一種單鏈抗體修飾的靶向微泡超聲造影劑的制備方法
【專利摘要】本發明屬于醫學領域，涉及一種單鏈抗體修飾的靶向脂質微泡超聲造影劑及其制備方法。所述的制備方法為先制備馬來酰亞胺化的脂質體；以還原劑打開抗體的二硫鍵形成暴露巰基的單鏈抗體；再將單鏈抗體鏈接于脂質體表面形成靶向脂質體；最后通過機械振蕩法制備靶向微泡超聲造影劑。本發明所公開的方法能有效提高靶向微泡超聲造影劑的產出率，在本發明報道及相關的靶向微泡超聲造影劑產業化過程中具有重要的應用前景。
【專利說明】
一種單鏈抗體修飾的靶向微泡超聲造影劑的制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及超聲分子影像學和生物醫學工程領域，具體地涉及一種單鏈抗體修飾的脂質微泡超聲造影劑的制備方法。
技術背景
[0002]超聲分子影像即是將靶向微泡造影劑作為分子探針，以超聲造影為成像模式，對活體生物化學過程進行細胞和分子水平上的定性和定量研究的分子影像學方法，可超聲診斷的準確性和敏感性，在心血管、炎癥性、腫瘤等疾病領域具有重要的應用前景。其中，靶向的超聲分子探針是超聲分子影像技術的關鍵。目前文獻報道的超聲分子探針以微泡超聲造影劑為主:將特異性的配體(抗體、多肽、核酸片段、小分子等)連接在微泡造影劑表面，造影劑進入血循環后與靶部位受體分子特異性結合并積聚，使目標組織在超聲成像中得到特異性的“標記”增強，實現在分子水平對靶點進行選擇性成像。
[0003]對于靶向微泡超聲造影劑，目前連接配體的方式有三種:
[0004]第一，生物素-親和素法。該方法利用生物素分別修飾微泡超聲造影劑和抗體，再以親和素將二者鏈接形成靶向微泡。由于具有免疫原性，該類型靶向微泡難以進入臨床，僅適用于基礎性實驗研究。
[0005]第二，共價連接法。此法將PEG-磷脂的活化羧基與配體分子(多肽)的氨基結合形成酰胺鍵。該方法安全穩定，但制備過程相對復雜。
[0006]第三種方法為硫醇-馬來酰亞胺法。用還原劑打開雙鏈抗體鏈接的二硫鍵，形成巰基暴露的單鏈抗體后，直接鏈接于馬來酰亞胺基修飾的脂質微泡上形成靶向微泡。該方法簡單直接，既不改變抗體的抗原識別位點(Fab段)，保留抗體對靶點的識別能力，又不需對抗體進行特別修飾，是目前最有應用前景的鏈接方式。
[0007]然而，脂質微泡單層磷脂膜包裹氣體的結構并不穩定，在水溶液中容易聚集融合及破裂，而應力作用(如血液循環、離心分離等)能加速微泡的破壞。傳統制備靶向微泡的方法為先制備微泡，再鏈接抗體，需要對樣品進行多次離心(去除反應過程中的過量材料和中間產物)，容易引起微泡大量破壞，影響最終靶向微泡的產出率。
[0008]事實上，先鏈接配體，再制備微泡的方法并非首次出現。如專利號為CN101637613.B的中國專利。該專利公開了先通過多肽的氨基與合成脂質羧基通過酰胺鍵鏈接，再制備微泡，獲得靶向脂質微泡造影劑。然而，用于作為靶向功能的多肽一般為短肽，分子量一般低于3kDa，先鏈接多肽并不會影響微泡的形成。相比于多肽，抗體的分子量則150kDa-1000kDa，為多肽的幾十上百倍。鏈接的配體分子量越大，對微泡形成的干擾越大。因此，此前無人采用先鏈接抗體，在制備微泡的方法。
[0009]為了克服上述缺點，提高靶向抗體產出率，減少微泡不穩定性造成的損失，現對傳統制備革G向微泡的硫醇-馬來酰亞胺法進行改進，改變抗體的連接工藝，提高革G向微泡的制備效能。此前，在靶向脂質微泡造影劑的制備領域，從未出現過先鏈接抗體在制備微泡的制備方式。
【發明內容】
[0010]本發明的目的在于針對現有靶向超聲造影劑產出效率低的缺陷，提出一種基于硫醇-馬來酰亞胺法，鏈接抗體的改良方法，制備出高產出率的靶向微泡超聲造影劑。
[0011 ]本發明的另一目的在于提供上述靶向微泡超聲造影劑的制備方法。
[0012]本發明通過以下技術方案來實現上述目的:
[0013]本發明提供了一種單鏈抗體修飾的靶向微泡超聲造影劑的制備方法，具體包括如下步驟:
