AT-101在制備Hedgehog信號通路的選擇性抑制劑中的用圖
【專利摘要】本發明屬于腫瘤藥理學及Hedgehog信號通路研究領域，涉及AT-101在制備Hedgehog信號通路的選擇性抑制劑中的用途；具體涉及AT-101在體外NIH3T3細胞中對Hedgehog信號通路的特異性抑制，以及對Hedgehog活性異常升高的實體瘤(如髓母細胞瘤)的生長抑制中的用途。本發明提供了證明AT-101對Hedgehog信號通路特異性抑制的實驗方法和證據，和AT-101體內體外抗瘤效應的評價體系，同時證實了AT-101Hedgehog信號通路的作用靶點及其體內的抗瘤效應。本發明可進一步用于制備新的抗腫瘤藥。
【專利說明】
AT-101在制備Hedgehog信號通路的選擇性抑制劑中的用 途
技術領域
[0001] 本發明屬于腫瘤藥理學及Hedgehog信號通路研究領域，涉及AT-101在制備 Hedgehog信號通路的選擇性抑制劑中的用途；具體涉及AT-101在體外NIH3T3細胞中對 Hedgehog信號通路的特異性抑制，以及對Hedgehog活性異常升高的實體瘤（如髓母細胞 瘤）的生長抑制中的用途。
【背景技術】
[0002] 據報道顯不，Hedgehog信號通路最早于1980年在果繩中發現，它在許多的生理過 程中發揮著關鍵性的作用，如，組織形成，形態的發生，細胞分化，胚胎發育，骨形成等。研究 顯示，除了在胚胎發育過程中發揮作用，Hedgehog信號通路還在出生后的發育及維持組織 /器官的穩態和功能中起著重要作用。有研究證明，Hedgehog信號的異常活化與許多腫瘤 的發生密切相關，如髓母細胞瘤、基底細胞癌、急性粒細胞白血病以及前列腺癌、乳腺癌、直 腸癌和肺癌等。阻斷腫瘤細胞中Hh信號傳導通路將為人類腫瘤的治療提供一個新的有效 手段。
[0003] 現有技術公開了 Hedgehog(Hh)信號通路主要由分泌型糖蛋白配體Hedgehog、 跨膜蛋白受體Ptched(Ptch)、跨膜蛋白Smoothened(Smo)、核轉錄因子Gli蛋白及下游革巴 基因組成。人類和鼠中存在三個Hedgehog的同源基因：Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog (IHH)和 Desert Hedgehog (DHH)，分別編碼 Shh、Ihh 和 Dhh 蛋白；兩種 patched 基 因（PTCH1和PTCH2)，3種CLi相關基因（GLi 1，GLi2, Gli3)。正常情況下Hedgehog信號 通路調控著胚胎期組織細胞的生長分化，胚胎發育成熟后，進入失活狀態，此時，Smo蛋白的 活性被抑制。Shh、Ihh和Dhh蛋白這三種配體都有相同的受體Ptchl。Ptchl是一種具有 12次跨膜結構的膜蛋白，在沒有配體激活的情況下，這種膜蛋白抑制它下游的Smo的活性。 Smo是一種具有7次跨膜結構的膜蛋白，同時也是G蛋白偶聯受體樣蛋白。當Hedgehog配 體與Ptchl受體結合之后，Ptchl對Smo的抑制作用解除，Smo激活。活化的Smo將信號傳 遞到通路最后的一環，即核轉錄因子Gli，下游的Gli轉錄因子被激活，以全長形式轉入核 內引起革巴基因的轉錄。
[0004] 已知AT-101是棉酚的左旋異構體，棉酚是從棉花的種子中提取分離出來的一種 化合物，具有殺精作用，其最初是用做避孕藥。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供AT-101在制備Hedgehog信號通路的選擇性抑制劑中的新 的用途；具體涉及AT-101在體外NIH3T3細胞中對Hedgehog信號通路的特異性抑制，以及 對Hedgehog活性異常升高的實體瘤（如髓母細胞瘤）的生長抑制中的用途。
[0006] 本發明采用棉籽中提取分離的AT-101，經AT-101對Hedgehog信號通路特異性抑 制的實驗以及AT-101體內體外抗瘤效應的評價體系研究，結果證實，AT-101是Hedgehog信 號通路的特異性抑制劑以及它的體內抗瘤作用。
[0007] 本發明所述的的化合物是棉酚的左旋異構體（(_) enantiomer，簡稱AT-101)具有 如下結構：
