24氨基酸位置處包含至少一個堿性氨基酸取代。在一些實施方案中，被修飾的糖蛋 白激素在野生型糖蛋白激素a亞單位的151(、171(/176/171、181(/18￡、201(或241(氨基酸位置處 包含至少一個堿性氨基酸取代。
[0016]本發明還涵蓋被修飾的糖蛋白激素，其包含被修飾的a亞單位且進一步包含黃體 化激素(LH)的0亞單位、絨毛膜促性腺素(CG)的0亞單位、促卵泡激素(FSH)的0亞單位或甲 狀腺刺激激素(TSH)的0亞單位。
[0017] 在一些實施方案中，a亞單位衍生自野生型人a亞單位(SEQ ID N0:6)、野生型牛a 亞單位（SEQ ID NO: 2)、野生型豬a亞單位（SEQ ID NO: 5)和野生型綿羊a亞單位（SEQ ID N0:3)、野生型犬a亞單位（SEQ ID N0:47)、野生型貓a亞單位（SEQ ID N0:50)、野生型兔a亞 單位（SEQ ID N0:53)、野生型山羊a亞單位（SEQ ID N0:55)、野生型負鼠（didelphine)a亞 單位（SEQ ID NO: 57)、野生型鯉魚a亞單位（SEQ ID NO: 67)、野生型大馬哈魚a亞單位（SEQ ID N0:69)、野生型馬a亞單位（SEQ ID N0:4)、野生型雞a亞單位（SEQ ID N0:59)、野生型火 雞a亞單位（SEQ ID N0:61)、野生型鴕鳥a亞單位（SEQ ID N0:63)、或野生型鯰魚a亞單位 (SEQ ID N0:65)。
[0018]本發明涵蓋用于在動物中刺激糖蛋白激素受體的方法，其包括向所述動物施用上 述被修飾的糖蛋白激素。所述動物可以是哺乳動物、鳥類或魚類，并且可以包括但不限于 牛、母牛、豬、馬、綿羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額 牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛、牦牛、雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍珠雞、鴕鳥、鯉魚、 大馬哈魚、羅非魚、鯰魚、?盧魚、鯛或石斑魚。
【附圖說明】
[0019]圖1顯示用通過瞬時轉染產生的所選bFSH類似物在CH0-FSHR細胞中的cAMP刺激。 圖1A顯示？〇丨丨比€^11?，(口?311)士?311-11'(野生型）與匕?311-51?類似物的比較。圖18顯示通過 兩個N-端延伸物(ANITV，NITV)和一個內部新糖基化(V78N)對hFSH-TR4402類似物（瞬時 4402)的體外生物活性的減弱（SPA cAMP測試）。圖1C顯示bFSH-5R類似物與插入片段1(5R+ 插入片段1)和插入片段2(5R+插入片段2)的比較。
[0020]圖2A和2B顯示小鼠在單一皮下注射后各種bFSH類似物的PK篩選測試。在各實驗 中，將5只小鼠用于各制備物。在注射后24h、32h和48h獲取血樣，扣除血漿水平并且將數據 表示為注射劑量的％ (ID%)。使用FSH ELISA(Endodrine Technologies)測定血漿樣品中 的FSH水平。
[0021]圖3A-D顯示TR55601產生的不同批次（lot)的分析。圖3A顯示使用IEF、然后使用蛋 白質印跡進行的電荷異質性分析。批次3(泳道2和3)的次佳唾液酸化作用（Suboptimal sialylation)明顯不同于批次4(泳道5和6)中檢測到的最佳高度酸性亞型。泳道1，IEF 3-10標記；泳道2，TR55601/批次 3(8yg);泳道3，TR55601/批次3(4yg);泳道4和 8，TR4401(ly g);泳道5，TR55601/批次4(8yg);泳道6，TR55601/批次4(4yg);泳道8，IEF 3-10標記。圖3B 顯示使用神經氨酸酶(霍亂弧菌(Vibrio cholerae))、IEF和蛋白質印跡對帶電荷的亞型的 分析。未處理的TR55601/批次4樣品（泳道2和3)和在施加至3-10IEF凝膠之前用神經氨酸酶 處理的TR55601/批次4樣品（泳道4-6)。泳道1，IEF 3-10標記；泳道2,未處理的TR55601/批 次4(8yg);泳道3,未處理的TR55601/批次4(4yg);泳道4,處理的TR55601/批次4(4yg);泳道 5,處理的TR55601/批次4(2yg);泳道6,處理的TR55601/批次4(lyg)。神經氨酸酶消化的亞 型的IEF曲線已位移至7.8至10.0的pi范圍。pi的平均位移為約5個pH單位且多個帶(接近10 個帶)轉化為一個主要帶(pi~9.5)和三個次要帶(pi 7.8-10.0)，這表明大多數觀察到的 電荷異質性(圖3A-批次4)依賴于末端唾液酸殘基以及具有其它修飾如脫酰胺化和/或蛋白 水解降解的次要組分。3B中所示的殘余堿性帶(pi 4.8-5.5)為非特異性的，源自神經氨酸 酶制備物。圖3C顯示通過pi梯度凝膠中的IEF 3-10(IEF 3-10)、然后通過蛋白質印跡對 TR55601-批次5的帶電荷亞型的分析。泳道1，IEF 3-10標記；泳道2，TR55601-批次5(4yg); 泳道3，TR55601-批次5(4yg);泳道4，TR55601-批次4(4yg);泳道5，TR55601-批次4(8yg);泳 道6，TR55601-批次3(4yg);泳道7，TR55601-批次3(8yg)。圖3D圖解說明相比于TR55601批次 4和Fol-V對TR55601批次5的SDS-蛋白質印跡分析。泳道1，蛋白質標記；泳道2:批次4， 500ng;泳道3:批次5，lul;泳道4:空泳道；泳道5:批次4，4ug;泳道6 :批次5，15ul;泳道7 : Fol-V，673ng;泳道8:蛋白質標記。
[0022]圖4顯示在不成熟（22天齡）Sprague-Dawley雌性大鼠中對于卵巢重量的hCG增加 的經典Steelman-Pohley生物測定的結果。在給藥后72小時測量卵巢重量。數據表示為兩個 卵巢的平均總卵巢重量+SEM(每次給藥每組n = 5)。大鼠用補充有40IU hCG的測試制品或媒 介物的一次單一注射刺激。使用以下劑量組:組1僅接受hCG(無FSH)，組2-5接受TR55601批 次4(從左至右分別為0 ? 33yg、1 ? 〇yg、3 ? 33yg和l〇yg，），組6-8接受F〇ntropin?-V(從左至右 分別為3，333yg、10，OOOyg和30，OOOyg)，且組9-10接受TR4401 (1 ? Oyg和3 ? 33yg)。
[0023] 圖5展示超數排卵、誘導排卵和固定時間人工受精的卵泡波同步方案。 Folltropin-VR(Bioniche)的8次注射用單次或雙次注射TR55601代替。
[0024] 圖6顯示肉用母牛(beef cow)在超刺激處理過程中卵泡(直徑3至5mm)的平均數， 所述肉用母牛用通過單一肌內注射給予的60yg rFSH治療，或以每天兩次肌內注射給予的 300mg Folltropin-V(對照）治療4天（組合3次實驗）。
[0025] 圖7顯示肉用母牛在超刺激處理過程中直徑6至8mm的卵泡的平均數，所述肉用母 牛用通過單一肌內注射給予的60yg rFSH治療，或以每天兩次肌內注射給予的300mg Fo 11 tropin-V(對照）治療4天(組合3次實驗）。
[0026]圖8顯示肉用母牛在超刺激處理過程中直徑>9mm的卵泡的平均數，所述肉用母牛 用通過單一肌內注射給予的60yg rFSH治療，或以每天兩次肌內注射給予的300mg Fo 11 trop in-V (對照）治療4天(組合3次實驗）。
[0027]圖9顯示肉用母牛在超刺激處理過程中直徑2 3mm的所有卵泡的平均直徑曲線，所 述肉用母牛用通過單一肌內注射給予的60yg rFSH治療，或以每天兩次肌內注射給予的 300mg Folltropin-V(對照）治療4天（組合3次實驗）。
[0028]圖10A顯示對于人a亞單位中的插入片段(A2)、沒有氨基端纈氨酸的插入片段(插 入片段2)、沒有插入片段的僅5個精氨酸取代(5R)和僅介質對照的cAMP產生的比較。圖10B 顯示三個測試的構建物的EC50。
[0029]圖11A顯示響應于具有SEQ ID NO: 1插入片段的人被修飾a亞單位和缺少所述插入 片段的牛被修飾a亞單位的cAMP產生的比較。圖11B顯示響應于有和沒有各種插入片段的人 被修飾a亞單位和牛亞單位的cAMP產生的比較。
[0030] 圖12顯示基于穩定表達野生型大鼠LH受體(rLHR)的HEK 293細胞中的cAMP刺激的 eCG類似物(2號、3號和4號）的體外LH生物活性。
[0031]圖13顯示基于表達大鼠LH受體(r LHR)的MLTC-1細胞中的孕酮刺激的e CG類似物(2 號、3號和4號）的體外LH生物活性。
[0032] 圖14顯示基于穩定表達野生型人FSH受體(hFSHR)的CH0細胞中的cAMP刺激的eCG 類似物(2號、3號和4號）的體外FSH生物活性。
【具體實施方式】
[0033]本發明提供被修飾的超活性糖蛋白激素分子，其與它們的野生型對應物相比令人 驚奇地顯示增強的效力和增加的生物半衰期。被修飾的意思是，雖然所述蛋白質含有不同 于野生型糖蛋白激素的氨基酸序列，但是該序列已被改變成使得它與另一物種的已知糖蛋 白激素序列不同。可以根據各種參數來評估超活性，包括效力和功效。"效力(potency)"是 通過測量半最大響應所確定的生物活性的參數。通過比較糖蛋白激素類似物在基線和最大 值(EC 50)之間的中間值的糖蛋白激素響應值與野生型糖蛋白激素的糖蛋白激素響應值來 確定效力差異。可以使用純化的蛋白質在體外測量糖蛋白激素響應，或者可以在瞬時轉染 編碼修飾蛋白質的核酸之后估計糖蛋白激素響應。還可以在體內、即在對所述糖蛋白激素 類似物有響應的動物體內測量糖蛋白激素響應。此類響應涵蓋糖蛋白激素與其受體結合的 任何已知的細胞的或生物學的以及定量的或定性的響應，例如cAMP產生、蛋白質如孕酮的 合成、受精率、胚泡形成率、每個受精卵母細胞的胚胎發育等。"功效(efficacy)"（Vmax)或 最大響應是生物活性的另一參數。如在本文中所討論的，生物活性的參數可以根據所測定 細胞系中的受體數目和受體偶聯而改變。在具有低受體數目或偶聯受損的系統中，Vmax(功 效)上的差異更易辨別。在受體過度表達的系統中，效力上的差異更為明顯。
[0034]例如，在被修飾的糖蛋白激素為被修飾的FSH或CG分子的情況下，可以在對于卵母 細胞數目而言的最大有效劑量下測量體內定量和定性的參數如卵母細胞的數量、受精率和 胚泡及胚胎形成率。對于卵母細胞數目而言的最大有效劑量是對卵母細胞的質量和數量而 言均為最佳量的超活性FSH。對于卵母細胞數目而言的最大有效劑量依賴于動物的體重和 代謝速率。例如，具有較慢代謝速率的較大動物的最大有效劑量大于具有較快代謝速率的 較小動物的最大有效劑量。經驗性地確定每只動物的最大有效劑量。
[0035]然而，無論所使用的系統如何，與野生型對應物相比，本發明的被修飾的超活性糖 蛋白激素蛋白質可以展示效力至少約2至10倍的增加或效力至少約20倍、30倍、40倍、50倍、 60倍、70倍、80倍、90倍或甚至100倍的增加，或與野生型對應物相比，本發明的被修飾的超 活性糖蛋白激素蛋白質可以展示最大功效約2 %至10 %的增加，或最大功效至少20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、甚至100%的增加。與野生型FSH相比，本發明的超 活性類似物還可以提供效力約5至10倍的增加或最大功效5%至10%的增加。與野生型相 比，本發明的一些被修飾的蛋白質可以展示效力至少約30至50倍的增加或最大功效30%至 50%的增加。因此，本發明的被修飾的糖蛋白激素蛋白質可以用于治療具有低受體數目或 受體響應缺陷的受試者，因為本發明的被修飾蛋白質即使在具有低受體數目或響應的系統 中也可以維持效力至少10倍的增加或最大功效10%的增加。
[0036]被修飾的超活性糖蛋白激素的吸收速率可以導致增加的作用持續時間。具有降低 的吸收速率和增加的作用持續時間的被修飾的糖蛋白激素類似物可以有益于敏感度減弱 的受試者，如患有生育障礙的那些受試者。吸收速率通過1測量。消除速率通過IU則量。
[0037]本發明的被修飾的糖蛋白激素分子包括所有動物物種如哺乳動物、鳥類和魚類的 被修飾蛋白質：作為示例，被修飾的糖蛋白激素可以包括源自人、牛、犬、貓、馬、豬、綿羊、 虎、獅、熊貓、負鼠、兔、鼠、鳥或魚a亞單位的a亞單位。魚糖蛋白激素（也被稱為GTH-1)可以 用于水產業，即，以輔助瀕危的或其它魚類物種的圈養生長。其它物種的被修飾的糖蛋白激 素可以用于農業育種，并且可以進一步用于實驗室環境以測試不同組合的突變對各種雄性 和雌性糖蛋白激素相關病況的作用。本發明的被修飾的糖蛋白激素還可以用于瀕危物種諸 如但不限于虎、獅和斑馬的保護和促進。
[0038]被修飾的糖蛋白激素可以包含源自野生型a亞單位的突變的a亞單位。在一些實施 方案中，所述a亞單位源自野生型人a亞單位(SEQ ID N0:6)、野生型牛a亞單位(SEQ ID N0: 2)、野生型豬a亞單位(SEQ ID NO:5)和野生型綿羊a亞單位(SEQ ID NO:3)、野生型犬a亞單 位（SEQ ID NO:47)、野生型貓a亞單位（SEQ ID NO:50)、野生型兔a亞單位（SEQ ID NO:53)、 野生型山羊a亞單位（SEQ ID NO:55)、野生型負鼠a亞單位（SEQ ID NO:57)、野生型鯉魚a亞 單位（SEQ ID N0:67)、野生型大馬哈魚a亞單位（SEQ ID N0:69)、野生型馬a亞單位（SEQ ID N0:4)、野生型雞a亞單位（SEQ ID N0:59)、野生型火雞a亞單位（SEQ ID N0:61)、野生型鴕 鳥a亞單位(SEQ ID N0:63)或野生型鯰魚a亞單位(SEQ ID N0:65)。