[0014]S1.以磷脂成分為膜材料，通過薄膜-水化法制備馬來酰亞胺化的脂質體，具體如下:
[0015]Sll.將磷脂粉末在加熱條件下(40?80°C)完全溶解在氯仿中。
[0016]S12.將Sll制備的溶液旋轉蒸發至氯仿完全揮發。旋蒸溫度為25?80°C，轉速為60?240rpm，利用負壓蒸發將氯仿完全揮發，在圓底燒瓶中形成磷脂薄膜。
[0017]S13.在S12制備的磷脂薄膜中加入水化液，在搖床中恒溫水化，獲得脂質體溶液。
[0018]所述的水化液為雙蒸水、氯化鈉溶液或PBS，優選地，氯化鈉溶液的濃度為0.9%。
[0019]作為一個選優是實施方法，步驟S13獲得脂質體溶液需用孔徑為400nm的水性針頭濾器(Polyethersulf one，聚醚砜膜)過濾除雜。
[0020]步驟Sll中的磷脂含有DSPE-PEG2000-maleimide(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺)，或者優選地還含有DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)、DPPA(二棕櫚酰磷脂酸)中的一種或兩種；進一步優選地，為DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maIeimidS者組合。
[0021]優先地，DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimide的質量分數比為7:l:l?3;進一步地，更為優選DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maIeimide質量分數比為7:1:2。
[0022]步驟S13中的搖床溫度為37?65°C，搖床轉速為60?180rpm，水化時間為0.5?2h。
[0023]S2.以還原劑MEA為主要試劑，打開鏈接于抗體雙鏈分子間二硫鍵，制備單鏈的抗體分子。
[0024]具體地，步驟S2中所述單鏈抗體是參考由文獻[Chen G,Chen W，Wu Z,Yuan R,LiH,Gao J1Shuai X.MR1-visible polymeric vector bearing CD3single chain antibodyfor gene delivery to T cells for immunosuppress1n.B1materials.2009；30(10):1962-1970.]所報道的方法，先將抗體用含0.5M EDTA的PBS溶液稀釋至濃度為0.2ygAiL;將MEA溶于含0.5M EDTA的I3BS溶液中，使MEA的濃度為1.5M;將上述兩種溶液以1:10的體積比混合，在37°C水浴鍋中孵育90min。隨后將溶液用含0.5M EDTA的I3BS溶液超濾洗滌三次，獲得單鏈抗體。
[0025]步驟S2中所述的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、天然抗體片段、重組抗體片段和多特異性抗體中的任意一種，并且要具有雙鏈結構的抗體。抗體沒有進行還原前，抗體重鏈和輕鏈通過二硫鍵鏈接在一起，還原后，二硫鍵打開，暴露巰基。暴露的巰基的單鏈抗體需馬上進行下一步反應，防止打開的二硫鍵又重新結合，形成雙鏈抗體。
[0026]該方法制備的單鏈抗體分子既保留了抗原識別位點Fab段，而且含暴露的活性巰基
[0027]S3.在SI得到的馬來酰亞胺化脂質體與S2獲得的單鏈抗體分子孵育，從而獲得單鏈抗體修飾的靶向脂質體;具體包括如下步驟:
[0028]S31.將SI制得的馬來酰亞胺化脂質體溶液與S2制備的單鏈抗體共同孵育。
[0029]S32.用超濾管以PBS超濾離心洗滌三次，加入PBS重懸并定容為后獲得靶向脂質體。
