骨硬化病相關跨膜蛋白在治療或預防ev71感染藥物中的應用

骨硬化病相關跨膜蛋白在治療或預防ev71感染藥物中的應用
【專利摘要】本發明公開骨硬化病相關跨膜蛋白在治療或預防EV71感染藥物中的應用，其步驟為：首先利用昆蟲桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞（SF9）中表達Ostm1蛋白，然后使用鎳柱親和層析的方法對Ostm1蛋白進行純化，最后在感染EV71的惡性胚胎橫紋肌瘤細胞（RD細胞）中來驗證Ostm1蛋白的抗病毒效果。實驗結果證明：純化后的Ostm1蛋白在一定濃度時可以在mRNA水平和蛋白水平抑制EV71病毒的復制。本發明從蛋白純化以及細胞核分子層面對骨硬化病相關跨膜蛋白（Ostm1）抗EV71病毒作用進行了評價，為其進一步開發和應用奠定了基礎。該蛋白可以在適當的濃度直接抑制EV71病毒的復制，并且效果明顯，對細胞沒有副作用，使用簡單方便。表明該藥物具有開發成為抗EV71病毒的有效藥物而應用于臨床的前景。
【專利說明】
骨硬化病相關跨膜蛋白在治療或預防EV71感染藥物中的應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及抗病毒藥物領域，涉及一種骨硬化病相關跨膜蛋白（Osteopetrosis associated transmembrane protein 1)的新用途，更具體涉及一種骨硬化病相關跨膜蛋 白在治療或預防EV71感染藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]
[0003] 人類腸道病毒71型（Hu-man enterovirus)屬于小RNA病毒科(Picomaradae)腸道 病毒屬(Enterovirus) JV71病毒顆粒為正二十面體對稱球形結構，沒有包膜和刺突，其直 徑在24-30nm左右。病毒基因組全長為7408bp，為單鏈正義RNA，基因組中只有一個開放閱讀 框(0RF)，在0RF的兩側為5'和3'的非編碼區（UTRs)，在基因組的3'端末尾還有一個長度可 變的多聚腺苷酸尾巴(P〇ly-A)。病毒基因組中的0RF可以編碼2194個氨基酸，這些氨基酸組 成的多聚蛋白可以產生P1、P2和P3-共3個前體蛋白。其中P1前體蛋白編碼4個病毒外殼蛋 白，分別為VP1、VP2、VP3和VP4;P2和P3前體蛋白一共編碼7個非結構蛋白。其中，VP1蛋白是 最主要的衣殼蛋白，含有EV71主要的抗原決定簇，其編碼的基因序列與病毒的血清學有很 高的相關性，因此常常被用來作為病毒型別的鑒定和基因的進化分析。病毒粒子的衣殼有 60個亞單位組成，每一個亞單位都有VP1-VP4形成的五聚體樣結構，其抗原決定簇基本上都 位于VP1-VP3上。
[0004] EV71病毒以人體的上呼吸道、咽喉以及腸道為侵入對象，先在局部的黏膜和扁桃 體及咽等淋巴組織和腸道淋巴結集合并初步的擴增，然后將EV71病毒釋放入血液，形成第 一次病毒血癥，EV71病毒隨血液擴散到帶有其受體的靶組織，再次增殖從而引起第二次病 毒血癥和一些臨床癥狀。EV71的感染會造成長期的后遺癥，例如神經系統后遺癥以及認知 功能的延遲和降低。肺水腫和出血是兒童感染EV71后引起死亡的主要原因。
[0005] 目前并沒有有效的抗病毒藥物來治療重癥的EV71感染，也沒有進入臨床階段的疫 苗可以使用，所以，避免接觸感染的患者和疑似感染患者是預防EV71感染的主要方法。在抗 EV71病毒藥物的研究方面，吡啶基咪唑啉酮是一類新型粘合劑類的藥物，它可以與EV71的 VP1蛋白的相互作用，通過使VP1基因的疏水區域的擴大，從而干擾VP1與其受體結合的方法 來抑制EV71的復制。另外，細胞因子介導的方法可以用來治療EV71感染所引起的水腫，例如 像利巴韋林就能通過降低感染小鼠組織中的病毒載量來降低EV71感染的死亡率和后續的 麻痹后遺癥。最后，我們可以通過接種疫苗的方法來預防EV71的感染，目前EV71的候選疫苗 主要包括減毒活性疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗、病毒樣顆粒以及轉基因疫苗，這些疫苗已 在動物實驗中得到評估但是臨床試驗尚未進行。