[0039]被修飾的糖蛋白激素分子可以在對應于本文公開的被修飾的人(例如SEQ ID NO: 11)、牛（例如SEQ ID N0:7)、犬（例如SEQ ID N0:48)、貓（例如SEQ ID N0:51)、馬（例如SEQ 10勵:9)、豬（例如3￡〇10勵：10)、綿羊（例如3￡〇10勵 :9)、負鼠（例如3￡〇10勵：58)、兔 (例如SEQ ID N0:54)、鳥（例如SEQ ID N0:60、62和64)和魚（例如SEQ ID N0:66、68、70和 71)的糖蛋白激素分子的位置處具有取代，其可以使用任何比對程序鑒定，包括但不限于 DNASIS、ALIONment、SIM 和 GCG 程序如 Gap、BestFi t、FrameAl ign 和 Compare 〇
[0040] 本發明的被修飾的糖蛋白激素分子至少包含被修飾的a-亞單位，其中所述a亞單 位在所述a亞單位的a-Ll環中包含至少一個堿性氨基酸取代。在人a亞單位中，堿性氨基酸 可以在野生型人a亞單位(SEQ ID N0:6)的13、14、16和/或20位被引入。在其它物種中，堿性 氨基酸可以在對應于野生型牛a亞單位(SEQ ID N0:2)、野生型豬a亞單位(SEQ ID N0:5)和 野生型綿羊a亞單位（SEQ ID NO: 3)、野生型犬a亞單位(SEQ ID N0:47)、野生型貓a亞單位 (SEQ ID N0:50)、野生型兔a亞單位（SEQ ID N0:53)、野生型山羊a亞單位（SEQ ID N0:55)、 野生型負鼠a亞單位(SEQ ID N0:57)、野生型鯉魚a亞單位(SEQ ID N0:67)和野生型大馬哈 魚a亞單位（SEQ ID N0:69)的15、17、18、20和/或24位；野生型馬<1亞單位（5￡〇10勵:4)的 15、18、20和/或24位；野生型雞a亞單位（SEQ ID N0:59)、野生型火雞a亞單位（SEQ ID NO: 61)和野生型鴕鳥a亞單位(SEQ ID N0:63)的15、17、18和/或24位；以及野生型鯰魚a亞單位 (SEQ ID N0:65)的12、14、15、17和/或21位被引入。在一些實施方案中，堿性氨基酸可以是 精氨酸、組氨酸和/或賴氨酸。在一些實施方案中，堿性氨基酸可以是精氨酸和/或組氨酸。 在一些實施方案中，堿性氨基酸可以是精氨酸。
[0041] 本發明的被修飾的糖蛋白激素分子可以在a亞單位的N-末端附近包含一個或多個 插入片段。與野生型糖蛋白激素相比所述插入片段向a亞單位中引入NXlNXsSSNNXA糖 基化位點，并且Xi、X 2、X3和X4獨立地為任何氨基酸。在一些實施方案中，XjPX2獨立地為V或I 或A。在一些實施方案中，X 3和X4獨立地為T或S，且X3X4為TT、SS、TS或ST。在一些實施方案中， 所述插入片段包含NXd、NX 2S或NNX3X4糖基化位點。在一些實施方案中，NXd、NX2S或NNX 3X4糖 基化位點中的至少一個氨基酸不是來自所述插入片段。在一些實施方案中，兩個或更多個 NXil^NXA糖基化位點被引入a亞單位中。在一些實施方案中，兩個或更多個似"或似以糖 基化位點被單一氨基酸分開，其中在一些實施方案中，所述氨基酸是V或I。
[0042] 序列為附1'1附（5￡〇10勵：1)或1附1'1附（5￡〇10勵：12)或￥爾1'1爾1'(5￡〇10勵： 20)的肽可插入在人a亞單位(SEQ ID N0:6)的氨基酸D3和Q5之間，牛、豬、綿羊、馬、犬、貓a 亞單位的F6和T7之間，兔a亞單位的F6和A7之間，山羊a亞單位的F6和M7之間，負鼠a亞單位 的F6和17之間，雞、火雞和鴕鳥a亞單位的F6和L7之間，以及鯰魚a亞單位的N3和D4之間。或 者，馬的被修飾的糖蛋白激素a亞單位可以包含在F6和T7之間NV的插入片段加上T7和T8之 間INV的插入片段。本發明的被修飾的蛋白質還可以含有其它取代，特別是不改變所述蛋白 質增強的性質的保守取代。然而，通常，此類被修飾的蛋白質在以上所列位置之外的位置處 將含有少于5個取代，且可能在以上所列位置之外的位置處展現與相應的野生型糖蛋白激 素a的完全氨基酸序列同一性。
[0043]堿性氨基酸包括氨基酸賴氨酸、精氨酸和組氨酸，以及可能為這三種氨基酸中任 一個的修飾物的任何其它堿性氨基酸，通常在自然界沒有被發現的合成的堿性氨基酸，或 在中性pH帶正電荷的任何其它氨基酸。所述堿性氨基酸尤其選自賴氨酸和精氨酸組成的 組。
[0044]具有堿性氨基酸取代和肽插入片段的示例性被修飾的a分子示于SEQ ID N0:11和 21(人），SEQ ID N0:7、14-19和22(牛），SEQ ID N0:8、46、79-80(綿羊），SEQ ID N0:10、45和 77-78(豬）、SEQ ID N0:9、38-42和72-76(馬）、SEQ ID N0:48-49(犬）、SEQ ID N0:51-52 (貓）、SEQ ID N0:54(兔）、SEQ ID N0:56(山羊）、SEQ ID N0:58(負鼠）、SEQ ID N0:60(雞）、 SEQ ID N0:62(火雞）、SEQ ID N0:64(鴕鳥）、SEQ ID N0:66(鯰魚）、SEQ ID N0:68(鯉魚）和 SEQ ID N0:70-71(大馬哈魚）。本發明提供具有與SEQ ID N0:7-ll、14-19、21-22、38-42、 45-46、48-49、51-52、54、56、58、60、62、64、66、68和70-80中的任一個具有至少85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性 的氨基酸序列的被修飾糖蛋白。
[0045]本發明的被修飾的糖蛋白激素蛋白質的被修飾的a亞單位也可以具有包含一個、 兩個、三個、四個或五個堿性氨基酸取代的a亞單位。被取代的氨基酸可以是任何非堿性氨 基酸。在一些實施方案中，非堿性氨基酸可以是賴氨酸殘基、谷氨酸殘基、脯氨酸殘基或谷 氨酰胺殘基。例如，在野生型牛a亞單位中，15、17、20、24位的一個或多個賴氨酸以及18位的 谷氨酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。在野生型人a亞單位中，13和20位的一個 或多個谷氨酰胺以及14位的谷氨酸和16位的脯氨酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸 取代。在野生型豬a亞單位中，15、17、20和24位的一個或多個賴氨酸以及18位的谷氨酸可以 被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。在野生型綿羊a亞單位中，15、17、20和24位的一個或 多個賴氨酸以及18位的谷氨酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。在野生型馬a亞 單位中，15、20和24位的一個或多個賴氨酸以及18位的谷氨酸可以被堿性氨基酸如精氨酸 和組氨酸取代。
[0046] 此外，在野生型犬a亞單位中，15、17、20和24位的一個或多個氨基酸以及18位的氨 基酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。在野生型貓a亞單位中，15、17、20和24位的 一個或多個氨基酸以及18位的氨基酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。在野生型 兔a亞單位中，15、17、20和24位的一個或多個氨基酸以及18位的氨基酸可以被堿性氨基酸 如精氨酸和組氨酸取代。在野生型山羊a亞單位中，15、17、20和24位的一個或多個氨基酸以 及18位的氨基酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。在野生型鯉魚a亞單位中，15、 17、20和24位的一個或多個氨基酸以及18位的氨基酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸 取代。在野生型大馬哈魚a亞單位中，15、17、20和24位的一個或多個氨基酸以及18位的氨基 酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。在野生型雞a亞單位中，15、17和24位的一個 或多個氨基酸以及18位的氨基酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。在野生型火雞 a亞單位中，15、17和24位的一個或多個氨基酸以及18位的氨基酸可以被堿性氨基酸如精氨 酸和組氨酸取代。在野生型鴕鳥a亞單位中，15、17和24位的一個或多個氨基酸以及18位的 氨基酸可以被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。在野生型鴕鳥a亞單位中，12、14、17和21 位的一個或多個氨基酸以及15位的氨基酸可被堿性氨基酸如精氨酸和組氨酸取代。
[0047] 作為示例，被修飾的牛a亞單位以如SEQ ID N0: 7、14至19和22中所示的序列被呈 現。本發明提供具有與SEQ ID N0:7、14至19和22中的任一個具有至少85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性的氨基 酸序列的被修飾糖蛋白。
[0048] 作為示例，被修飾的馬a亞單位以如SEQ ID N0:9、38至42和72-76中所示的序列被 呈現。本發明提供具有與SEQ ID N0:9、38至42和72-76的任一個具有至少85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性的氨基 酸序列的被修飾糖蛋白。
[0049] 作為示例，被修飾的綿羊a亞單位以如SEQ ID N0:8、46和79-80中所示的序列被呈 現。本發明提供具有與SEQ ID N0:8、46和79-80的任一個具有至少85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性的氨基酸序 列的被修飾糖蛋白。
[0050] 作為示例，被修飾的豬a亞單位以如SEQ ID N0:10、45和77-78中所示的序列被呈 現。本發明提供具有與SEQ ID勵：10、45和77-78的任一個具有至少85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性的氨基酸序 列的被修飾糖蛋白。
[0051 ] 作為示例，被修飾的犬a亞單位以如SEQ ID N0:48_49中所示的序列被呈現。本發 明提供具有與SEQ ID N0:48-49的任一個具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾 糖蛋白。
[0052] 作為示例，被修飾的貓a亞單位以如SEQ ID N0:51_52中所示的序列被呈現。本發 明提供具有與SEQ ID N0:51-52的任一個具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾 糖蛋白。
[0053]作為示例，被修飾的兔a亞單位以如SEQ ID N0:54中所示的序列被呈現。本發明提 供具有與SEQ ID N0:54具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾糖蛋白。
[0054]作為示例，被修飾的山羊a亞單位以如SEQ ID N0:56中所示的序列被呈現。本發明 提供具有與SEQ ID N0:56具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾糖蛋白。
[0055]作為示例，被修飾的負鼠a亞單位以如SEQ ID N0:58中所示的序列被呈現。本發明 提供具有與SEQ ID N0:58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾糖蛋白。
[0056]作為示例，被修飾的雞a亞單位以如SEQ ID N0:60中所示的序列被呈現。本發明提 供具有與SEQ ID N0:60具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾糖蛋白。
[0057]作為示例，被修飾的火雞a亞單位以如SEQ ID N0:62中所示的序列被呈現。本發明 提供具有與SEQ ID N0:62具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾糖蛋白。
[0058]作為示例，被修飾的鴕鳥a亞單位以如SEQ ID N0:64中所示的序列被呈現。本發明 提供具有與SEQ ID N0:64具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾糖蛋白。
[0059] 作為示例，被修飾的鯰魚a亞單位以如SEQ ID N0:66中所示的序列被呈現。本發明 提供具有與SEQ ID N0:66具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾糖蛋白。
[0060] 作為示例，被修飾的鯉魚a亞單位以如SEQ ID N0:68中所示的序列被呈現。本發明 提供具有與SEQ ID N0:68具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修飾糖蛋白。
[0061 ] 作為示例，被修飾的大馬哈魚a亞單位以如SEQ ID N0:70_71中所示的序列被呈 現。本發明提供具有與SEQ ID N0:70-71的任一個具有至少85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被 修飾糖蛋白。