[0030]步驟S31中，馬來酰亞胺化脂質體溶液與單鏈抗體的質量百分比為100?1000:1;優選質量比250:1。孵育時間為I?24h，孵育溫度為4?37 V ;優選地，孵育時間為8h，孵育溫度為4°C。
[0031]步驟S31中，孵育時無需向反應液中添加其他的試劑，在室溫下也可進行孵育，操作步驟簡單。
[0032]步驟S32中，超濾管的分子量為1，000，000麗0(:，超濾離心轉速為1000?4000印111，
溫度為4?25 °C，每次超濾時間為0.5?2h。
[0033]優選地，步驟S32中，超濾離心轉速為3000rpm，溫度為4°C，每次超濾時間為lh。
[0034]S4.向S3獲得的靶向脂質體通入氣體，然后進行高速機械振蕩制備微泡混懸液，隨后離心分離微泡，并以PBS重懸(此步驟重復3次)，即可獲得靶向微泡超聲造影劑。
[0035]步驟S4中所述氣體可以包括，例如，空氣;氮氣;氧氣；二氧化碳;氫氣;氧化亞氮；稀有氣體或惰性氣體;低分子量烴，如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷或異戊烷)、環烷烴(例如環丁烷或環戊烷)、烯烴(例如丙烯、丁烯或異丁烯)或炔烴(例如乙炔)；鹵化氣體，如氟化氣體，例如鹵化、氟化或全氟化低分子量烴;或任意這些前述物質的混合物中的一種。
[0036]優選氟化氣體，尤其是全氟化氣體，例如CF4、C2F6、C3F8、C4FsiPC4F1。
[0037]在本發明優選的實施例中，通入的氣體為C3F8。
[0038]步驟S4中高速機械振蕩可以是超聲振蕩或機械剪切，可采用的儀器有機械剪切機、超聲儀，銀汞調和器等；進一步地，振蕩頻率為40?80Hz，優選67Hz ;振蕩時間為10?10s，優選35?65s ；更優選為45s ；
[0039]步驟S4中的離心分離微泡的轉速為500?3000rpm，離心時間為I?20min。更優選地，離心分離微泡的轉速為2000rpm，離心時間為5min。
[0040]在制備以抗體為配體的靶向超聲微泡造影劑，先鏈接抗體，再制備微泡的方法為首次出現。但在制備以多肽為配體的靶向超聲微泡造影劑時，已存在先鏈接多肽，再制備微泡的方法，如專利號為CN 101637613B和CN 103230605A的中國專利。然而，靶向多肽一般為短肽，如:KGDS (賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)、RGDS (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)或RGDyk(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-絲氨酸-賴氨酸)。多肽的分子量較小，一般低于3kDa，而抗體的分子量則為多肽的上百倍(單克隆抗體150-180kDa，多克隆抗體700-1OOOkDa)，且抗體還具有三級結構，較短肽結構復雜。分子量越大，對微泡的粒徑、脂質體和微泡的結構影響也越大。因此，此前，在采用抗體制備靶向微泡造影劑時，無人采用先鏈接抗體在制備微泡的方法。
[0041]經本研究發現，在本發明的條件下，先鏈接抗體再制備微泡，可獲得高產和高質的靶向脂質微泡造影劑。以多肽作為靶向配體時，多肽的氨基與磷脂的羧基結合成酰胺鍵時，需添加縮合劑和催化劑，而在本方案中，以單鏈抗體作為靶向配體，單鏈抗體有暴露的活性巰基，能直接與脂質體表面的馬來酰亞胺基反應，反應過程及條件簡單，無需添加催化劑等，也不需對抗體進行額外的修飾。
[0042]本方案中，震蕩時間直接影響靶向脂質微泡的濃度。當震蕩時間低于35s時，難于形成較高濃度的MBkam-1。當震蕩時間為35?65s時，MBkam-1的濃度可以達到107bubbles/mL以上;尤其是當震蕩時間超過45 s后，MBicam-1的產出率呈較高的穩定狀態，，制備出的靶向微泡大小適宜，粒徑分布均一(見圖5)。
[0043]相比于以抗體作為靶向配體的傳統制備方法，本發明方法的有益效果是:
