一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的用圖
【專利摘要】本發明公開了一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的用途，以螺旋藻多酚提取物作為活性成分之一或唯一的活性成分用于制備酪氨酸酶抑制劑；所述螺旋藻多酚提取物的制備方法：采用體積濃度為80%的乙醇提取螺旋藻，得到螺旋藻多酚粗提液，再將螺旋藻多酚粗提液于40℃減壓濃縮，冷凍干燥后得到固態的螺旋藻多酚提取物。本發明從螺旋藻首次提取出的多酚對酪氨酸酶活性的抑制，將為其應用于皮膚美白、醫療、果蔬保鮮等領域提供可靠的理論依據，也將為綜合利用螺旋藻資源和研究安全、經濟的酪氨酸酶抑制劑提供新途徑。
【專利說明】
一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的用途
技術領域
[0001] 本發明涉及生物制劑的技術領域，尤其涉及一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨 酸酶抑制劑的用途。
【背景技術】
[0002] 海藻多酚是一種主要從藍藻、綠藻、紅藻和褐藻四大海洋藻類中分離提取的具有 抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒及降血壓等廣泛生物活性的多酚類化合物的總稱。Iwa i研究 了褐藻多酚作為一種天然來源的葡萄糖酶抑制劑被小鼠攝入后，小鼠體內血糖水平被控 制，能有效預防糖尿病的發生;盧虹玉等人通過萃取和超濾技術從全緣馬尾藻中提取出4種 多酚提取物，并測試了 4種提取物的抗氧化能力和對sw579細胞增殖的影響，結果顯示褐藻 多酚提取物的總抗氧化能力與分子量大小負相關，對腫瘤細胞的抑制作用與濃度正相關； 魏玉西等研究發現鼠尾藻多酚能干擾凝血因子的活性和減少血小板內外Ca 2+的運輸，抗凝 血效果顯著。研究表明，海藻多酚在食品和醫藥領域存在研究價值。
[0003] 酪氨酸酶能羥基化單酚底物和氧化二酚底物，是一種活性中心含有雙核銅離子的 氧化還原酶。黑色素過度積累會導致果蔬褐變、皮膚色斑和黑色素瘤形成，而酪氨酸酶活性 大小同生物體中黑色素生成量密切相關。典型的酪氨酸酶抑制劑有曲酸、多酚類化合物、苯 甲醛和苯甲酸脂類衍生物等，已被廣泛應用于研究果蔬保鮮劑，化妝品美白劑和生物殺蟲 劑。螺旋藻是一種古老的絲狀藍藻，富含藻藍蛋白、螺旋藻多酚、小分子多糖等活性成分。我 國螺旋藻資源豐富，是螺旋藻原料生產大國，但我國螺旋藻主要進行簡單利用，且活性成分 開發深度不夠。
[0004] 有鑒于此，本發明人研究和設計了一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制 劑的用途，本案由此產生。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的用途， 從螺旋藻原料中提取出螺旋藻多酚，并對其進行酪氨酸酶活性抑制實驗，以期為螺旋藻資 源的開發利用提供實驗依據，同時研究出一種天然來源的經濟、安全的酪氨酸酶抑制劑。
[0006] 為了實現上述目的，本發明解決其技術問題所采取的技術方案是：
[0007] -種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的用途，以螺旋藻多酚提取物作 為活性成分之一或唯一的活性成分用于制備酪氨酸酶抑制劑。
[0008] 作為實施例的優選方式，以螺旋藻多酚提取物作為活性成分之一或唯一的活性成 分用于抗老年斑或抑制食品褐變的保鮮劑。
[0009] 作為實施例的優選方式，所述螺旋藻多酚提取物的制備方法：采用體積濃度為 80 %的乙醇提取螺旋藻，得到螺旋藻多酚粗提液，再將螺旋藻多酚粗提液于40°C減壓濃縮， 冷凍干燥后得到固態的螺旋藻多酚提取物。