[0062]可以通過與其它物種比較目標a亞單位的氨基酸序列以鑒定其它物種的蛋白質中 的相應基礎殘基，從而設計出進一步被修飾的a亞單位。美國專利6,361，992中公開了此類 方法，該專利的全部內容以引用方式并入本文中。還可以針對所選定的用于比較和取代的 物種，考慮來自不同物種的糖蛋白激素的相對生物學活性。此外，基于相關糖蛋白激素的結 構進行同源性建模可用于鑒定表面暴露出的氨基酸殘基。為了修飾附加的氨基酸位置，可 以利用標準的計算機軟件程序如DNASIS(Hitachi Software Engineering)或上面所列的 任一其它比對程序(包括但不限于LI0Nment、SIM和GCG程序如Gap、BestFit、FrameAlign和 Compare)來比對來自人和非人的糖蛋白激素序列。然后可以利用上述技術中的一種取代在 人和非人的糖蛋白激素之間有所不同的氨基酸殘基，并利用在此所提及的測定法中的一種 測定所得到的糖蛋白激素的效力。
[0063]因此，本發明還提供包含本文所述的被修飾的a亞單位的被修飾的FSH蛋白，其相 對于來自相同物種的野生型FSH具有增強的效力。
[0064] 本發明還提供包含本文所述的被修飾的a亞單位的被修飾的LH蛋白，其相對于來 自相同物種的野生型LH具有增強的效力。
[0065] 本發明還提供包含本文所述的被修飾的a亞單位的被修飾的TSH蛋白，其相對于來 自相同物種的野生型TSH具有增強的效力。
[0066] 本發明還提供包含本文所述的被修飾的a亞單位的被修飾的CG蛋白，其相對于來 自相同物種的野生型CG具有增強的效力。
[0067] 本發明還提供在動物中刺激糖蛋白激素受體的方法，其包括向所述動物施用被修 飾的糖蛋白激素，其中所述動物可以是任何物種。在一些實施方案中，所述動物可以是哺乳 動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但不限于人、牛、母牛、豬、馬、綿羊、羊駝、 白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、 馴鹿、水牛或牦牛。在一些實施方案中，所述動物可以是鳥類。在一些實施方案中，所述鳥類 可以包括但不限于雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍珠雞或鴕鳥。在一些實施方案中，所述動物可以 是魚類。在一些實施方案中，所述魚類可以包括但不限于鯉魚、大馬哈魚、羅非魚、鯰魚、鱸 魚、鯛或石斑魚。
[0068] 本發明還提供在動物中誘導超數排卵的方法，其包括向所述動物施用被修飾的糖 蛋白激素(例如，FSH類似物），其中所述動物可以是任何物種。在一些實施方案中，所述動物 可以是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但不限于人、牛、母牛、豬、馬、 綿羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、 美洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。在一些實施方案中，所述動物可以是鳥類。在一些實施方案 中，所述鳥類可以包括但不限于雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍珠雞或鴕鳥。在一些實施方案中， 所述動物可以是魚類。在一些實施方案中，所述魚類可以包括但不限于鯉魚、大馬哈魚、羅 非魚、鯰魚、?盧魚、鯛或石斑魚。
[0069] 本發明還提供在動物中促進天然或人工受精或者體外受精接著胚胎轉移的方法， 其包括向所述動物施用被修飾的糖蛋白激素(例如，FSH類似物），其中所述動物可以是任何 物種。在一些實施方案中，所述動物可以是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可 以包括但不限于人、牛、母牛、豬、馬、綿羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、虎、獅、熊 貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。在一些實施方案中，所述 動物可以是鳥類。在一些實施方案中，所述鳥類可以包括但不限于雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍 珠雞或鴕鳥。在一些實施方案中，所述動物可以是魚類。在一些實施方案中，所述魚類可以 包括但不限于鯉魚、大馬哈魚、羅非魚、鯰魚、自盧魚、鯛或石斑魚。
[0070] 本發明還提供在動物中治療不育癥的方法，其包括向所述動物施用被修飾的糖蛋 白激素(例如，FSH類似物），其中所述動物可以是任何物種。在一些實施方案中，所述動物可 以是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但不限于人、牛、母牛、豬、馬、綿 羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美 洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。在一些實施方案中，所述動物可以是鳥類。在一些實施方案中， 所述鳥類可以包括但不限于雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍珠雞或鴕鳥。在一些實施方案中，所述 動物可以是魚類。在一些實施方案中，所述魚類可以包括但不限于鯉魚、大馬哈魚、羅非魚、 鯰魚、?盧魚、鯛或石斑魚。
[0071] 本發明還提供改善動物的卵存儲的方法，其包括向所述動物施用被修飾的糖蛋白 激素(例如，FSH類似物），其中所述動物可以是任何物種。在一些實施方案中，所述動物可以 是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但不限于人、牛、母牛、豬、馬、綿 羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美 洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。在一些實施方案中，所述動物可以是鳥類。在一些實施方案中， 所述鳥類可以包括但不限于雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍珠雞或鴕鳥。在一些實施方案中，所述 動物可以是魚類。在一些實施方案中，所述魚類可以包括但不限于鯉魚、大馬哈魚、羅非魚、 鯰魚、?盧魚、鯛或石斑魚。
[0072] 本發明還提供在動物中防止胚胎胎兒損失的方法，其包括向所述動物施用被修飾 的糖蛋白激素(例如，LH類似物），其中所述動物可以是任何物種。在一些實施方案中，所述 動物可以是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但不限于人、牛、母牛、 豬、馬、綿羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天 竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。在一些實施方案中，所述動物可以是鳥類。在一些實施 方案中，所述鳥類可以包括但不限于雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍珠雞或鴕鳥。在一些實施方案 中，所述動物可以是魚類。在一些實施方案中，所述魚類可以包括但不限于鯉魚、大馬哈魚、 羅非魚、鯰魚、?盧魚、鯛或石斑魚。
[0073] 本發明還提供維持動物妊娠的方法，其包括向所述動物施用被修飾的糖蛋白激素 (例如，LH類似物），其中所述動物可以是可能懷孕的任何物種。在一些實施方案中，所述動 物可以是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但不限于人、牛、母牛、豬、 馬、綿羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺 鼠、美洲盤、兔、馴鹿、水牛或牦牛。
[0074] 本發明還提供在動物中治療隱睪病的方法，其包括向所述動物施用被修飾的糖蛋 白激素(例如，LH類似物），其中所述動物可以是可能受該病況影響的任何物種。在一些實施 方案中，所述動物可以是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但不限于 人、牛、母牛、豬、馬、綿羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大 額牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。
[0075] 本發明還提供在動物中治療性腺功能減退癥的方法，其包括向所述動物施用被修 飾的糖蛋白激素(例如，LH類似物），其中所述動物可以是可能受該病況影響的任何物種。在 一些實施方案中，所述動物可以是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但 不限于人、牛、母牛、豬、馬、綿羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、 驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。在一些實施方案中，所述動物可以 是鳥類。在一些實施方案中，所述鳥類可以包括但不限于雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍珠雞或鴕 鳥。在一些實施方案中，所述動物可以是魚類。在一些實施方案中，所述魚類可以包括但不 限于鯉魚、大馬哈魚、羅非魚、鯰魚、?盧魚、鯛或石斑魚。
[0076] 本發明還提供在動物中減少到發情的時間和同步發情的方法，其包括向所述動物 施用被修飾的糖蛋白激素(例如，CG類似物），其中所述動物可以是發情期的任何物種。在一 些實施方案中，所述動物可以是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但不 限于人、牛、母牛、豬、馬、綿羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、 驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。
[0077] 本發明還提供評估動物的代謝健康狀況的方法，其包括向所述動物施用被修飾的 糖蛋白激素(例如，TSH類似物），其中所述動物可以是任何物種。在一些實施方案中，所述動 物可以是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物可以包括但不限于人、牛、母牛、豬、 馬、綿羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺 鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。在一些實施方案中，所述動物可以是鳥類。在一些實施方 案中，所述鳥類可以包括但不限于雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍珠雞或鴕鳥。在一些實施方案 中，所述動物可以是魚類。在一些實施方案中，所述魚類可以包括但不限于鯉魚、大馬哈魚、 羅非魚、鯰魚、?盧魚、鯛或石斑魚。
[0078] 本發明還提供在動物中診斷和/或治療甲狀腺癌和/或其它癌癥的方法，其包括向 所述動物施用被修飾的糖蛋白激素(例如，TSH類似物），其中所述動物可以是可能受此類癌 癥影響的任何物種。在一些實施方案中，所述動物可以是哺乳動物。在一些實施方案中，所 述哺乳動物可以包括但不限于人、牛、母牛、豬、馬、綿羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、 鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛。在一些 實施方案中，所述動物可以是鳥類。在一些實施方案中，所述鳥類可以包括但不限于雞、鴨、 火雞、鵝、鴿子、珍珠雞或鴕鳥。在一些實施方案中，所述動物可以是魚類。在一些實施方案 中，所述魚類可以包括但不限于鯉魚、大馬哈魚、羅非魚、鯰魚、鱸魚、鯛或石斑魚。
[0079] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素(例如，FSH類似物)可用于獸類超數排卵 以及天然或人工受精或者體外受精，接著進行胚胎轉移。在一些物種(例如，人）中，被修飾 的糖蛋白激素可以用于治療患有不育癥的受試者和用于卵庫存(egg banking)。
[0080] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素（例如，LH類似物）可以用于防止獸類胚 胎胎兒損失和維持妊娠。在一些物種(例如，人）中，被修飾的糖蛋白激素可以用于在隱睪病 中促進睪丸下降，并且用于治療性腺功能減退癥。
[0081] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素（例如，CG類似物)可以用于在各種動物 中減少發情時間、同步發情或誘導發情，所述動物包括但不限于處女豬(virgin pig)、未發 情小母豬、發情小母豬、產后乏情或者斷奶后乏情的母豬、處于正常繁殖季節外的母羊和牛 胚胎轉移接受者。
[0082] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素(例如，TSH類似物)可以用于在所有物種 中診斷和/或治療甲狀腺癌和/或其它癌癥。