[0044]傳統的靶向微泡超聲造影劑的制備方法都是將離心除雜(未結合的抗體、中間反應小分子等)程序放在靶向微泡制備后的階段，導致微泡受到大量破壞。本發明的方法將離心除雜程序都放在中間產物相對穩定的靶向脂質體制備步驟，且最大程度減少微泡離心次數。本發明的離心次數為3次，傳統方法為至少6次。通過改良抗體連接的方法，本發明靶向微泡的最終產出率高于傳統方法的4-5倍。
[0045]同時本發明方法制備的單鏈抗體修飾微泡超聲造影劑，還具有以下優勢:
[0046]1.因單鏈抗體分子量比雙鏈抗體小，鏈接單鏈抗體后前后，微泡粒徑無明顯改變，能減少抗體對脂質體或微泡結構、性能的影響;在本發明的一實施例中，鏈接抗體前后微泡的粒徑分別為 1076.1±118.511111，1183.7±106.811111，二者差別無統計學意義(？>0.05)。
[0047]2.單鏈抗體有暴露的活性巰基，能直接與脂質體表面的馬來酰亞胺基反應，反應過程及條件簡單，不需要對抗體進行額外的修飾。
[0048]3.單鏈抗體保留雙鏈抗體的抗原識別位點Fab段，保證了微泡超聲造影劑的靶向特異性。
[0049]4.即使在低濃度的情況下，也可以保持高效的成像效果。
[0050]5.抗體與脂質體的鏈接率高，為99%以上，且微泡穩定高。
【附圖說明】
[0051 ]圖1.共聚焦顯微鏡觀察本發明“新方法”和“傳統方法”制備的靶向微泡超聲造影劑的單鏈抗體鏈接情況。其中DiI表示紅色熒光標記的微泡，FITC表示綠色熒光二抗標記的單鏈抗體。(比例尺:20μηι)
[0052]圖2.流式細胞計數法定量分析“新方法”和“傳統方法”制備靶向微泡超聲造影劑的單鏈抗體鏈接率:(A)綠色熒光二抗標記靶向微泡的分布；(B)兩種方法鏈接單鏈抗體的陽性率。
[0053]圖3.不同方法對靶向微泡超聲造影劑終產物濃度的檢測
[0054](A) “新方法”制備的靶向微泡超聲造影劑的鏡下形態；
[0055](B) “傳統方法”制備的靶向微泡超聲造影劑的鏡下形態。(比例尺:20μπι)
[0056](C)終產物的大體外觀，其中左側EP管為“新方法”，右側EP管為“傳統方法”；
[0057](D)兩種方法制備靶向微泡的終產物濃度定量結果。
[0058]圖4體外超聲造影成像觀察不同方法制備靶向微泡超聲造影劑在稀釋1000倍后的成像效能，其中對照組為未連接單鏈抗體的非靶向微泡超聲造影劑。
[0059]圖5不同的振蕩時間對微泡濃度的影響:
[0060](A)不同振蕩時間制備靶向微泡終產物的大體外觀。
[0061](B)不同振蕩時間制備靶向微泡終產物濃度的定量分析。
【具體實施方式】
[0062]以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案，具體實施例不代表對本發明保護范圍的限制。其他人根據本發明理念所做出的一些非本質的修改和調整仍屬于本發明的保護范圍。
[0063]為了敘述方便，本發明所述先制備靶向脂質體再制備靶向微泡超聲造影劑的方法簡稱為“新方法”；傳統先制備微泡超聲造影劑再鏈接抗體的方法簡稱為“傳統方法”。
[0064]實施例1:以新方法制備靶向微泡超聲造影劑
[0065]按7:1:2的質量分數比稱量磷脂粉末DPPC、DPPA、DSPE-PEG2_-maleimide共20mg并置于小燒杯中，加入氯仿4mL。在水浴鍋中加熱到50°C，用玻棒攪拌至磷脂完全溶解;隨后將磷脂氯仿溶液轉移至容積為50mL的圓底燒瓶中。在旋轉蒸發儀上(水浴溫度為50 °C、轉速為120rpm)將氯仿完全揮發，在圓底燒瓶底部形成磷脂薄膜。在圓底燒瓶中加入水化液(PBS)，用保鮮膜與橡皮筋封口，在60 0C、120rpm的恒溫搖床中水化45min，獲得脂質體溶液。用孔徑為400nm的水性針頭濾器(Polyethersulf one，聚醚砜膜)過濾后即可獲得馬來酰亞胺化的脂質體(mal-liposome)。