[0008]
[0009] 本發明進行了 AT-101對體外NIH3T3細胞中Hedgehog信號通路的特異性抑制 作用實驗，結果顯示，AT-101能顯著抑制NIH3T3細胞中Hedgehog信號活性，能顯著抑制 C3H10T1/2中堿性磷酸酶的活性，也即是對Hh信號通路有抑制作用；
[0010] 本發明進行了 AT-101對Hedgehog信號通路作用靶點的探索實驗，結果顯 示，AT-101能劑量依賴性的抑制轉染Smoothened激活的Gli luciferase活性，而對 Smoothened突變體SmoM2(W535L)所激活的Gli luciferase活性無抑制作用，表明AT-101 是Smoothened的詰抗劑；
[0011] 本發明進行了 AT-101對Hh依賴的髓母細胞瘤的體內抗瘤效應，結果顯示，AT-101 能顯著抑制髓母瘤細胞中Hedgehog信號活性。
[0012] 本發明經實驗證實。所述的AT-101不同于傳統的細胞毒性化療藥物，具有對 Hedgehog信號通路的特異性抑制作用，即具有分子靶向性，因此對腫瘤細胞的選擇性更好， 進一步，所述的AT-101可用于制備Hedgehog信號通路的選擇性抑制劑，或治療腫瘤的藥 物，尤其是治療Hedgehog信號異常活化的腫瘤（如髓母細胞瘤）的藥物。
[0013] 本發明還提供了一整套Hedgehog信號通路抑制劑體內外抗腫瘤藥效評價的體 系。
[0014] 本發明的有益效果是：
[0015] 1，公開了 AT-101是Hedgehog信號通路的特異性抑制劑以及它的體內抗瘤效應。
[0016] 2,探索獲得了 AT-101對Hedgehog信號通路的作用靶點，AT-101是Smoothened的 拮抗劑。
[0017] 3、AT-101對Hedgehog信號通路的作用具有特異性，且能在轉錄水平阻斷 Hedgehog信號的傳遞。
[0018] 5、提供了將AT-101制成靶向Hedgehog信號通路的抗腫瘤藥物的理論基礎，能明 顯擴大AT-101的應用領域；
[0019] 6、可進一步將AT-101制備成新的抗腫瘤藥。
[0020] 以下通過附圖并結合具體實施例對本發明作進一步的闡述，但并不限制本發明的 保護范圍。
【附圖說明】
[0021] 圖1為不同濃度下，AT-101作用于NIH3T3細胞36h后，Gli luciferase活性抑制 的量效曲線，結果表明其對SHH刺激的Gli luciferase活性抑制的的IC50為1. 84uM，對 SAG激活的Gli luciferase活性抑制的IC50為2. 72uM。
[0022] 圖2為不同濃度下，AT-101作用于NIH3T3細胞24h后GlilmRNA表達的柱形圖， 呈現良好的量效關系。
[0023] 圖3為不同濃度下，AT-101作用于C3H10T1/2細胞72h后堿性磷酸酶活性抑制的 柱形圖，結果表明其對C3H10T1/2的分化有抑制作用，呈現良好的劑量關系。
[0024] 圖 4 為轉染 Smoothened 質粒與 Smoothened M2 (W535L)質粒激活 Hedgehog 信號 后，用不同濃度的AT-101作用NIH3T3細胞36h后，抑制Smoothened激活的G1 i lucif erase 活性；然而對SmoothenedM2(W535L)激活的Gli luciferase活性沒有抑制作用，呈現良好 量效曲線，說明AT-101是Smoothened的詰抗劑。
[0025] 圖5為AT-101與Bodipy-cyclopamine的相互作用的情況，結果表明AT-101和 cyclopamine存在競爭性結合Smoothened的作用，進一步說明了 AT-101是Smoothened的 拮抗劑。
[0026] 圖6為從裸小鼠身上的髓母細胞瘤組織分離得到的髓母瘤細胞，用AT-101處理 24h后Gli ImRNA表達的柱形圖。
[0027] 圖7為AT-101 (20mg/kg，或40mg/kg灌胃給藥，每天一次）給藥21天對裸小鼠接 種的髓母細胞瘤的生長抑制效應。
【具體實施方式】