[0083]本發明還提供可以用于水產業中的試劑和方法。a單位中的插入和取代顯著地增 強了 FSH、TSH、CG和LH的活性。來自一個物種的被修飾的糖蛋白激素可以用于治療另一個物 種，具有顯著的異種促甲狀腺(heter〇thyr〇trop i c)效果。例如，一項研究表明，被修飾的人 TSH(TR-1401)和被修飾的人FSH(TR-4401)對于金魚的血漿T4水平具有顯著影響。參見 Mi 1ler等，Thyrotropic activity of recombinant human glycoprotein hormone analogsand pituitary mammalian gonadotropins in goldfish(Carassius auratus): Insights into the evolution of thyrotropin receptor specificity,General and Comparative Endocrinology, 166(2012), 70-75的圖5、表1和圖8。這一研究（其全部內容被 并入)也證明了被修飾的糖蛋白激素的廣泛潛在用途，因為源自一個物種的超激動劑可以 被用于其它物種(例如魚)并具有顯著效果。具體地說，不論源自魚還是源自其它物種的被 修飾的糖蛋白激素都可以用于促進魚的生長、改善繁殖以及維持和/或擴大魚的種群。
[0084] 本發明還提供可以用于保護瀕危物種的試劑和方法。由于被修飾的糖蛋白激素的 交叉-激活作用，因此來自一個動物物種(例如人或牛）的超激動劑可以被施用給另一個物 種(例如虎或獅），并具有顯著效果。因此，被修飾的糖蛋白激素可以用于促進瀕危物種的繁 殖和擴大瀕危物種的種群。
[0085] 本發明還涵蓋本文所述的類似物的片段，其具有超激動劑或拮抗劑活性。例如，本 發明的被修飾的a鏈的片段可以單獨使用，或者與片段或全長齡連組合使用，以產生超激動 劑化合物。在一些情況下，本發明的被修飾的a亞單位分子的片段還可以用作拮抗劑，例如， 以在施用糖蛋白激素治療劑后限制其活性的持續時間。
[0086] 本發明還提供編碼本文所述的被修飾的糖蛋白激素的核酸序列。本發明還提供編 碼具有保守氨基酸取代的多肽的核酸。分離的核酸可以編碼與上述標識的序列具有至少約 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的 序列同一性的蛋白質。分離的核酸可以編碼具有與由上述標識的登記號編碼的氨基酸序列 具有至少約 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽。編碼轉運體的分離的核酸可以雜交至上述 標識的核酸序列。
[0087] 編碼被修飾的糖蛋白激素蛋白質的核酸可以被遺傳融合至表達控制序列以進行 表達。合適的表達控制序列包括適用于靶宿主生物體的啟動子。對于來自原核和真核生物 體的不同宿主，此類啟動子是本領域技術人員眾所周知的且描述于文獻中。例如，此類啟動 子可以從天然存在的基因分離或可以是合成或嵌合啟動子。
[0088] 本發明還提供用于將編碼被修飾的糖蛋白激素蛋白質的核酸插入靶核酸分子如 載體中的表達盒(expression cassette)。出于該目的，該表達盒在5和3側提供有核苷 酸序列以促進在特定的序列位置的移除和插入，例如，限制酶識別位點或用于同源重組(例 如通過重組酶所催化)的靶序列。除了本發明的核酸分子或表達盒之外，該載體還可以含有 其它基因如標記基因，所述基因允許在合適的宿主細胞和在合適的條件下選擇所述載體。 通常，該載體還含有一個或多個復制起點。所述載體還可以包含終止序列以限制轉錄長度 超過編碼本發明的轉運體的核酸。
[0089] 有利地，所述載體中所含的核酸分子可操作地連接至表達控制序列，所述控制序 列允許在原核細胞或真核細胞中的表達，即保證可翻譯RNA的轉錄和合成。
[0090] 術語分離的是指從存在于大分子的天然來源中的其它細胞/組織成分(例如DNA或 RNA)分離的分子。本文使用的術語分離的還指當通過重組DNA技術產生時基本上無細胞材 料、病毒材料和培養基的核酸或肽，或當化學合成時基本上無化學前體或其它化學物質的 核酸或肽。而且，分離的核酸或肽可以包括不以片段天然存在且不以天然狀態被發現的核 酸或肽片段。
[0091] 術語質粒和載體可互換使用，因為質粒為最常用的載體形式。然而，本發明意在包 括表達載體的此類其它形式，其發揮等同功能且隨后在本領域變為已知。載體可以是多個 核酸的任一個，期望的序列可以通過限制和連接而插入所述核酸中以用于在不同遺傳環境 之間運輸或用于在宿主細胞中表達。載體通常由DNA組成，盡管RNA載體也是可用的。載體包 括但不限于質粒和噬菌粒。克隆載體是能在宿主細胞中復制的載體，且其特征進一步在于 一個或多個核酸內切酶限制位點，在這些位點所述載體可以可確定的方式被切割，且期望 的DNA序列可連接至這些位點中，使得新的重組載體保持其在宿主細胞中復制的能力。在質 粒的情況下，期望序列的復制可以由于質粒拷貝數在宿主細菌內增加而發生多次，或在宿 主通過有絲分裂復制前每個宿主僅發生一次。在噬菌體的情況下，復制可以在細胞溶解期 主動發生或在溶原期被動發生。
[0092] 載體可以進一步含有啟動子序列。啟動子可以包含通常位于編碼區上游的非翻譯 核酸序列，其含有引發核酸轉錄的位點。啟動子區還可以包含作為基因表達的調節物的其 它元件。在本發明的其它實施方案中，表達載體含有另外的區域以輔助選擇合并有表達載 體的細胞。啟動子序列經常在其3'端以轉錄起始位點為界(包含端點)且向上游(5'方向）延 伸以包括以背景之上可檢測到的水平引發轉錄所需的最小數量的堿基或元件。在啟動子序 列內將發現轉錄起始位點，以及負責RNA聚合酶結合的蛋白質結合域。真核啟動子經常，但 不總是，含有TATA盒和CAT盒。啟動子的激活對于某些細胞或組織可能是特異的，例如其通 過僅在某些組織中表達的轉錄因子，或啟動子可能是普遍存在的且能在大多數細胞或組織 中表達。
[0093] 載體可以進一步含有一個或多個適用于鑒別和選擇已用載體轉化或轉染的細胞 的標記序列。標記包括例如編碼增加或降低對抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白 質的基因，編碼其活性可通過本領域已知的標準測定檢測的酶(例如，半乳糖苷酶或堿性 磷酸酶)的基因，和明顯影響轉化或轉染的細胞、宿主、集落或噬斑的表型的基因。載體可以 是能自發復制和表達在它們可操作地接合的DNA片段中存在的結構基因產物的那些載體。 表達載體是這樣的載體，期望的核酸序列可以通過限制和連接而被插入該載體中，使得其 可操作地接合或可操作地連接至調節序列并且可以作為RNA轉錄物表達。表達是指內源性 基因、轉基因或編碼區在細胞中的轉錄和/或翻譯。
[0094] 當編碼序列和調節序列以將編碼序列的表達或轉錄置于調節序列的影響或控制 之下的方式共價連接時，所述編碼序列和調節序列可操作地結合。如果期望將編碼序列翻 譯為功能蛋白質，則認為兩個DNA序列可操作接合，條件是5 '調節序列中啟動子的誘導導致 編碼序列的轉錄且兩個DNA序列之間的連接性質不會（1)導致移碼突變的引入，（2)干擾啟 動子區引導編碼序列轉錄的能力，或(3)干擾相應的RNA轉錄物翻譯為蛋白質的能力。因此， 啟動子區將可操作接合至編碼序列，條件是啟動子區能實現該DNA序列的轉錄，使得所得轉 錄物可以翻譯為期望的蛋白質或多肽。
[0095] 本發明的一些方面包括核酸的轉化和/或轉染。轉化是將外源或異源核酸引入原 核細胞內部。轉染是將外源或異源核酸引入真核細胞內部。轉化性核酸或轉染性核酸可以 或可以不整合(共價連接)至構成細胞基因組的染色體DNA中。在原核生物中，例如，轉化性 核酸可以維持在附加型元件如質粒或病毒載體上。關于真核細胞，穩定轉染的細胞是其中 轉染性核酸已整合至染色體中使得它由子細胞通過染色體復制而被遺傳的細胞。該穩定性 通過真核細胞建立包含一群含轉染的核酸的子細胞的細胞系或克隆的能力而被證明。
[0096] 本領域技術人員已知多種用于表達核酸插入片段的大腸桿菌（E. col i， Escherichia coli)表達載體。其它適用的微生物宿主包括桿菌如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is )，和其它腸桿菌科(enterobacteriaceae)如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌 屬(Serratia)和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)種。在這些原核宿主中，也可以制備表達載 體，它通常含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如復制起點）。此外，可以存在任何數目 的各種眾所周知的啟動子，如乳酸啟動子系統、色氨酸(Trp)啟動子系統、內酰胺酶啟動 子系統或來自噬菌體A的啟動子系統。啟動子通常會任選地與操縱子序列一起控制表達，并 且具有例如用于啟動和完成轉錄和翻譯的核糖體結合位點序列。如果需要，可以通過在5' 且與下游核酸插入片段在框內插入Met密碼子來提供氨基末端的甲硫氨酸。并且，可以利用 標準的寡核苷酸誘變程序去除核酸插入片段中的羧基末端延伸。
[0097]另外，可以使用酵母表達。酵母表達系統具有幾個優點。首先，證據表明酵母分泌 系統中所產生的蛋白質展現正確的二硫鍵配對。其次，通過酵母分泌系統可以有效地實施 翻譯后的糖基化。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)前a因子原（pre-pro-alpha-factor)前導區（由MF"_1基因編碼）常規地用于指導酵母分泌蛋白質（Brake， Proc .Nat.Acad. Sci .，81:4642-4646(1984))。前a因子原前導區含有一個信號肽和一個包 含KEX2基因所編碼的酵母蛋白酶的識別序列的前片段(pro-segment):該酶在Lys-Arg二肽 裂解信號序列的羧基側裂解前體蛋白質。可以將FSH編碼序列與前a因子原前導區框內融 合。然后將該構建體置于強轉錄啟動子如醇脫氫酶I啟動子或糖酵解啟動子的控制之下。核 酸編碼序列之后是翻譯終止密碼子，之后是轉錄終止信號。或者，可以將核酸編碼序列與第 二蛋白質編碼序列如Sj26或0半乳糖苷酶融合，所述第二蛋白質可以用于促進通過親和色 譜來純化融合蛋白質。用于分離融合蛋白質組分的蛋白酶裂解位點的插入適用于用于在酵 母中表達的構建體。在桿狀病毒系統中也可以實現重組蛋白質的有效的翻譯后糖基化和表 達。
[0098] 哺乳動物細胞容許在有利于重要的翻譯后修飾的環境中表達蛋白質，所述修飾例 如折疊和半胱氨酸配對、添加復雜的碳水化合物結構以及分泌活性蛋白質。用于在哺乳動 物細胞內表達活性蛋白質的載體的特征在于在強病毒啟動子和多腺苷酸化信號之間插入 蛋白質編碼序列。載體可以含有賦予潮霉素(hygromycin)抗性、慶大霉素(gentamicin)抗 性，或其它適于用作選擇性標記的基因或表型，或甲氨蝶呤抗性以進行基因擴增的基因。可 以利用編碼甲氨蝶呤抗性的載體將嵌合蛋白質編碼序列引入到中國倉鼠卵巢(CH0)細胞系 內，或者利用合適的選擇標記將嵌合蛋白質編碼序列引入到其它細胞系內。可以通過DNA印 跡分析來確認載體DNA在被轉化細胞中的存在。可以通過RNA印跡分析來確認對應于插入片 段編碼序列的RNA的產生。本領域已經開發出大量能分泌完整人類蛋白質的其它適合的宿 主細胞系，且包括CH0細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、Jurkat細胞等。用于這些細胞的表 達載體可以包括表達控制序列如復制起點、啟動子、增強子，以及必需的信息加工位點如核 糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點和轉錄終止序列。示例性的表達控制序列是 源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒等的啟動子。可以通過眾所周知的方 法將含有目標核酸片段的載體轉移到宿主細胞內，所述方法根據細胞宿主的類型而改變。 例如，氯化鈣轉化常常被用于原核細胞，而磷酸鈣、DEAE葡聚糖或lipofectin介導的轉染或 電穿孔可以用于其它細胞宿主。
[0099] 可以采用用于在哺乳動物細胞內表達基因的替代載體，那些載體與被開發用于表 達人T干擾素、組織纖溶酶原激活劑、凝血因子VIII、乙型肝炎病毒表面抗原、蛋白酶連接 蛋白l(Nexin 1)和嗜酸性粒細胞主要堿性蛋白的載體相似。此外，載體可以包含可用于在 哺乳動物細胞(例如C0S-7)內表達所插入的核酸的CMV啟動子序列和多腺苷酸化信號。
[0100] 可以在體內或體外表達基因或雜合基因。體內合成包括轉化可以充當用于載體的 宿主細胞的原核或真核細胞。或者，可以在體外表達系統中進行基因表達。例如，可以商購 常規地用于合成相對大量的mRNA的體外轉錄系統。在此類體外轉錄系統中，將編碼糖蛋白 激素的核酸克隆到表達載體內鄰近于轉錄啟動子。例如，Bluescript II克隆和表達載體含 有多個側接原核強轉錄啟動子(Stratagene)的克隆位點。可以獲得含有從DNA模板體外合 成RNA所必需的所有試劑的試劑盒，如Bluescript載體(Stratagene)。然后可以在體外翻譯 由如上系統在體外所產生的RNA，以產生期望的糖蛋白激素(Stratagene)。