[0066]以文獻[ChenG, Chen ff ,Wu Z ,Yuan R, Li H, Gao J , Shuai X.MR1-visiblepolymeric vector bearing CD3 single chain antibody for gene delivery to Tcells for immunosuppress1n.B1materials.2009;30( 10): 1962-1970.]所報道的方法制備單鏈抗體(single chain antibody，scAb)。具體地:將1yL濃度為lyg/yL的兔抗大鼠ICAM-1 (intercellular adhers1n mo I ecu Ie-1，細胞間粘附因子-1)多克隆抗體以 40yLPBS稀釋，然后加入1yL 0.5M的EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)溶液，定義為溶液A。將60mg MEA溶解于500yL PBS中，并加入1yL 0.5M的EDTA，定義為溶液B ο將溶液A和溶液B混合，37 0C水浴孵育90min。用濃度為1mM的EDTA的PBS溶液超濾3次(超濾管分子量為100，000，轉速為3000印111，每次超濾時間為81^11)，獲得1041-1的80413，簡稱ScICAM-10
[0067]將上述步驟中獲得的scICAM-1與mal-liposome在容積為5mL的離心管中于4°C冰箱中孵育過夜。次日用PBS超濾離心洗滌三次(超濾管分子量為I，000，000，轉速為3000rpm，每次超濾時間為lh)，用PBS重懸并定容為0.5mL及獲得scICAM-1標記的脂質體，簡稱liposomeicAM-1。將0.5mL liposomeicAM-1轉移至容積為1.5mL的EP管中，用1mL注射器抽取C3F8,將EP管中的空氣置換成C3F8。隨后將EP管置于銀汞調和器中，以67Hz的頻率振蕩45s形成乳白色液體。室溫下靜置1min后，以2000rpm的速度離心1min，使EP管中的溶液分為上下兩層。其中上層為乳白色的靶向微泡，下層為半透明的過量材料、磷脂碎片等。用長針吸取下層半透明溶液，然后加入0.5mL PBS重懸乳白液。重復上述方法三次，即可獲得scICAM-1標記的靶向微泡超聲造影劑，簡稱MBkmm。
[0068]以動態光散射法檢測鏈接scICAM-1前MB的粒徑為1076.1 ±118.5nm，鏈接scICAM-1后MBicam-1的粒徑為1183.7 ± 106.8nm，二者差別無統計學意義(P>0.05)。
[0069]對比例:以傳統方法制備靶向微泡超聲造影劑
[0070]先制備微泡超聲造影劑(簡稱MB)，后連接scICAM-1的“傳統方法”制備MBkam-1。
[0071]現將“傳統方法簡述如下:取上述方法(實施例1)中制備mal-liposome 0.5mL置于EP管中，并進行機械振蕩形成馬來酰亞胺化的MB，簡稱mal-MB。制備scICAM-1的步驟同“新方法”。將0.5mL mal-MB與1yg scICAM-1混合，在37°C水浴窩中恒溫孵育90min。用PBS對樣品離心洗滌三次(2000rpm，每次I Omin )，即獲得傳統方法制備的MBkh。
[0072]綜上所述，“新方法”制備過程中ΜΒκαμ-_ΜΒ離心次數為3次，而“傳統方法”則需要對MB進行離心6次。“新方法”最大程度的減少了 MB的離心次數，顯著地增強了 MB的產出率。
[0073]實施例2:微泡鏈接單鏈抗體效能檢測
[0074]本實施例通過激光共聚焦顯微鏡和定量的流式細胞技術法分別從定性和定量兩個層面觀察“新方法”制備MBigam-!的基本效能及與“傳統方法”制備MBigam-!比較的優勢。具體方法如下:在制備MB K am-1以磷脂形成脂質薄膜的時候加入0.5mg疏水性的紅色焚光染料Di I，用于標記MB超聲造影劑;在形成MBkam-1后，將MBkam-1與綠色熒光染料FITC標記的驢抗兔熒光二抗孵育，離心洗滌后獲得MB被標記為紅色熒光、scICAM-Ι被標記為綠色熒光的MBicam-1。