[0028] 下列實施例舉例說明了本發明的標準實驗室實踐，用于示范本發明的模式，而不 應將本發明理解為限定于這些實施例的范圍。
[0029] 應特別指出的是在下列實施例中，使用的分子生物學技術和動物實驗技術是本領 域普通技術人員所熟知的，并可在諸如Rudin，C.M.et al. Treatment of medulloblastoma with hedgehog pathway inhibitor GDC-0449.N. Engl. J. Med. 361，1173 - 1178 (2009) 及 Kim J, Tang JY. et al.Itraconazole, a commonly used antifungal that inhibits Hedgehog pathway activity and cancer growth. Cancer Cell.2010Aprl3 ；17 (4):388-99 等參考文獻中獲得。
[0030] 實施例1AT-101對體外NIH3T3細胞中Hedgehog信號通路的特異性抑制作用實驗
[0031] 1. 1雙熒光素酶報告基因測試
[0032] NIH3T3 (American Type Culture Collecton)細胞用含 10 % (v/v)新生牛血 清（GIBC0)的 Dulbecco' s modified Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 鏈霉素 (Hyclone)，37°C，5% C02恒溫培養，以3X104個/孔種在48孔板中，24h后用轉染試劑 lipo2000 (Invitrogen)車專染Gli-dependent firefly luciferase reporter和 TK-Renilla luciferase reporter vectors。轉染后36h，換成含1 %新生牛血清（GIBC0)的培養基， SAG(50nM)或 SHHN conditioned medium(SHHN-CM)及配制成不同濃度的 AT-101 (Selleck) 對細胞進行處理，同時設置空白對照組和陽性對照組，37°C，5% C02恒溫孵育36h后，細胞 用1XPBS洗2次，按照雙焚光素酶報告系統（Promega)的說明書進行Gli 1-luciferase相 對活性的檢測，本實驗每個濃度設三個復孔，至少重復三次；
[0033] 1. 2 實時熒光定量 PCR (QRT-PCR)
[0034] NIH3T3(ATCC)細胞用含 10% (v/v)新生牛血清（GIBC0)的 Dulbecco's modified Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 鏈霉素，37°C，5% C02 恒溫培養，以 4X105 個 / 孔種在六孔板中，24h后換成含10% SHHN conditioned medium(SHHN_CM)、l%新生牛血清 (GIBC0)的DMEM培養基，細胞以不同濃度梯度的AT-lOl(selleck)(溶于DMSO(sigma)中） 處理，24h后用Trizol (北京鼎國生物）提取總RNA，以內源性的管家基因⑶SB作為參照，用 逆轉錄試劑盒（Takara)以及:S:YB_R?Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)系統（Takara)進 行處理后，使用Biorad IQ5. 0型實時熒光定量PCR儀，用染料法對Hedgehog的靶基因Gli ImRNA進行定量測定，本實驗每個濃度設三個復孔，至少重復三次，實驗結果均為以GUSB標 準化后計算出的相對表達水平；
[0035] 1. 3堿性磷酸酶實驗
[0036] C3H10T1/2(ATCC)細胞用含 10% (V/V)胎牛血清（GIBC0)的Dulbecco's modifies Eagle's medium (DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 鏈霉素，37°C，5% C02 恒溫培養，以 4X104 個細 胞于48孔板中，24h后加入5% SHHN conditioned medium(SHHN-CM)及配制成不同濃度的 AT-101 (Selleck)對細胞進行處理。37°C，5% C02恒溫孵育72h后，細胞用1XPBS洗2次， 用堿性磷酸酶試劑盒測定堿性磷酸酶的活性（碧云天）；