[0101] 產生糖蛋白激素的另一種方法是通過蛋白質化學技術將兩種肽或多肽連接在一 起。例如，利用目前可獲得的實驗室設備，利用Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)或Boc(叔丁氧基羰 基)化學(Applied Biosystems)可以化學合成肽或多肽。本領域技術人員可以容易地認識 到可以通過標準的化學反應合成對應于雜交糖蛋白激素的肽或多肽。例如，肽或多肽可以 被合成并且不將其從合成樹脂中裂解下來，而雜交肽的另一片段可以被合成并隨后從樹脂 中裂解下來，由此暴露出在另一片段上被官能封閉的末端基團。通過肽縮合反應，這兩個片 段可以分別在它們的羧基和氨基末端經由肽鍵共價地接合在一起，以形成雜交肽。(Grant， Synthetic Peptides：A UserGuide，W?H?Freeman(1992)和Bodansky，Principles of Peptide Synthesis，Springer_Verlag( 1993))。或者，如上所述可以體內獨立地合成肽或 多肽。一旦被分離，這些獨立的肽或多肽就可以經由相似的肽縮合反應連接以形成糖蛋白 激素。例如，所克隆的或合成的肽片段的酶的或化學的連接可以容許相對短的肽片段接合， 以產生更大的肽片段、多肽或完整的蛋白質結構域(Abrahmsen，Biochemistry，30 : 4151 (1991);Dawson，Science，266:776-779(1994))〇
[0102] 本發明的被修飾的糖蛋白激素可以是通過將編碼多肽的核酸克隆到能產生其多 肽片段的表達系統內所獲得的重組蛋白質。例如，可以確定被修飾的a亞單位的活性結構 域，其與0亞單位一起可以與糖蛋白激素受體相互作用并引起與糖蛋白激素相關的生物效 應。在一個示例中，可以刪除所發現的不會影響糖蛋白激素的活性或結合特異性或親和力 的氨基酸，且不會喪失相應的活性。
[0103] 例如，可以依次去除天然或修飾的糖蛋白激素中的氨基或羧基末端的氨基酸，并 在如上所述的多種可獲得的測定中的一種中測試相應的活性。在另一個示例中，可以用多 肽片段或其它部分(如生物素)代替本發明的被修飾蛋白質中的氨基末端或羧基末端或者 甚至所述激素的內在區域的一部分，所述多肽片段或其它部分可以有助于被修飾的糖蛋白 激素的純化。例如，可以通過將編碼兩個多肽片段的相應核酸克隆到表達載體內使得編碼 區的表達生成雜交多肽的肽化學，將被修飾的糖蛋白與麥芽糖結合蛋白融合。可以通過使 雜交多肽經過直鏈淀粉親和柱來親和純化所述雜交多肽，然后可以通過用特異的蛋白酶因 子Xa裂解雜交多肽，將被修飾的糖蛋白與麥芽糖結合區域分離開來。
[0104] 也可以直接地合成或者通過化學地或機械地破壞更大的糖蛋白激素來獲得本發 明的被修飾的糖蛋白激素分子的活性片段。活性片段被定義為源自天然存在的氨基酸序列 的至少約5個連續氨基酸的氨基酸序列，其具有相關的活性，例如結合或調節活性。無論是 否與其它的序列相連接，片段都還可以包含對具體區域或特定氨基酸殘基的插入、缺失、取 代或其它所選的修飾，只要肽的活性與被修飾的糖蛋白的活性相比沒有被顯著地改變或削 弱。這些修飾可以提供一些附加的性質，例如去除/添加能形成二硫鍵的氨基酸，增加其生 物壽命等。在任何情況中，肽都必須具備生物活性性質，如結合活性、調節結合域處的結合 等。通過對激素的特定區域的誘變，以及隨后的表達及對所表達多肽的測試，可以鑒定出糖 蛋白激素的功能的或活性的區域。此類方法對于本領域人員是顯而易見的，并且可以包括 對編碼受體的核酸的位點特異性誘變。
[0105] 本發明還涵蓋包含本文所述的突變的融合蛋白質和嵌合蛋白，例如包括與FSH糖 蛋白的融合物。此類融合蛋白質可以通過用本領域已知的方法在正確的編碼框中將編碼期 望的氨基酸序列的合適的核酸序列彼此連接并通過上面所述的任一手段表達所述融合蛋 白質而制得或者，此類融合蛋白質可以通過蛋白質合成技術，例如使用肽合成儀而制得。本 發明的單鏈類似物和嵌合蛋白質可以在所述嵌合蛋白質的a亞單位和0亞單位之間或在其 不同部分之間合并有肽接頭。
[0106] 糖蛋白激素超激動劑的表征
[0107] 本文所述的對野生型糖蛋白激素的一種或多種修飾的作用可以任何數量的方式 被確定。例如，可對用編碼被修飾的糖蛋白激素的核酸轉染的細胞內第二信使系統的變化 進行測量并且將其與用編碼野生型糖蛋白激素的核酸轉染的類似細胞比較。或者，被修飾 的糖蛋白激素的活性可以由受體結合測試、胸苷攝取測試、孕酮產生測試或T4分泌測試確 定。本領域技術人員可以容易地確定使用任何合適的測試來確定野生型或被修飾的糖蛋白 激素的活性。
[0108] 在本發明一個實施方案中，被修飾的糖蛋白激素具有的效力比野生型糖蛋白激素 的效力增強。該增強的效力可以通過上述任何技術或本領域技術人員容易確定的任何其它 合適的測試來評估。增強的效力在各測試之間或各細胞系之間不必一致，因為這些當然會 改變。
[0109] 在本發明另一實施方案中，被修飾的糖蛋白激素具有的最大功效相比野生型糖蛋 白激素的最大功效增加。該增加的最大功效可通過上述任何技術或本領域技術人員容易確 定的任何其它合適的測試來評估。該增加的最大功效在各測試之間或各細胞系之間不必一 致，因為這些當然會改變。
[0110]在PCT/US99/05908中描述了適用于表征本文所述的類似物的其它測定，其全部內 容以引用方式并入本文中。例如，可以使用各種免疫測定，包括但不限于利用例如下列技術 的競爭性和非競爭性測定系統:放射免疫測定、ELISA、等電點聚焦（IEF)測定、三明治免疫 測定、免疫放射測定法、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定法、原位免疫測定法、蛋白質印 跡法、沉淀反應法、凝集測定法、補體固定測定法、免疫熒光測定法、蛋白A測定法和免疫電 泳測定法等。
[0111] 例如，當0亞單位為FSH的0亞單位時，卵母細胞質量和數量的改善可以通過體外和 體內測試來評估。超活性FSH可以用于改善來自動物的卵母細胞的質量和數量，所述動物包 括但不限于，人、小鼠、大鼠、牛、母牛、豬、馬、棉羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、狗、 虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛、牦牛、雞、鴨、火雞、鵝、 鴿子、珍珠雞、鴕鳥、鯉魚、大馬哈魚、羅非魚、鯰魚、鱸魚、鯛和石斑魚。
[0112] 在一些實施方案中，將超活性FSH施用給人或任何動物。通常使用體外受精過程的 不同終點如卵母細胞形成、卵母細胞受精和胚泡形成來確定卵母細胞的質量和數量的改 善。體外受精實驗可以遵循"超數排卵方案"，其中用根據本發明的超活性FSH類似物治療受 試者，這導致多個卵母細胞的釋放和成熟。在體外受精實驗中，FSH(超活性FSH和重組野生 型FSH)可以與hCG-起被施用以觸發排卵。可以使用僅接受hCG或孕馬血清促性腺素(PMSG) 的對照動物。卵母細胞的質量可以通過增加動物中卵母細胞的受精率而改善。超活性促卵 泡激素的受精率可以通過比較使用超活性FSH達到的受精率與使用相同量的重組野生型 FSH實現的受精率在體內或體外確定。還可以使用接受hCG的對照動物。受精率可以通過所 發育的兩細胞胚胎占卵母細胞總數的百分比而測量。如果受精在體外發生，則兩細胞胚胎 可以在受精培養皿中計數。在小鼠中，兩細胞胚胎在受精后大約24小時發育。受精率基于所 施用的超活性FSH的量而改變。動物可以接受多劑量的超活性FSH。由于以對卵母細胞數量 而言的最大有效劑量施用超活性FSH，因此受精率增加了至少約10%。由于以對于卵母細胞 數量而言的最大有效劑量施用超活性FSH，因此受精率可以增加至少約20%，優選至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。
[0113] 超活性促卵泡激素可以通過改善每個受精卵母細胞的胚泡形成率而改善卵母細 胞的質量。胚泡形成率可以通過確定形成胚泡的兩細胞胚胎的百分比而測量。無論胚泡在 體內還是體外形成，胚泡形成率都增加。胚泡形成率取決于所施用的超活性促卵泡激素的 量。由于以對于卵母細胞數量而言的最大有效劑量施用超活性促卵泡激素，因此胚泡形成 率增加了至少約10%。由于以對于卵母細胞數量而言的最大有效劑量施用超活性FSH，因此 胚泡形成率可以增加至少約20 %，優選至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或 100%〇
[0114] 超活性促卵泡激素可以通過增加每個受精卵母細胞的胚胎總數而改善卵母細胞 的質量。無論受精在體內還是體外發生，每個受精卵母細胞的胚胎總數都增加。每個受精卵 母細胞的胚胎總數的增加取決于所施用的超活性促卵泡激素的量。由于以對于卵母細胞數 量而言的最大有效劑量施用超活性促卵泡激素，因此每個受精卵母細胞的胚胎總數增加了 至少約10%。由于以對于卵母細胞數量而言的最大有效劑量施用超活性FSH，因此每個受精 卵母細胞的胚胎總數可以增加至少約20%，優選至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%或 100%。
[0115] 在一些實施方案中，當0亞單位為CG的0亞單位時，有效的促黃體激素(LH)-狀活性 可以通過體外和體內生物測定來評估。超活性CG誘導排卵，延長黃體壽命，增加孕酮合成且 在某些物種中促進附屬黃體形成。此類作用導致更有效的卵母細胞收集、某些物種中卵母 細胞質量的增加、妊娠和妊娠維持率的增加。
[0116] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素(例如，FSH類似物)可以用于獸類超數排 卵以及天然或人工受精、或體外受精，接著進行胚胎轉移。在一些物種(例如，人）中，被修飾 的糖蛋白激素可以用于治療患有不育癥的受試者和用于卵庫存。可以通過對于超數排卵、 天然或人工受精、不育癥和卵存儲的作用來評估被修飾的糖蛋白激素的功效。
[0117] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素（例如，LH類似物)可以用于防止獸類胚 胎胎兒損失和維持妊娠。在一些物種(例如，人）中，被修飾的糖蛋白激素可以用于在隱睪病 中促進睪丸下降，并且用于治療性腺功能減退癥。可以通過對于胎兒損失、妊娠維持、隱睪 病中的睪丸下降和性腺功能低下的治療效果來評估被修飾的糖蛋白激素的功效。
[0118] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素（例如，CG類似物)可以用于在各種動物 中減少發情時間、同步發情或者誘導發情，所述動物包括但不限于處女豬、未發情小母豬、 發情小母豬、產后乏情或者斷奶后乏情的母豬、處于正常繁殖季節外的母羊和牛胚胎轉移 接受者。可以通過對于發情的時間和同步的作用來評估被修飾的糖蛋白激素的功效。
[0119] 在一些實施方案中，被修飾的糖蛋白激素(例如，TSH類似物)可以用于在所有物種 中診斷和/或治療甲狀腺癌和/或其它癌癥。可以通過對于此類診斷和治療的作用來評估被 修飾的糖蛋白激素的功效。
[0120] 具有增加的血清半衰期的糖蛋白激素類似物
[0121] 本發明的被修飾的糖蛋白激素蛋白質還可以被進一步地修飾，使得血漿半衰期相 比于野生型對應物的半衰期增加。本發明的被修飾的糖蛋白激素蛋白質可以進一步包含潛 在的糖基化位點，所述位點包括含N-糖基化和/或0-糖基化位點的序列。新糖基化位點可以 通過在野生型a亞單位的N-末端附近插入肽而引入。所述糖基化位點可以包括NXiTJXsSS NNX 3X4糖基化位點，其與野生型糖蛋白激素相比被引入a亞單位中，并且Xi、X2、X3和X4獨立地 為任何氨基酸。在一些實施方案中，XjPX2獨立地為V、I或A。在一些實施方案中，X3和X4獨立 地為T或S。在一些實施方案中，所述插入片段包含NXANXASNNXA糖基化位點。在一些實 施方案中，NXiKNXASNNXsX*糖基化位點中的至少一個氨基酸不是來自所述插入片段。在 一些實施方案中，兩個或更多個NXdSNXA糖基化位點被引入a亞單位中。在一些實施方案 中，兩個或更多個似"或似以糖基化位點被單一氨基酸分開，其中在一些實施方案中，所述 氨基酸是V或I。例如，所述糖基化位點可以包括NVT、NVTINVT、NIT、NITINIT、NNTT、NNTS、 NNSS或NNST。
[0122] 例如，將肽NVTIV(SEQ ID N0:1)或VNVTINVT(SEQ ID N0:20)置于a亞單位中提供a 亞單位的潛在糖基化位點。可以將SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 20的肽置于人野生型序列的 D3和Q5之間。可以將SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:20的肽置于牛、馬、豬和綿羊的野生型序列 的F6和T7之間。插入的肽在氨基端可以進一步包含另外的蘇氨酸殘基。插入以改變糖基化 的其它肽包括NV、INV和TNV肽，以及TNVTINV(SEQ ID N0:12)。如上所述，目標是向a亞單位 中引入諸如NVT的糖基化位點。在一些實施方案中，糖基化位點中的所有氨基酸都來自所述 插入片段。在一些實施方案中，糖基化位點中的至少一個氨基酸不是來自所述插入片段。例 如，糖激素的被修飾a亞單位可以包括在F6和T7之間NV的插入片段加上T7和T8之間INV的插 入片段（例如SEQ ID N0:38和39)，其將糖基化位點NVTINVT引入所述a亞單位中，但并非 NVTINVT中的所有氨基酸都來自所述插入片段。
[0123] 在一些實施方案中，所述糖基化位點可以包含重疊的序列子，諸如但不限于NNSS、 順1'1'、順了3和順33(參見例如3￡〇10勵:72-80)。例如，對于源自野生型馬€[亞單位的被修飾 的糖蛋白激素，SEQ ID N0:72-76中的蛋白質序列包含NNTT(SEQ ID N0:72和73)、NNST(SEQ ID N0:74)、NNSS(SEQ ID N0:75)或NNTS(SEQ ID N0:76)糖基化位點，其中所述糖基化位點 的氨基酸可以是或可以不是所述插入片段的一部分。對于源自野生型豬a亞單位的被修飾 的糖蛋白激素，SEQ ID N0:77和78的蛋白質序列可以包含NNTT，其中對于SEQ ID N0:77,所 述插入序列是F6和T7之間的NNTT，并且對于SEQ ID N0:78,所述插入序列是F6和T7之間的 NNTT。此外，作為示例，源自野生型綿羊a亞單位的被修飾的糖蛋白激素（SEQ ID N0: 79和 80)可以包含NNTT位點。將NNX3X4位點引入a亞單位的插入片段中可以插入野生型亞單位的N 末端附近。例如，NNT、NNS、NNTT或NNTS可以插入野生型馬、豬或綿羊a亞單位的F6和T7之間。