[0006] 骨硬化病相關跨膜蛋白（Ostml)具有338個氨基酸，具有一個單一的跨膜結構域， 一個短的胞質尾區，一個長的含有多個高糖基化位點的細胞腔結構域和一個可以剪切的信 號肽。Ostml蛋白的細胞腔結構域含有一個微弱的RING-finger蛋白。該蛋白最初始的功能 可能與E3泛素連接酶類似。
[0007] Os tml蛋白可以在破骨細胞、造血干細胞以及其他的造血細胞家族例如B細胞、NK 細胞和肥大細胞中表達。Ostml基因可以獨立于CIC-7基因在造血干細胞的分化中起著重要 的作用，此外，Ostml蛋白也可以調控典型的Wnt信號通路，從而在骨內穩態中起到重要的作 用。在骨硬化病患者的Ostml基因上的突變產生了一個截短的蛋白，這個蛋白缺乏跨膜區和 胞質尾區從而使該蛋白可以分泌，該突變蛋白可以抑制Wnt信號通路并且可以結合到破骨 細胞前體的抑制子上從而抑制破骨細胞的產生。Ostml蛋白是多能干細胞中miR-140的靶位 點，具有抗脂肪形成的功能，Ostml蛋白也具有連接骨形態發生蛋白（BMP)和Wnt信號通路的 潛力。但是，目前還沒有Ostml蛋白和病毒性疾病以及相關病毒之間關系的文獻報道，也沒 有該病毒對現在大規模流行并且致病性比較高的腸道病毒(EV71)的預防與治療作用的報 道。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的是在于提供了一種人骨硬化病相關跨膜蛋白在制備治療和預防人 腸道病毒EV71感染藥物中的應用，從細胞和分子層面對骨硬化病相關跨膜蛋白（Ostml)抗 EV71病毒的作用進行了評價，為其進一步的開發和應用奠定了良好的基礎，該蛋白可以在 適當的濃度直接抑制EV71病毒的復制，并且效果明顯，對細胞沒有副作用，使用簡單方便。
[0009] 為了實現上述的目的，本發明通過以下技術方案實現： 一種骨硬化病相關跨膜蛋白在制備治療或預防腸道病毒71型(EV71)感染藥物中的應 用，其步驟是： (1) 將Ostml基因（GenBank NP054747)的C端連接上His標簽，然后將其克隆到pFastBac Dual載體(Invitrogen)的PH啟動子(質粒上面)下，通過測序從而得到正確的克隆pFastBac Dual-〇stml； (2) 將pFastBac Dual-Ostml轉化大腸桿菌(DH10P)(購于克勞寧生物科技有限公司）， 通過Tn7轉座子(DH10P)，基因重組得到攜帶有Ostml基因的桿狀病毒Bacmid-Ostml; (3) 將Bacmid-Ostml轉染SF9細胞(來自于中國典型培養物保藏中心)得到P1代重組病 毒，經過病毒擴增得到活性最高的P3代重組桿狀病毒，并且證明了Ostml蛋白的成功表達； (4) 用P3代病毒感染SF9懸浮細胞來進行大規模的蛋白表達，然后利用鎳柱親和層析法 成功得到了純化的Ostml蛋白； (5) 將純化后的Ostml蛋白以不同的濃度作用于感染EV71病毒(GenBank JN230523.1) 的RD細胞，于8h后提取總RNA，以病毒的VP1結構蛋白作為檢測EV71病毒復制的標志物，分別 在RNA和蛋白水平來檢測該蛋白的抗病毒效果。
[0010] 上述實驗結果表明：純化后的Ostml蛋白在一定濃度時可以明顯的抑制EV71病毒 VP1的mRNA水平，免疫印跡結果也顯示該蛋白可以在相同濃度時抑制VP1蛋白水平的表達。 從而證明了該蛋白就用抗E71病毒復制的功能。