[0037] 結果顯示：AT-101能顯著抑制NIH3T3細胞中Hedgehog信號活性，表現為抑制 G1 i lucifearse的活性，抑制效果成明顯量效關系；其IC50為1. 84uM，對SAG激活的Gli luciferase活性抑制的IC50為2. 72uM(如圖1所示）；AT-101能顯著抑制NIH3T3細胞中 Hedgehog信號活性，表現為Gli ImRNA的相對表達降低，抑制效果成明顯量效關系（如圖2 所示）；AT-101能顯著抑制C3H10T1/2中堿性磷酸酶的活性，也即是對Hh信號通路有抑制 作用，抑制效果成明顯劑量關系（如圖3所示）。
[0038] 實施例2AT-101對Hedgehog信號通路作用靶點的實驗研究
[0039] 2. 1AT-101 對轉染 Smoothened 后激活的 Gli luciferase 活性的抑制
[0040] NIH3T3(ATCC)細胞用含 10% (v/v)新生牛血清（GIBC0)的 Dulbecco's modified Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 鏈霉素，37°C，5% C02 恒溫培養，以 3X104 個 /孔種在48孔板中，24h后用轉染試劑lipo2000同時轉染hSmo (生博）、Gli-dependent firefly luciferase reporter 和 TK-Reni 11a luciferase reporter vectors。車專染后 36h，換成含1%新生牛血清（GIBC0)的DMEM培養基，用不同濃度的AT-lOl(Selleck)對細 胞進行處理，37°C，5% C02恒溫孵育36h后，細胞用1XPBS洗2次，用雙熒光素酶報告系統 測定Gli-luciferase的相對活性（Promega)，本實驗每個濃度設三個復孔，至少重復三次；
[0041] 結果表明AT-101能劑量依賴性的抑制轉染Smoothened激活的Gli luciferase 活性（如圖4A所示），而對Smoothened突變體SmoM2 (W535L)所激活的Gli luciferase活 性并無抑制作用（如圖4B所示），說明AT-101是Smoothened的詰抗劑；
[0042] 2. 2AT-101 與 Bodipy-cyclopamine 的相互作用
[0043] 293T(ATCC)細胞用含 10 % (V/V)胎牛血清（GIBC0)的 Dulbecco' s modifies Eagle's medium(DMEM)(GIBC0)，青霉素 / 鏈霉素，37 °C，5 % C02 恒溫培養， 以1 X 105個細胞接種于24孔板中，24h后用轉染試劑lipo2000 (Invitrogen)轉染 hsmo(0rigene)500ng，轉染后24h，換成含1%新生牛血清（GIBC0)的DMEM培養基，加入 Bodipy-cyclopamine (Biovision) (luM)以及不同濃度的 AT-lOl(Selleck)對細胞進行處 理，37°C，5% C02恒溫孵育lOh后，細胞用1XPBS洗2次，4%多聚甲醛固定10mins，lXPBS 洗 2 次，0? 1% Triton 冰上孵育 10mins，0. 5ug/ml DAPI (鼎國昌盛）染色 5mins, 1XPBS 洗 2次，封片；
[0044] 結果表明AT-101與Bodipy-cyclopamine存在競爭性結合（如圖5所示），進一步 說明AT-101是Smoothened的詰抗劑。
[0045] 實施例3AT-101對Hh依賴的髓母細胞瘤的體內抗瘤效應
[0046] 3. 1AT-101對髓母細胞瘤細胞中Gli ImRNA表達的影響