[0124] 增加的半衰期還可以通過其它合適的化學基團的聚乙二醇化或綴合或通過構造 具有增加的半衰期的融合蛋白質或通過任何其它方法而提供。此類方法是本領域已知的， 例如描述于美國專利5,612,034、美國專利6,225,449和美國專利6,555,660中，這些美國專 利中的每一個的全部內容以引用方式并入。
[0125] 還可以通過增加分子內的帶負電荷殘基的數目（例如谷氨酸和/或天冬氨酸殘基 的數目）來增加半衰期。可以通過定點誘變來實現此類改變。還可以通過向被修飾的糖蛋白 激素蛋白質中插入含有一個或多個帶負電荷殘基的氨基酸序列來實現此類改變。
[0126] 蛋白質的半衰期是蛋白質穩定性的量度，且表明蛋白質濃度降低一半所需的時 間。可以通過適于測量來自受試者的樣品中隨時間而變化的激素水平的任何方法來確定本 文所述的被修飾的糖蛋白激素蛋白質的血清半衰期，所述方法例如但不限于利用抗體的免 疫測定法以測量在施用被修飾的糖蛋白激素蛋白質后一段時間所獲取的血清樣品中的水 平，或者通過檢測從施用標記的糖蛋白激素后的受試者獲取的血清樣品中的標記的激素分 子，即放射性標記的分子。
[0127] 治療方法
[0128] 本發明的被修飾的糖蛋白激素蛋白質可以用于治療任何與糖蛋白激素活性相關 的病況。本發明的被修飾的糖蛋白激素蛋白質可以用于治療有此需要的受試者。受試者可 以是動物，諸如但不限于哺乳動物、爬行動物、魚、鳥和兩棲動物。受試者可以是哺乳動物， 諸如但不限于牛、母牛、豬、馬、綿羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑 馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛和牦牛。動物包括家畜和家養寵物，如 貓和狗。受試者可以是需要改善的糖蛋白激素活性的人患者或動物。與糖蛋白激素活性相 關的病況是完全或部分由改變了的糖蛋白激素響應性所引起的病況，或者能從施用糖蛋白 激素中獲益的病況。例如，此類病況包括但不限于排卵功能障礙、黃體期缺陷、原因不明的 不育癥、雄性因素的不育癥、限時懷孕、FSH受體低表達、FSH受體低敏感性、FSH受體結合缺 陷、FSH受體偶聯缺陷、低睪酮產生、男性型脫發癥和垂體衰竭或損傷。
[0129] 例如，可以通過向動物施用本文所述的超活性FSH類似物來改善卵母細胞的數量 和質量。例如，
【申請人】已驚奇地發現通過施用含有被修飾的a亞單位的超活性FSH，獲得了卵 母細胞的數量和質量的顯著增加。可以通過增加超活性FSH的FSH血清半衰期來進一步增強 超活性FSH對卵母細胞的數量和質量的作用。可以通過進一步修飾超活性FSH來增加FSH血 清半衰期。可以利用進一步的修飾(包括但不限于前面所述的那些修飾)來增加FSH血清半 衰期。
[0130] 也可以在男性或女性受試者的輔助生殖的治療方案中使用本發明的被修飾的 FSH、CG、LH或TSH糖蛋白激素蛋白質，包括向所述受試者施用輔助量的被修飾的糖蛋白激素 蛋白質。在此類方法中，類似物可以單獨地施用或與其它治療劑組合施用，其它治療劑例如 包括但不限于檸檬酸氯米芬（Clomiphene citrate )和GnRH(促性腺激素釋放激素 (gonotropin releasing hormone))。本發明的被修飾的糖蛋白激素蛋白質可以作為一種 或多種糖蛋白的組合被施用。例如，被修飾的a亞單位可以與FS耶亞單位、CG0亞單位、TS邸 亞單位和/或L耶亞單位一起或分開組合，然后將被修飾的糖蛋白施用給受試者。例如，在患 有單一性促性腺激素缺陷癥（IGD)的受試者中，可以向所述受試者施用被修飾的FSH、CG、 TSH和LH，以恢復正常的性腺功能。本領域眾所周知的是，糖蛋白激素（例如FSH、CG、TSH和 LH)在雌性生殖生理中是一個整體，且可以向受試者施用這些糖蛋白激素以克服大量的生 殖病癥并由此輔助生殖。
[0131] 針對被修飾的馬CG糖蛋白測試單一和多重注射給藥方案。對于在小鼠、大鼠、牛、 母牛、豬、馬、綿羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山 羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、水牛或牦牛中使用馬eCG類似物的超刺激，其中使用單一或2: 1分次eCG類似物注射。eCG類似物的劑量范圍研究包括單一肌內注射30、45、60、75、90、105 和120mcg。優化的劑量以2:1比例測試，且任選的第二分次劑量將與第6天或另一日期的 PGF2a治療一致。在小鼠、大鼠、牛、母牛、豬、馬、綿羊、羊駝、白臀野牛、野牛、駱駝、貓、鹿、 狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美洲駝、兔、馴鹿、7K牛或牦牛中用被修飾 的eCG治療產生超數排卵。
[0132] 本領域技術人員可以容易地確定施用糖蛋白激素的有效量，這將取決于諸如體 重、體格、具體病況的嚴重度和受試者本身的類型等因素。可以通過常規的優化方法容易地 確定治療有效量。本發明提供相對于野生型糖蛋白激素具有增加的效力的糖蛋白激素。這 些被修飾的糖蛋白激素將允許本領域技術人員相對于野生型糖蛋白激素施用更低劑量的 被修飾的糖蛋白激素，以獲得相似的治療效果，或者施用劑量與野生型糖蛋白激素相似的 劑量的被修飾的糖蛋白激素，以獲得增加的治療效果。
[0133] 取決于是以口服、腸胃外還是以其它方式施用糖蛋白激素，所施用的前列腺素可 以是固體、半固體形式或液體劑型的形式，如例如片劑、丸劑、膠囊、粉末、液體、乳膏和懸浮 液等，優選地是適用于遞送精確劑量的單位劑型。糖蛋白激素可以包括與藥學上可接受的 載體組合的有效量的所選的糖蛋白激素，另外還可以包括其它的藥劑、藥物、載體、佐劑、稀 釋劑等。"藥學上可接受的"意指不是生物學或其它方面不期望的物質，即該物質可以與所 選的糖蛋白激素一起向個體施用且不引起不可接受的生物效應或不以不可接受的方式與 糖蛋白激素相互作用。制備此類劑型的實際方法對于本領域人員是已知的或者是顯而易見 的；例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences，最新版(Mack Publishing)。
[0134] 提供以下實施例以描述和說明本發明。因此它們不應被理解為限制本發明的范 圍。本領域技術人員將完全理解許多其它實施方案也落在如上文和權利要求中所描述的本 發明的范圍內。
[0135] 實施例
[0136] a亞單位類似物的設計
[0137] 在Q13R+E14R+P16R+Q20R(人4R)具有對a-亞單位的修飾且具有野生型亞單位的 人FSH超激動劑糖蛋白與其野生型對應物相比顯示顯著的結合優越性。
[0138] 表1顯示人a野生型(WT)和所選的hFSH超激動劑一級氨基酸結構的比較。顯示了人 a野生型的N-端部分(總計92個殘基的氨基酸殘基1-28)和突變形式的N-端部分。4個超激動 劑精氨酸(R)取代的位置在陰影區。引入一個或兩個另外的N-連接的碳水化合物鏈的所選4 個不同插入片段在野生型序列的氨基酸D3和Q5之間被標記。
[0139] 表1.
[0141] 表1 中的片段如下所列：SEQ ID N0:43:hFSH WT;SEQ ID N0:33，hFSHa(4R);SEQ ID N0:34，hFSHa(4R+Insl);SEQ ID N0:35，hFSHa(4R+Ins2);SEQ ID N0:36，hFSHa(4R+ Ins3)；SEQ ID NO:37,hFSHa(4R+Ins4)〇
[0142] 在一些實施方案中牛FSH(bFSH)取代高度類似于人FSHa亞單位中之前誘變處理的 殘基且包括5個突變的組合，稱為"5礦（1(151?+1(171?+￡181?+1(201?+1(241〇。例如5￡0 10勵:7。為 了增加引入的糖基化識別序列(NXil^NXsS)導致N-連接的碳水化合物鏈的附接的可能性， 建立18種不同的牛a亞單位構建物并且將其克隆至之前開發的表達載體中。12種構建物含 有N-端延伸肽序列
[0143] 表2顯示牛a野生型(WT)和所選的bFSH超激動劑一級氨基酸結構的比較。顯示了牛 a野生型的N-端部分(總計96個殘基的氨基酸殘基1-32)和突變的牛a的N-端部分。5個超激 動劑精氨酸(R)或賴氨酸(K)取代的位置在氨基酸C14和P25之間的陰影區被標記，編碼為4R + 1K的5R。引入一個或兩個另外的N-連接的碳水化合物鏈的所選4個不同插入片段在野生型 序列的氨基酸F6和T8之間被標記。
[0144] 表2中的片段如下所列：SEQ ID N0:44，WT bFSH;SEQ ID N0:23，bFSHa(5R);SEQ ID N0:24，bFSHa(4R+lK);SEQ ID N0:25，bFSHa(5R+Ins 1);SEQ ID N0:26，bFSHa(5R+ Ins2);SEQ ID N0:27，bFSHa(5R+Ins3);SEQ ID N0:28，bFSHa(5R+Ins4);SEQ ID N0:29， bFSHa(4R+lK+Ins 1);SEQ ID N0:30，bFSHa(4R+lK+Ins2);SEQ ID N0:31，bFSHa(4R+lK+ Ins3);SEQ ID N0:32，bFSHa(4R+lK+Ins4)。
[0145] 表2
[0147] 還產生了包含突變的馬糖蛋白a亞單位，且一些實施方案包含K15R、E18R、K20R和 K24R的取代。例如SEQ ID N0:9;SEQ ID N0:38-40。此外，還產生了具有K15R、E18H、K20R和 K24R的馬糖蛋白a亞單位(例如SEQ ID N0:41;SEQ ID N0:42)。這些突變的a亞單位還含有 所述亞單位的F6和T7之間的NVTINV的插入片段(例如SEQ ID N0:9、40和42)，或F6和T7之間 插入片段加上了7和了8之間的1爾插入片段(例如3￡〇10從):38、39和41)。
[0148] 相比基于lipofectamine的方法，使用聚乙稀亞胺(PEI)瞬時轉染bFSH類似物導致 bFSH類似物表達的3.7-4.5倍增加(數據未顯示）。基于雜二聚體-特異的ELISA的各種FSH類 似物的表達水平表明沒有FSH二聚體形成的重大損失，且不支持單鏈構建物是實現高水平 表達所必需的之前聲明。
[0149]瞬時表達的bFSH類似物的選擇包括基于cAMP的體外生物測定和PK篩選測定(參見 圖1和2)。相比豬FSH(pFSH-F〇Htr〇piii⑧-V)和bFSH對照，具有5R取代的bFSH的效力有顯著 的3-4倍增加（圖1A)。顯然，不同于許多之前的研究（圖lB)(Heik 〇pp，Eur.J.Bi〇Chem 261: 81-84，1999;Trousdale，Fertil ? Steril ? 91:265-270，2009)，已發現新穎的新糖基化插入 片段不降低牛FSH 5R類似物的體外生物活性（圖1C)。在N-端添加的相同的新糖基化位點降 低bFSH的體外生物活性，這類似于新糖基化對紅細胞生成素的固有活性的衰減作用 (Elliott,Exp.Hematol.32:1146-1155,2004；E1liott,Nat.Biotechno1.21:4144-421, 2003;Sinclair，J.Pharm. Sci .94:1626-1635，2005)和許多其它延長半衰期方法(包括定點 聚乙二醇化）的作用（Fishburn，J.Pharm. Sci ? 97:4167-4183，2008;Uchiyama，Vet ? J. 184: 208-211，2010)。在小鼠中兩天的PK篩選研究表明，相比bFSH-WT和F:dltr〇;pill?-V而言所有 新糖基化的牛FSH"5R"類似物都具有增加的終末半衰期（圖2A和2B)。來自PK篩選測定的數 據表明，相比bFSH-WT、F〇lltr〇f)ili?-V和TR4401對照，由于在一個或兩個引入的新糖基化位 點（插入片段1和2)的糖基化，因此血漿半衰期得到了大大地延長。觀察到的水平與具有29 個氨基酸接頭和4-5個0-連接的碳水化合物鏈的bFSH-單鏈分子相當。作為組合的超激動劑 和新糖基化插入片段制得的兩種初始測試的類似物(稱為"插入片段1和2"）具有與單獨的 5R超激動劑對照相當的體外生物活性（圖1C)，且仍然在小鼠中具有延長的半衰期（圖2B)。 此類長效且不減少超激動劑活性的類似物是之前沒有的，且在牛體內轉化為預期的引人矚 目的性能。
[0150] 使用燒瓶、振動器、滾瓶和生物反應器利用CH0細胞重組產生(rFSH或rTSH)幾百毫 克不同的人FSH和TSH。在初始工作期間，將雙順反子逆轉錄病毒載體系統優化以用于在 CH0-DG44細胞中高水平表達FSH和TSH類似物。測試了人rFSH制劑。單一 60yg劑量的rFSH誘 導卵泡發育，產生大量良好質量的胚胎，其與之前優化的8次Folltropin?-v(300mg)的注射 (每天施用兩次，歷時4天)匹配，這進一步支持其獨特的性質如肌內注射后延遲的吸收，以 及增加的FSH受體停留時間。參見圖3和5-8。10邱劑量的rFSH超激動劑顯示超常的能力來募 集生長卵泡和在12天內維持其增強的匯聚，特別是3-5_尺寸范圍的卵泡，已知它們在人體 中也具有低FSH受體數量(數據未顯示hrFSH出人意料地增強和支持小卵泡，這在之前優化 的對照F〇lltr〇piii?-V的給藥中沒有觀察到，其提供了一種新的方式以在周期的任意階段 募集FSH響應性卵泡以及在多個由降低的FSH受體數目或功能引起的差的響應者中增強成 功IVF和超數排卵的潛能（Perez Mayorga，J. Clin .Endocrinology 152:3268-3369,2000; Levallet，Arch.Med.Red.30:486-494,1999;Rannikko，Mol.Hum.Reprod.8:311-317，2002; Cai，Feril. Steril. 87:1350-1356，2007)。然而，由于在具有4個精氨酸取代的基于牛FSH的 a亞單位和基于人FSH的a亞單位之間存在40個氨基酸的差異，因此在相同的牛中觀察到一 些來自之前用rFSH治療的后續效應，這與之前的數據研究一致，之前的數據研究顯示人FSH 在兔和獼猴中的免疫原性性質（Cai，Int.J. Toxicol .30:153-161，2011 ;De Castro， Theriogenology 72:655-662,2009)〇