[0011] 本發明發現了骨硬化病相關跨膜蛋白新的藥用價值，為抗腸道病毒71型、治療和/ 或預防EV71感染提供了新有效藥物。
[0012] 所述的一種骨硬化病相關跨膜蛋白在制備治療或預防腸道病毒71型(EV71)感染 藥物中的應用，具體應用為將純化的Ostml蛋白以合適的濃度直接作用于感染EV71的細胞， 該蛋白可以明顯的抑制EV71的復制(如圖5所不） 目前并沒有有效的抗病毒藥物來治療重癥的EV71感染，也沒有進入臨床階段的疫苗可 以使用，所以，避免接觸感染的患者和疑似感染患者是預防EV71感染的主要方法。在抗EV71 病毒藥物的研究方面，吡啶基咪唑啉酮是一類新型粘合劑類的藥物，它可以與EV71的VP1蛋 白的相互作用，通過使VP1基因的疏水區域的擴大，從而干擾VP1與其受體結合的方法來抑 制EV71的復制。另外，細胞因子介導的方法可以用來治療EV71感染所引起的水腫，例如像利 巴韋林就能通過降低感染小鼠組織中的病毒載量來降低EV71感染的死亡率和后續的麻痹 后遺癥。最后，
【申請人】可以通過接種疫苗的方法來預防EV71的感染，目前EV71的候選疫苗主 要包括減毒活性疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗、病毒樣顆粒以及轉基因疫苗，這些疫苗已在 動物實驗中得到評估但是臨床試驗尚未進行。
[0013]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果： 本發明從蛋白純化以及細胞和分子層面對骨硬化病相關跨膜蛋白（Ostml)抗EV71病毒 作用進行了評價，為其進一步開發和應用奠定了基礎。表明該藥物具有開發成為抗EV71病 毒的有效藥物而應用于臨床的前景。
[0014]最終，通過實驗
【申請人】發現骨硬化病相關跨膜蛋白在濃度為13.5ng/ml時可以對 EV71病毒的復制有很明顯的抑制作用，這提示
【申請人】可以將該蛋白制成相關藥物，從而在 EV71病毒的預防和感染后治療的過程中發揮其抗病毒的效果。
[0015]【附圖說明】： 圖1為一種P3代桿狀病毒表達Ostml蛋白的時間以及表達環境鑒定的示意圖。
[0016] 結果證明P3代病毒感染昆蟲細胞(sf9)第三天OStml蛋白表達效果最好，且該蛋白 是胞內表達。
[0017] 圖2為一種利用鎳柱親和層析法來純化蛋白的不同咪唑濃度梯度洗脫圖。
[0018] 結果證明在咪唑濃度為112mM時，Ostml蛋白可以被大量的洗脫下來，并且雜蛋白 很少，從而可以得到純化的蛋白。
[0019] 圖3,4為一種不同濃度的Ostml蛋白抑制EV71病毒mRNA水平的示意圖。
[0020] 結果顯示在Ostml蛋白濃度為13.5ng/ml和337.5ng/ml時，EV71病毒的VP1蛋白的 mRNA水平與不加病毒的對照組相比有明顯的下降，說明當蛋白在此濃度時對EV71病毒的 mRNA的產生有比較明顯的抑制作用。
[0021]圖5為一種不同濃度的Ostml蛋白抑制EV71病毒蛋白水平的示意圖。
[0022] 結果顯示當蛋白的濃度為189ng/ml和360ng/ml時，與只加入病毒的對照組相比， V P1的蛋白水平有明顯的下降，說明在此濃度時，0 s t m 1蛋白對于E V 71病毒的復制有比較明 顯的抑制作用。 【具體實施方式】 [0023] 實施例1: 一種骨硬化病相關跨膜蛋白在制備預防和/或治療EV71感染藥物中的應用，其步驟是： 1. Ostml蛋白在昆蟲桿狀病毒表達系統中的表達及純化： 首先
【申請人】以HepG2細胞(來自于中國典型培養物保藏中心）的cDNA為模板，用特異性 的引物(序列如下）來擴增目的基因，然后將其連接在質粒載體pCAGG-HA(Invitrogen)上 面。引物序列如下：