[0075]利用激光共聚焦顯微鏡分別觀察兩種方法制備MBkam-1紅色焚光標記的MB表面鏈接綠色熒光二抗標記scICAM-Ι的情況。激光共聚焦顯微鏡觀察結果如附圖1所示，幾乎所有紅色熒光標記的MB表面均鏈接有綠色熒光二抗標記的scICAM-Ι，提示無論“新方法”還是“傳統方法”，scICAM-Ι的鏈接效能都很高。流式細胞計數法定量觀察綠色熒光二抗標記MBicam-1的情況如附圖2所示，“新方法” scICAM-Ι的鏈接率為(99.9 ± 5.4) %，而“傳統方法”制備181咖—1的8(^41-1鏈接率為(99.0±5.4)%，二者差別無統計學意義(？>0.05)。
[0076]實施例3:靶向微泡超聲造影劑濃度及超聲成像能力檢測
[0077]本實施例通過檢測“新方法”和“傳統方法”制備MBicam-^最終產出率，突出說明本發明“新方法”制備靶向微泡超聲造影劑的優勢。具體方法如下:①直接大體觀察兩種方法制備MBicam-1的終產物。結果如附圖3A所示，兩種方法制備的MBicam-1在EP管中均呈分層的乳白色液體，由于MB為中空的微氣泡結構，靜止后(約15min)MB上浮引起溶液分層(上層MB濃度高呈乳白色，下層MB濃度低呈半透明)。無論上層乳白色液體還是下層半透明液體，“新方法”制備的MBkmh濃度均高于“傳統方法”。②在普通明場顯微鏡下(400X)觀察兩種方法制備的MBkam—i，結果發現“新方法”制備的MBkam—i(附圖3B)粒徑大小與“傳統方法”(附圖3C)相當。根據發明人課題組前期報道的方法[Yin T1Wang P,Zheng R1Zheng B,Cheng D1ZhangX,Shuai X.Nanobubbles for enhanced ultrasound imaging of tumors.1nt JNanomedicine.2012; 7:895-904.]對MBkam—!進行定量分析，結果顯示(附圖3D) “新方法”所制備的MBicam-1濃度為(3.I ±0.5) X 1MVmL，明顯高于“傳統方法”的(0.7 ±0.3) X 107個/mL(P<0.001)，證實“新方法”制備MBkam-!的產出率為“傳統方法”的4?5倍。
[0078]本實施例還通過體外超聲造影成像的方法進一步說明“新方法”制備靶向超聲造影劑產出率高的優勢。具體實施方法如下:兩種方法制備所得的MBkam-^0.9 %生理鹽水稀釋1000倍，然后置于特質的2%瓊脂糖模具中進行超聲造影成像。本實施例使用GEL0GIQE9臨床超聲診斷系統及ML6-15線陣探頭進行超聲造影成像，結果如附圖4所示，“傳統方法”制備的MBkam-1在稀釋1000倍后的成像效能遠不如未連接scICAM-Ι的MB，而“新方法”所制備的MBkmh稀釋1000倍后的超聲成像能力與MB相當，提示新方法并不會降低MB的濃度導致成像效能的下降。
[0079]實施例4:不同的振蕩時間對靶向脂質微泡的影響
[0080]為了證明不同振蕩時間對靶向脂質微泡濃度的影響，分別選用不同的振蕩時間制備MBicam-1，其余步驟與實施例1相同。不同的振蕩時間制備出的MBicam-1，根據發明人課題組前期報道的方法[Yin T ,Wang P ,Zheng R ,Zheng B ,Cheng D ,Zhang X ,ShuaiX.NanobubbIes for enhanced ultrasound imaging of tumors.1nt JNanomedicine.2012; 7:895-904.]對ΜΒκαμ—!進行定量分析。實驗結果如圖5所示。
[0081]由圖5可知，震蕩時間直接影響靶向脂質微泡的濃度。即使采用“新方法”制備MBicam-1，當震蕩時間低于35s時，也難于形成較高濃度的ΜΒκαμ—!。當震蕩時間為35?65s時，MBicam-1的濃度可以達到107bubbles/mL以上，尤其是當震蕩時間為45s時，濃度最高，在此時間點，制備出的靶向微泡大小適宜，粒徑分布均一，抗體結合率高。