[0151]之前已顯示將精氨酸(R)或賴氨酸(K)殘基引入通常的a-亞單位的所選修飾許可 區在進化過程中能調節糖蛋白激素的活性(Szkudlinski，Nat.Biotechnol. 14:1257-1263， 1996; Szkudlinski，Physiol. Rev. 82:473-502，2002)，且在與位于糖蛋白激素受體的鉸鏈 區的帶負電荷群簇的靜電相互作用方面起了重要作用（Mueller，Trends Endocrinol.Metab.21:111-122,2010；Mueller,J.Biol.Chem.284:16317-16324,2009； Mueller，Endocrinol. 152:3268-3278,2011)。特異的 bFSH 超激動劑開發包括對4-5R和 / 或K 的最小取代以產生更有效力和更有功效的分子，該分子具有可能的延遲吸收以增加作用持 續時間，如本文數據以及其它對hFSH和其它糖蛋白激素類似物的研究所示（Szkudl inski， Physiol. Rev. 82:473-502，2002)。還研究了最小長度氨基酸插入片段，其含有一個或兩個 碳水化合物新糖基化位點以增加半衰期來產生單一注入類似物而不降低所增加的超激動 劑效力/功效(參見圖4)。對于進一步的分析，可以使用含有位于野生型序列的氨基酸6和8 之間的肽插入片段NVTINV、NVTINVT、NV和NVT的8種構建物。如本文的數據所示且不同于之 前的新糖基化和聚乙二醇化研究（Trousdale，Feril ? Steril ? 91:265-270，2009;Uchiyama， Vet J.184:208-211，2010;Perlman，J.Clin.Endocrinol.Metab.88:3227-3235,2003)，可 設計最小長度的氨基酸插入片段，其含有復雜的碳水化合物以增加半衰期而不降低所增加 的超激動劑效力/功效。這些新穎的類似物可以通過使用優化的高表達系統方法使用PEI和 滾瓶在CH0-K1細胞中瞬時轉染而表達。
[0152]通過瞬時轉染表達的所選4-6種類似物的純化可以通過以下進行:使用捕捉步驟 使用SP Sepharose柱，然后使用Mono Q離子交換色譜法選擇類似物，然后使用凝膠過濾進 行最終精制(polishing) AFSH類似物的純度可以大于98%。累積回收可達50%，且具有總 共50倍純化。所有類似物都可以通過ELI SA免疫測定、使用CH0-FSHR細胞系的穩健體外cAMP 生物測定、SDS-PAGE電泳和等電點聚焦(IEF)凝膠分析而進行體外表征。所選的純化類似物 還可以通過嚴格定量通過反相HPLC、碳水化合物組成分析以及穩定性和聚集狀態評估而分 析。
[0153] 其它實驗產生了牛FSH類似物TR55601(a亞單位:SEQ ID N0:7)，其包含在a亞單位 的151(、171(、181(、201(和241(取代為精氨酸(1〇以及在€[亞單位的6?和71'之間的附1'1爾(3￡0 10 N0:1)插入片段。生成了幾個批次的TR55601且使用IEF和蛋白質印跡分析進行測試。圖3A-D 顯示該分析的示例性結果。圖3A-3D部分證實TR55601/批次4和批次5展示最佳分布且驗證 了突變在該批次的有效性。在動物治療中使用批次4和5以及具有類似篩選結果的批次。例 如，在圖3A-C中，IEF-蛋白質印跡分析顯示了批次4和批次5的TR56001的優化酸性亞型。另 一方面，如圖3A和3C中所示，批次3未被完全驗證且未用于動物治療中。還利用PK篩選測定 在小鼠中對bFSH類似物且特別是TR55601的樣品進行了研究。對小鼠皮下注射所選的bFSH 樣品且在注射后24、32和48小時獲取血樣。分離血漿且用&?311￡1134(￡11(10(^111 6 Technologies公司）分析。利用PK篩選測定確認TR55601樣品的批次4的延長的半衰期。數據 未顯不。
[0154] 所選候選類似物的完全藥代動力學分布可以通過皮下施用單劑量的lOiig/大鼠且 在跨越分布期和消除期兩者的1 〇個不同的血液收集時間（1、5、15、30min和1、2、6、24和48h) 進行。牛FSH血漿水平可以在血漿中使用bFSH-ELISA定量。可以進行完全的PK分析。
[0155] 選擇類似物以用于構建雙順反子表達載體，且在CH0-DG44細胞中選擇和擴增類似 物表達為在牛中進行大規模生產、純化和超數排卵研究做準備。將CH0-DHFR(-)DG44細胞與 所述表達載體共轉染且在含有逐步增加的甲氨蝶呤(MTX)的培養基中進行基因擴增。細胞 在恢復它們的多邊形形態后（2-3周）有資格用于隨后的擴增步驟。分泌水平>2pg/細胞/天 的克隆可以進行第二次處理，旨在擴增GS標記基因(MSX)。可以獲得額外的2-5倍增加，達到 高達l〇pg/細胞/天的分泌水平。
[0156] 使用a亞單位類似物的制備和實驗
[0157] 盡管在單一肌內（I.M.)注射后rFSH誘導超數排卵響應，且60yg似乎非常接近最佳 劑量，但當母牛暴露于rFSH三次或更多次時，超數排卵響應顯著降低。因此，設計實驗以檢 測一種新的rFSH制劑，稱為TR 55601rFSH，其包含具有"5R"取代和在F6和T7之間的NVTINV 插入片段的a亞單位(SEQ ID N0:7)。目的是首先確定用rFSH單一或分次劑量治療在肉用母 牛中誘導超數排卵響應的效果，然后進一步評價單一注射rFSH的超數排卵響應和確定當母 牛暴露于rFSH兩次或三次時超數排卵響應是否保持較高。
[0158] 在大鼠體內使用經典Steelman-Pohley FSH生物測定分析TR55601FSH樣品 (Steelman等人，Endocrinol ? 53:604-616，1953)。對雌性Sprague-Dawley大鼠（200_220g) 注射單一劑量的補充有40IU hCG的測試制品（例如bFSH)或媒介物。在給藥后72小時測量卵 巢重量。參見圖4。各組用hCG治療以提供基線。TR55601bFSH在所有濃度均顯著增加卵巢重 量。
[0159] 圖5顯示超數排卵、誘導排卵和固定時間人工受精的卵泡波同步方案，其中 Folltropin-VR(Bioniche)的8次注射用單次或兩次注射TR55601代替。治療包括在第0天插 入釋放孕酮(P4)的陰道內設備和施用苯甲酸雌二醇(BE)。利用作為單一或兩次注射給予的 TR55601在第4天開始超數排卵治療。第二分次劑量注射與PGF 24^療在第6天同時發生。在第 7天最后注射FSH后去除孕酮設備。在第8天供體接受豬LH且在12h和24h后在沒有發情期檢 測的情況下受精，或在第8天受精一次(pLH后16h)。在第15天非手術地收集卵細胞/胚胎(2， 3) jolltropin-V?用作對照;在8次肌內（IM)注射中給予總共300mg*，每天兩次，歷時4天 (mg*_基于高度不純的NIH-FSH-P1參照標準）。
[0160]具體地說，基于之前的胚胎產生史將30只非泌乳Red Angus母牛分層且分組，并隨 機分配至三個治療組之一。對照組(n=10)中的母牛接受300mg Folltropin-V，每天兩次以 逐漸降低劑量的方案肌內施用，歷經4天的周期。具體地：第4天，3.0mL(am和pm);第5天， 2? 5mL(am和pm);第6天，1 ? 5mL(am和pm);和第7天，0? 5mL(am和pm) dFSH 60iig治療組中的母 牛接受單一肌內注射60yg rFSH，且rFSH 40-20yg治療組中的母牛在第4天接受肌內注射40 yg rFSH，然后在第6天再肌內注射20yg rFSH。
[0161] 然后，30只母牛中的25只再用Folltropin-V(對照）或單一注射60ygrFSH進行超刺 激。對照組(n= 10)中的動物保持在對照組中，且實驗1中以rFSH 60yg治療的10只母牛中的 8只再通過單一肌內注射rFSH而治療。而且，之前用分次-單一注射rFSH治療的10只母牛中 的7只用單一肌內注射rFSH治療。胚胎收集之間的間隔為29天。
[0162] 第二實驗中使用的25只母牛中的24只再用Folltropin-V(對照）或單一注射60yg rFSH進行超刺激。同樣，對照母牛保持在對照組中且rFSH母牛保持在rFSH組中。胚胎收集之 間的間隔為30天。
[0163] 在第0天(實驗開始），所有動物均接受5mg雌二醇-170加上50mg孕酮和充滿孕酮的 陰道內設備(Cue_Mate，Bioniche Animal Health)。在第4天(卵泡波出現的預期天），所有 母牛根據上述組進行超刺激。單一肌內注射rFSH的60yg劑量構成了 7.5mL，且Fo 11 tropin-V 以降低劑量的方案在8次肌內注射中施用。所有動物均在第6天早上和晚上肌內接受500yg 氯前列醇(Cyclase，Syntex，Argentina) Xue-Mate在第6天晚上移除。在第8天早上，母牛接 受lOOyg戈那瑞林（gonadorelin)(Gonasyn，Syntex Argentina)且在 12和24小時后受精。所 有母牛均用來自同一公牛的冷凍精液受精。卵細胞/胚胎在第15天非手術收集且根據IETS 推薦進行評價。
[0164] 所有母牛均在第0天、第4天、第6天和第8天超聲檢查CL的存在以及卵泡尺寸和數 量且確定卵泡生長概況。在第15天通過超聲波檢查和直腸觸診計數CL和直徑>10mm的卵泡 的數量而確認排卵響應。
[0165] 在各實驗中，首先評價數據點的正態性和方差齊性。因為方差在組間不同，所以通 過平方根轉換數據且通過單因素AN0VA進行分析。將通過雙因素AN0VA對三次實驗得出結論 后的總體響應進行分析以檢測實驗次數和治療以及它們的相互作用的作用。通過受保護的 LSD測試比較平均值。通過MIXED程序分析卵泡數據以檢測治療、天數和它們的相互作用對 卵泡數和生長概況的作用。所有分析均使用Infostat Analytical軟件（Universidad Nacional de Cordoba，Argentina)進行。
[0166] 超數排卵響應和卵細胞/胚胎數據匯總于表3中。盡管在卵細胞/胚胎收集當天CL 和具有< 2CL的母牛的平均數在組間沒有差異，但分次-注射的rFSH導致更高(P〈0.05)數量 的未排卵卵泡。總卵細胞/胚胎、受精的卵細胞和可轉移胚胎(1、2和3級）的平均數也沒有差 異。
[0167] 表3顯示使用單一或分次-單一劑量的TR55601(rFSH)的超數排卵。
[0168] 表3:在用單一 (60yg)或分次-單一 (40-20yg)肌內注射的rFSH(TR55601)或以每天 兩次肌內注射給予的300mg F〇lltr〇Pin?-V(對照）治療4天的肉用母牛中，黃體(CL)、直徑〉 10mm的卵泡、在卵細胞/胚胎收集時具有< 2CL的母牛的數量、卵細胞/胚胎的數量、受精的 卵細胞的數量和1、2和3級胚胎(可轉移胚胎）的數量的平均（±SEM)數。
[0170] 第二次給藥的超數排卵響應和卵細胞/胚胎數據匯總于表4和5中。在卵細胞/胚胎 收集當天CL、>10mm的卵泡和具有< 2CL的母牛的平均數在組間沒有差異。總卵細胞/胚胎、 受精的卵細胞和可轉移胚胎(1、2和3級）的平均數在組間也沒有差異。
[0171] 表4和5顯示使用單一施用TR55601(rFSH)的超數排卵。
[0172] 表4.CL、直徑>10mm的卵泡和在卵細胞/胚胎收集時具有< 2CL的母牛的數量的平 均（土SEM)數。母牛用單一（60yg)肌內注射的rFSH或以每天兩次肌內注射給予的300mg Fo 11 tr op i n_V (對照）治療4d。
[0174] 表5.在用單一（60yg)肌內注射的rFSH(TR55601)或以每天兩次肌內注射的300mg Folltropin-V*8^對照)治療4天的肉用母牛中，卵細胞/胚胎、受精的卵細胞和1、2和3級胚 胎(可轉移胚胎）的數目的平均（土 SEM)數。
[0176] 對于最終給藥實驗，此時僅可得到卵泡數據。在受精前那天的卵泡生長概況和卵 泡數在rFSH組和Folltropin-V組之間沒有顯著差異。排卵和卵細胞/胚胎數據不久即可得 到且將對實驗3單獨呈現，然后與實驗1和2組合。可得到實驗3的卵泡數據且已將其與實驗1 和2的數據組合并呈現在表6中。
[0177] 表6顯示以30天的間隔使用TR55601(rFSH)的三次超數排卵。
[0178] 表6.在用單一 (60yg)或分次-單一 (40-20yg)肌內注射的rFSH(TR55601)或以每天 兩次肌內注射給予的300mg Fo 11 tropin-V(對照）治療4天的肉用母牛中，CL、直徑> 10mm的 卵泡、在卵細胞/胚胎收集時具有< 2CL的母牛的數量、卵細胞/胚胎的數量、受精的卵細胞 的數量和1、2和3級胚胎(可轉移胚胎）的數量的平均（±SEM)數。母牛以~30天間隔連續治 療三次(組合3次實驗）。
[0180]從治療開始直到緊接人工受精之前的卵泡特征示于表7和圖6-9中。
[0181] 表7顯示非泌乳母牛在超數排卵模型中的卵泡數。卵泡發育(平均值土SEM)通過超 聲波檢查肉用母牛而檢測，所述肉用母牛用通過單一肌內注射給予的60yg rFSH或每天兩 次肌內注射給予的300mg Fol ltropin?-V治療4天。
[0182] 表7.