接著再用特異性的引物從上述質粒上面來擴增目的基因，將其克隆到pFastBac Dual 載體上。引物的序列如下：
然后將pFastBac Dual-Ostml質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH10P，將其涂布在加有卡 那霉素、四環素、慶大霉素，x-gal以及IPTG的LB固體平板上，然后將其放在37°C恒溫生化培 養箱中避光培養72h。然后挑取3個白色菌落，重新劃線培養于上述固體平板，72h后挑取單 克隆菌落，將其接種到含有卡那霉素、四環素和慶大霉素的LB液體培養基里，200rpm，37°C 震蕩培養過夜。次日提取質粒，并用M13引物鑒定Ostml基因的插入。M13引物序列如下
從液氮罐中取出凍存的SF9細胞(來自于中國典型培養物保藏中心），迅速放入37 °C水 浴鍋中，快速解凍，復蘇細胞。然后加入4ml的SF900魏培養基于T25細胞瓶中，放入27°C無 二氧化碳的細胞培養箱中培養。待細胞可以很好的傳代時，將得到的穿梭質粒Bacmid-Ostml(見技術方案中2)轉染到SF9細胞中，轉染72h或者等到細胞出現病變后，收集培養基 上清，轉移到無菌的15ml離心管中，lOOOrpm離心10min，即可得到P1代桿狀病毒，然后將其 繼續感染生長狀態良好的SF9細胞，即可得到P2代桿狀病毒，以此方法得到P3代桿狀病毒， 若是長期保存病毒應該將病毒放置于_80°C保存。
[0024] 為了驗證Ostml蛋白在SF9細胞中的表達情況，
【申請人】分別取P1代，P2代，P3代以及 P3代病毒感染SF9細胞ld、2d、3d的細胞以及培養基上清來做Western-blot實驗，通過實驗 結果
【申請人】得到P3代病毒在感染第三天時表達Ostml蛋白效果最好，并且該蛋白為非分泌 型表達。
[0025]在確定了Ostml蛋白成功表達后接著就是蛋白的純化。首先是SF9懸浮細胞的培 養:從液氮罐中取出凍存的SF9懸浮細胞，將其接種到無菌的搖瓶中（一般接種量是搖瓶體 積的1/3)。1 lOrpm，27°C震蕩培養;每天觀察和測定細胞的個數和存活率，待其細胞的濃度 達到4X106個/ml，且其存活率在95%以上時，就可以進行細胞的傳代;在原培養瓶瓶中添加 適量的新鮮培養基，使細胞的濃度達到2 X106個/ml，然后分裝到兩個無菌在搖瓶中。 110rpm，27°C條件下繼續震蕩培養。待SF9懸浮細胞的密度達到2X10 6個/ml時，加入M0I=1 的P3代病毒，繼續培養3d后丟棄培養基，收集細胞。稱取昆蟲細胞的濕重，然后按照1:10的 比例加入昆蟲細胞裂解液。將細胞放置在超聲波破碎儀下，設置超聲的時間和頻率(一般是 超聲2s間隔2s，超聲30min左右）。整個超聲的過程中需要將細胞一直置于冰盒上，超聲結束 后收集上清液。在這里
【申請人】使用的是BI0-RAD公司的BioLogic DuoFlow蛋白純化儀來進 行蛋白的純化，其具體實驗步驟為（1)用去離子水清洗鎳柱:A栗(上述機器上自帶的）和B (上述機器上自帶的）都放入水中，流速1.5ml/s，清洗20min;(2)平衡鎳柱:A栗放入平衡緩 沖液，B栗放入水中，此步驟只有A栗工作，流速1.5ml/s，平衡20min;(3)上樣:A栗放入樣品 中，B栗放入水中，此步驟也是只有A栗工作，流速1.5ml/s，時間由樣本體積決定，收集部分 流出液；（4)漂洗:A栗放入漂洗緩沖液，B栗放入水中，此步驟中也是只有A栗工作，流速 1.5ml/s，漂洗20min，收集漂洗液;（5)線性梯度洗脫:A栗放入高濃度的咪唑中（200mM)，B栗 放入水中，此步驟兩栗同時工作，設置收集的管數。洗脫液的濃度就是從0_200mM線性梯度 變化，收集每管洗脫液;（6)高濃度漂洗:將A栗放入高濃度咪唑(200mM)，B栗放入水中，此步 驟只有A栗工作，流速2ml/s，漂洗15min，用以洗去鎳柱上殘存的蛋白；（7)清洗系統:將A栗 和B栗同時放入含有濃度為20%的乙醇中，流速2ml/s，清洗30min。使整個系統處于20%的乙 醇環境中，最后將兩栗保存在20%的乙醇溶液中。