【主權項】
1.一種單鏈抗體修飾的靶向微泡超聲造影劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.制備馬來酰亞胺化脂質體懸浮液； 52.通過還原法制備單鏈抗體； 53.將馬來酰亞胺化脂質體與單鏈抗體共同孵育制備靶向脂質體； 54.向靶向脂質體通入氣體，振蕩制備靶向微泡超聲造影劑。2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟SI采用薄膜-水化法準備馬來亞酰胺脂質體，包括以下步驟: SI 1.將氯仿和磷脂粉末加熱混勻； 512.將Sll中制備的溶液旋轉蒸發至氯仿完全揮發，形成磷脂薄膜； 513.在S12制備的磷脂薄膜中加入水化液，恒溫搖床水化，得到馬來酰亞胺化脂質體溶液;所述的水化液選自雙蒸水、氯化鈉溶液或PBS。3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S2包括以下步驟: 521.將雙鏈抗體與EDTA溶液混合； 522.在步驟S21所得溶液中加入MEA，充分混合后在37°C水浴90min ； 523.將S22所得溶液用含EDTA(I OmM)的PBS超濾洗滌三次獲得單鏈抗體。4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S3包括以下步驟: 531.將SI制得的馬來酰亞胺化脂質體溶液與S2制備的單鏈抗體共同孵育； 532.加PBS超濾離心洗滌三次，加PBS重懸定容獲得靶向脂質體。5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S4具體如下: 向S3制備的靶向脂質體通入氣體，進行高速機械振蕩，隨后離心分離微泡，以PBS重懸，即可獲得靶向微泡超聲造影劑。6.如權利要求2所述方法，其特征在于步驟S11中所述的磷脂含有DSPE-PEG2000-maleimide，優選地還含有DPPC、DPPA中的一種或兩種；進一步優選地，為DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimid 三者組合；更進一步優選地，DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimide 的質量分數比為7:1:1?3;更優選7:1:2。7.權利要求2所述方法，其特征在于步驟S13中的搖床溫度為37?65°C，搖床轉速為60?180rpm，水化時間為0.5?2h。8.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟S31中，馬來酰亞胺化脂質體與單鏈抗體的質量分數比為100?1000:1;優選250:1。9.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟S32中，超濾離心轉速為1000?4000rpm，優選300rpm;溫度為4?25°C，優選4°C ;每次超濾時間為0.5?2h，優選lh。10.如權利要求5所述方法，其特征在于步驟S4中機械振蕩頻率為40?80Hz，優選67Hz；振蕩時間為10?10s，優選35?65s ；更為優選45s;離心分離微泡的轉速為500?3000rpm，優選200rpm，離心時間為I?20min，優選5min。
【文檔編號】A61K49/22GK105854035SQ201610190220
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月29日
【發明人】尹庭輝, 鄭榮琴, 邱晨, 游宇佳, 王平, 任杰
【申請人】中山大學附屬第三醫院