[0184] 直徑3至5mm的卵泡數在治療組間沒有差異（圖6)。直徑6至8mm的卵泡的數量（圖 7)、>9mm的卵泡的數量(圖8)或在歷經所述治療天數的平均卵泡直徑（圖9)也沒有差異。
[0185] 該系列實驗中所得的結果可以被解釋為表明rFSH產物誘導的肉用母牛的超數排 卵響應與Folltropin-V的沒有不同。當母牛被連續治療三次時，相比Folltropin-V，超數排 卵響應也沒有下降的跡象。最終給藥中的超數排卵響應似乎類似于前兩次給藥，這將在卵 細胞/胚胎收集后得到確認。對于用rFSH治療的母牛中更大量的未排卵（>10mm)卵泡（主要 是由于兩頭母牛中存在大量的未排卵的卵泡)存在關注，這需要進一步研究。還需要更多研 究來確定使肉牛和奶牛超數排卵的rFSH最佳劑量和確定用rFSH連續治療三次以上的長期 效果。
[0186] 插入片段對改善的半衰期的特異性
[0187] 為了確定觀察到的改善的半衰期是否對SEQ ID NO: 1插入片段的序列特異，對具 有該插入片段的人a亞單位進行修飾以去除氨基終末纈氨酸。然后將這兩者與缺少該插入 片段的類似物一起測試它們產生cAMP的能力。研究顯示該插入片段是序列特異的且賦予a 亞單位優異的結合和半衰期(參見圖10)。然后在各種生長條件下檢查產生條件以針對最大 產生進行優化(參見表8)。
[0188] 表8顯示人a亞單位的產生的優化。
[0190] 然后將該插入片段與牛的對應物一起進行檢查，且確認增加的半衰期是插入片段 的序列所特異的(參見圖11)
[0191] 示例性eCG類似物
[0192] 基于野生型馬亞單位構建突變的馬a亞單位樣品。使用所述突變的馬a亞單位產生 功能性eCG。下表9顯示所述馬a亞單位中的取代(用下劃線標記)和插入(用下劃線和斜體標 記）。基于所述突變a亞單位的eCG類似物被標記為類似物2號、3號和4號。
[0193] 表9
[0194]
[0195] 使用eCG的LH受體測定
[0196] 進行實驗以檢查馬CG類似物對于表達黃體化激素(LH)受體的細胞的作用。
[0197] 圖12顯示在表達嚙齒動物LH受體的293細胞中通過野生型馬CG和突變的馬CG進行 cAMP刺激3小時。具體地說，在刺激前24小時將CHO-rLHR細胞平鋪于96孔板中。然后將所述 細胞與稀釋于補充有ImM異丁基甲基黃嘌呤（IBMX)的生長培養基中的不同濃度的eCG制備 物和陰性對照Gonal-F(純化的人FSH)在37°C孵育3小時。通過商品化cAMP ELISA(cAMP EIA Kit，Cayman Chemical)測量培養基中積累的cAMP。使用CH0-K1細胞中的瞬時轉染產生所有 類似物。使用馬CG Elisa(Endocrine Technologies)確定使用來自EMD Millipore的 Centriprep YM-10，10kDa過濾的培養基中的類似物濃度。通過使用偏磷酸的pH分餾法和兩 步乙醇沉淀獲得PMSG(妊娠母馬血清促性腺激素，馬CG)。
[0198] 圖13顯示基于在表達大鼠LH受體(rLHR)的MLTC-1細胞中的孕酮刺激的eCG類似物 (2號、3號和4號）的體外LH生物活性。具體地說，在刺激前24小時將MLTC-1-rLHR細胞平鋪于 96孔板中。然后將所述細胞與稀釋于補充有ImM異丁基甲基黃嘌呤（IBMX)的生長培養基中 的不同濃度的eCG制備物和陰性對照Gonal-F(人FSH)在37 °C孵育6小時。通過商品化孕酮 ELISA(EIA Kit,DRG Instruments)測量培養基中積累的孕酮。使用CH0-K1細胞中的瞬時轉 染產生所有類似物。使用馬CG Elisa(Endocrine Technologies公司）確定使用來自EMD 皿;1111。〇^的〇6111：1^。代。￥11-10，101^^過濾的培養基中的類似物濃度。計算生物活性與免 疫反應性之比(B/1)并與對照PMSG制備物的B/1比較。
[0199] 如圖12-13中所示，野生型馬CG和突變的馬CG能夠激活嚙齒動物LH受體。圖12-13 還顯示包含在15、18、20和24位置處的取代的突變的馬CG與野生型馬CG和PMSG相比展示增 強的生物活性。
[0200] 使用eCG的FSH受體測定
[0201 ]進行實驗以檢查馬CG類似物對于表達促卵泡激素(FSH)受體的細胞的作用。
[0202] 圖14顯示基于在穩定表達野生型人FSH受體(hFSHR)的CH0細胞中的cAMP刺激的 eCG類似物(2號、3號和4號）的體外FSH生物活性。通過使用偏磷酸的pH分餾法和兩步乙醇沉 淀獲得PMSG(妊娠母馬血清促性腺激素，馬CG)。具體地說，在刺激前24小時將CH〇-hFSHR細 胞平鋪于96孔板中。然后將所述細胞與稀釋于補充有ImM異丁基甲基黃嘌呤（IBMX)的生長 培養基中的不同濃度的eCG制備物和對照Gonal-F(高度純化的人FSH)在37 °C孵育2小時。通 過商品化cAMP ELISA(cAMP EIA Kit,Cayman Chemical)測量培養基中積累的孕酮。使用 CH0-K1細胞中的瞬時轉染產生所有類似物。使用馬CG Elisa(Endocrine Technologies)確 定使用來自EMD Millipore的Centriprep YM-10, lOkDa過濾的培養基中的類似物濃度。 [0203] 如圖14中所示，野生型馬CG和突變的馬CG能夠激活人FSH受體。圖14還顯示包含在 15、18、20和24位置處的被取代的突變的馬06與野生型馬06和?1^6相比展示增強的生物活 性。
【主權項】
1. 一種被修飾的糖蛋白激素，其包含在α亞單位的α-Ll環中具有至少一個堿性氨基酸 取代并且在所述α亞單位的Ν-末端附近具有一個或多個插入片段的氨基酸序列，其中與野 生型糖蛋白激素相比所述插入片段向所述α亞單位中引入NXlNXASNNXsX*糖基化位點， 并且Χι、X 2、X3和X4獨立地為任何氨基酸。2. 根據權利要求1所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述插入片段中的每一個均包含 NXdSNXA，并且XjPX2獨立地為除脯氨酸以外的任何氨基酸。3. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述插入片段中的每 一個均包含ΝΧιΤ。4. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述插入片段在所述 野生型糖蛋白激素 α亞單位的F6和T7之間，并且所述野生型糖蛋白選自由SEQ ID NO: 2、3、 4、5、47和50組成的組。5. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中存在單一插入片段并 且所述插入片段是似"丫似:且丫為V或I。6. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述插入片段是 NVTINV(SEQ ID Ν0:1)〇7. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中XdPX2獨立地為V、I或 Α〇8. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述插入片段向所述 α亞單位中引入兩個ΝΧιΤ糖基化位點。9. 根據權利要求8所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述兩個N&T糖基化位點由單一氨 基酸V或I分開。10. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述插入片段中的 每一個均包含NN并且X3和X4獨立地為T或S。11. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中Χ3Χ4為ΤΤ、TS、ST或 SS〇12. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述 NNX3X4糖基化中的至少一個氨基酸不是所述插入片段的一部分。13. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15、17、18、20或24氨基酸位置處包含至少一個堿性氨基酸取代。14. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15、17、18、20或24氨基酸位置處包含至少兩個堿性氨基酸取代。15. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15、17、18、20或24氨基酸位置處包含至少三個堿性氨基酸取代。16. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15、17、18、20或24氨基酸位置處包含至少四個堿性氨基酸取代。17. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15、17、18、20和24氨基酸位置處包含五個堿性氨基酸取代。18. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K或24K氨基酸位置處包含至少一個堿性氨基酸取 代，其中所述野生型糖蛋白激素 α亞單位具有選自SEQ ID N0:2、3、4、5、47、50、53、55、57、 59、61、63、67和69的氨基酸序列。19. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K或24K氨基酸位置處包含至少兩個堿性氨基酸取 代，其中所述野生型糖蛋白激素 α亞單位具有選自SEQ ID Ν0:2、3、4、5、47、50、53、55、57、 59、61、63、67和69的氨基酸序列。20. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K或24K氨基酸位置處包含至少三個堿性氨基酸取 代，其中所述野生型糖蛋白激素 α亞單位具有選自SEQ ID Ν0:2、3、4、5、47、50、53、55、57、 59、61、63、67和69的氨基酸序列。21. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K或24K氨基酸位置處包含至少四個堿性氨基酸取 代，其中所述野生型糖蛋白激素 α亞單位具有選自SEQ ID Ν0:2、3、4、5、47、50、53、55、57、 59、61、63、67和69的氨基酸序列。22. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K和24K氨基酸位置處包含五個堿性氨基酸取代，其 中所述野生型糖蛋白激素 α亞單位具有選自SEQ ID勵:2、3、4、5、47、50、53、55、57、67和69 的氨基酸序列。23. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的15K、17K/17G/17L、18K/18E和24K氨基酸位置處包含四個堿性氨基酸取代，其中所 述野生型糖蛋白激素 α亞單位具有選自SEQ ID ΝΟ:59、61和63的氨基酸序列。24. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亞單位的12Κ、14Κ、15Ε、17Ν和21Κ氨基酸位置處包含五個堿性氨基酸取代，其中所述野生型 糖蛋白激素 α亞單位具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列。25. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其進一步包含黃體化激 素(LH)的β亞單位。26. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其進一步包含絨毛膜促 性腺素(CG)的β亞單位。27. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其進一步包含促卵泡激 素(FSH)的β亞單位。28. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其進一步包含甲狀腺刺 激激素(TSH)的β亞單位。29. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述堿性氨基酸是 精氨酸。30. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述α亞單位源自哺 乳動物α亞單位。31. 根據權利要求30所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述α亞單位源自人、牛、犬、貓、 馬、豬、綿羊、虎、獅、熊貓、負鼠或兔α亞單位。32. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述α亞單位源自鳥 類α亞單位。33. 根據前述權利要求中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素，其中所述α亞單位源自魚 類α亞單位。34. -種用于在動物中刺激糖蛋白激素受體的方法，其包括向所述動物施用權利要求 1-33中任一項所述的被修飾的糖蛋白激素。35. 根據權利要求34所述的方法，其中所述動物是哺乳動物。36. 根據權利要求35所述的方法，其中所述哺乳動物是牛、豬、馬、綿羊、羊駝、白臀野 牛、野牛、胳盤、貓、鹿、狗、虎、獅、熊貓、斑馬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、美洲盤、兔、馴鹿、水 牛或牦牛。37. 根據權利要求34所述的方法，其中所述動物是鳥類。38. 根據權利要求37所述的方法，其中所述鳥類是雞、鴨、火雞、鵝、鴿子、珍珠雞或鴕 鳥。39. 根據權利要求34所述的方法，其中所述動物是魚類。40. 根據權利要求39所述的方法，其中所述魚類是鯉魚、大馬哈魚、羅非魚、鯰魚、鱸魚、 鯛或石斑魚。
【文檔編號】A61K38/16GK105873602SQ201480071711
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年11月5日
【發明人】M·斯庫德林斯基, B·D·溫特勞布
【申請人】特洛佛根股份有限公司