[0026]注意:A栗在調換的過程中都要用去離子水清洗干凈。
[0027] 2.純化的Ostml蛋白的抗EV71病毒活性研究： 2.1細胞和病毒： 人橫紋肌肉瘤細胞系RD來自于中國典型培養物保藏中心(CTCC)(武漢大學），并且由本 實驗室保存。
[0028] EV71病毒株由本實驗室分離獲得。
[0029] 2.2實驗方法： 將處于對數期的RD細胞鋪12孔板，待RD細胞貼壁并且細胞基本鋪滿每個孔時，換用無 血清培養基，然后只留一個孔作為對照，不加病毒，其余每個孔加入M0I = 1的EV71病毒。 90min后，棄去原培養基，然后添加新鮮的無血清培養基，每個孔中加入不同質量的純化后 的Ostml蛋白，8h后收取細胞，使用Trizol法提取細胞中的中總RNA，逆轉錄成為cDNA，然后 使用熒光定量PCR的方法來檢測EV71病毒中VP1蛋白在RNA水平上的變化情況。引物序列如 下：
因為不知道〇stml蛋白抑制病毒復制的最佳濃度范圍，所以在前期的實驗中
【申請人】放 大加入細胞中的Ostml蛋白的質量范圍（6.75ng-1350ng)，用來篩選其最合適的作用濃度。 實驗結果如圖3所示。
[0030] 由圖3可知：在加入Ostml蛋白質量為6.75叫、33.751^以及270叫時，￥?1蛋白的 mRNA水平與只加病毒的對照組相比較下降比較明顯，說明0stml蛋白在此濃度時對EV71病 毒的mRNA的產生有比較明顯的抑制作用。但是當繼續提高Ostml蛋白的濃度時，發現其對 EV71病毒的復制沒有抑制作用。為了進一步驗證上述的實驗結果，在接下來的實驗中，申請 人將加入細胞中蛋白的質量范圍進一步縮小（13.5ng-405ng)，實驗結果如圖4所示： 由圖4可知，在加入Ostml蛋白的質量為13.5ng和337.5ng時，EV71病毒的VP1蛋白的 mRNA水平與不加病毒的對照組相比有明顯的下降，說明當蛋白在此濃度時對EV71病毒的 mRNA的產生有比較明顯的抑制作用。這與圖4的實驗結果基本相符，由此
【申請人】可以得出 Ostml蛋白在合適的濃度范圍內可以抑制EV71病毒mRNA的產生。
[0031 ]將處于對數期的RD細胞鋪六孔板，待細胞完全貼壁且長滿六孔板。棄去原培養基， 換用無血清培養基。其中一個孔作為對照不加病毒，其余每孔加入EV71病毒MOIzljOmin 后，棄去原培養基，換用新鮮的無血清培養基。每個孔加入不同質量的Ostml蛋白。12h后收 集細胞，超聲波破碎細胞。然后通過Western-blot實驗來檢測不同蛋白濃度下EV71病毒中 VP1蛋白的變化情況。實驗結果如圖5所示： 圖5中，所添加的Ostml蛋白的質量依次為7ng、21ng、63ng、189ng、360ng和567ng。由圖5 可知當加入蛋白的質量為189ng和360ng時，與只加入病毒的對照組相比，VP1的蛋白水平有 明顯的下降，說明在此濃度時，Ostml蛋白對于EV71病毒的復制有比較明顯的抑制作用。 [00 32] 通過在mRNA水平和蛋白水平的雙重驗證，證明了Ostml蛋白在一定的濃度范圍內 對EV71病毒的復制確實有抑制作用，從而也證明了通過桿狀病毒表達系統表達并且純化出 來的Ostml蛋白是具有活性的。
【主權項】
1. 一種骨硬化病相關跨膜蛋白在制備治療或預防EV71感染藥物中的應用。
【文檔編號】A61K38/17GK105853998SQ201610216836
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月8日
【發明人】吳建國, 鄔開朗, 馬春強, 潘攀, 劉映樂, 劉芳
【申請人】武漢大學