[0047] 從生長旺盛的髓母細胞瘤組織分離得到瘤細胞，Neurobasal-A Medium(Gibco)， B-27添加劑（Gibco)，丙酮酸鈉（Gibco)，L-谷氨酰胺（Gibco)，青霉素/鏈霉素（Hyclone)， 37°C，5% C02恒溫培養，以5X106個/孔種在六孔板中，24h后細胞以不同濃度的 AT-lOl(selleck)(溶于DMSO(sigma)中）處理，24h后用Trizol(北京鼎國生物）提取總 RNA，以內源性的管家基因⑶SB作為參照，用逆轉錄試劑盒（Takara)以及SYBR 5 Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)系統（Takara)進行處理后，使用Biorad IQ5. 0型實時熒光定量 PCR儀，用染料法對Hedgehog的靶基因G1 i ImRNA進行定量測定，本實驗每個濃度設三個復 孔，至少重復三次，實驗結果均為以GUSB標準化后計算出的相對表達水平；
[0048] 結果顯示：AT-101能顯著抑制髓母瘤細胞中Hedgehog信號活性，表現為GlilmRNA 的相對表達降低，抑制效果成明顯量效關系（如圖6所示）；
[0049] 3. 2AT-101對Hh依賴的髓母細胞瘤的生長抑制效應
[0050] 取生長旺盛的Ptch+/ P53 / C57B/L小鼠自發長出的髓母細胞瘤組織剪切成1. 5mm3 左右，在無菌條件下，接種于4-6周齡的遠交系無胸腺雌性裸鼠（Slac)的左側腋窩皮下，待 移植瘤平均體積長至~110mm 3,剔除移植瘤過大、過小以及未見生長的裸小鼠，隨機分組給 藥，每2-3天用游標卡尺測量一次腫瘤體積和裸鼠體重，實驗組按照10mg/kg灌胃給藥，每 天一次；⑶C-0449陽性對照組按照12. 5mg/kg灌胃給藥，每天2次，陰性對照組同時給等量 的溶媒〇. 5% CMC。腫瘤體積（tumor volume, TV)的計算公式為：TV = l/2XaXb2,其中a、 b分別表示長和寬。根據測量的結果計算出相對瘤體積（relative tumor volume，RTV)，計 算公式為：RTV = Vt/V。其中V0為分籠給藥時測量所得的腫瘤體積，Vt為每一次測量時的 腫瘤體積，抗腫瘤活性的評價指標為相對腫瘤增殖率T/C(% )，計算公式如下：
[0051] T/C (% ) = Trtv/Crtv X 100其中Trtv表示治療組RTV，C RTV表示陰性對照組RTV ;
[0052] 結果顯示：AT-101對同種異體移植的髓母細胞瘤具有較為明顯的抗瘤效應（如圖 7所示）。
【主權項】
1. 如下結構的化合物AT-101在制備Hedgehog信號通路的選擇性抑制劑中的用途2. 按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的AT-101抑制NIH3T3細胞中Hedgehog 信號活性，和抑制C3H10T1/2中堿性磷酸酶的活性。3. 按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的AT-101是Smoothened的詰抗劑， 其中，AT-101抑制轉染Smoothened激活的Gli luciferase活性，對Smoothened突變體 SmoM2(W535L)激活的Gli luciferase活性無抑制作用。4. 按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的AT-101用于制備靶向治療腫瘤的藥 物。5. 按權利要求4所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤是髓母細胞瘤。6. 按權利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述的AT-101抑制髓母瘤細胞中 Hedgehog信號活性。
【文檔編號】A61P35/00GK105853400SQ201510030980
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月21日
【發明人】譚文福, 彭元求, 王娟, 劉原, 楊君
【申請人】復旦大學