[0010] 作為實施例的優選方式，螺旋藻多酚含量的測定方法:采用分光光度法，用福林酚 試劑對提取物中的多酚顯色，確定多酚含量:超純水溶解0.1 log沒食子酸，采用lOOmL容量 瓶定容，得沒食子酸標準儲備溶液;再用沒食子沒食子酸標準儲備溶液分別稀釋成10、20、 30、40和50iig ? ml/1的系列溶液，以超純水做空白對照，分別取l.OmL稀釋液置于比色管中， 加入5.OmL福林酚溶液，反應6min，加入4.OmL 7.5%Na2C03溶液，混勻，避光放置lh后，在波 長765nm下測定吸光值，制作標準曲線;螺旋藻多酚含量根據標準曲線比色測定。
[0011]本發明從螺旋藻首次提取出的多酚對酪氨酸酶活性的抑制，將為其應用于皮膚美 白、醫療、果蔬保鮮等領域提供可靠的理論依據，也將為綜合利用螺旋藻資源和研究安全、 經濟的酪氨酸酶抑制劑提供新途徑。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明沒食子酸的標準曲線；
[0013] 圖2為本發明螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用；
[0014] 圖3為本發明螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶二酚酶抑制機理的測定;其中，直線1-5所對應的螺旋藻多酚的濃度分別為0，0.67，1.33，2.00和2.67mg ? ml/1;
[0015] 圖4為本發明螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶二酚酶抑制類型及抑制常數的測定； 其中，直線1-5所對應的螺旋藻多酚的濃度分別為0，0.67，1.33，2.00和2.67mg ? ml/1。
【具體實施方式】
[0016] 1材料與方法
[0017] 1.1 材料
[0018] 1.1.1試劑與藥品螺旋藻粉由福建省六神保健品有限公司提供;福林酚試劑，沒 食子酸，酪氨酸酶，購自Sigma公司;無水碳酸鈉，購自汕頭市西隴化工廠；乙醇，左旋多巴等 實驗材料購自上海國藥化學試劑有限公司。
[0019] 1.1.2儀器紫外分光光度計，澳大利亞GBC儀器公司；恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市 鴻科儀器廠;FE20K酸度計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；真空冷凍干燥機，鄭州明天 儀器設備有限公司。
[0020] 1.2 方法
[0021] 1.2.1螺旋藻多酚的提取以螺旋藻粉為原料，采用80%乙醇提取酚類物質，再將 螺旋藻多酚粗提液于40 °C減壓濃縮，冷凍干燥后得到固態的螺旋藻多酚提取物。
[0022] 1.2.2螺旋藻多酚含量的測定采用分光光度法，用福林酚試劑對提取物中的多 酚顯色，確定多酚含量。超純水溶解0. ll〇g沒食子酸，100mL容量瓶定容，得沒食子酸標準儲 備溶液。再用沒食子沒食子酸標準儲備溶液分別稀釋成10、20、30、40和50邱《1111/1的系列溶 液，以超純水做空白對照，分別取1.0mL稀釋液置于比色管中，加入5. OmL福林酚溶液，反應 6min，加入4.OmL 7.5%Na2C〇3溶液，混勾，避光放置lh后，在波長765nm下測定吸光值，制作 標準曲線。螺旋藻多酚含量根據標準曲線比色測定。1.2.3螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶二 酚酶的抑制作用提取物對酶的抑制效果:通過固定底物濃度和酶濃度，測定不同效應物濃 度下的相對剩余酶活。螺旋藻多酚提取物溶解于二甲基亞砜(DMS0)，制成不同濃度的效應 物溶液。0.5謹〇1.1九-00?4底物溶液和2.89噸.1111/ 1酶液均用50111111〇1.1/1?116.8磷酸緩 沖液配制。在3mL反應體系中，先加入0. lmL效應物溶液，再加入2.8mL預先在30°C恒溫水浴 lOmin的底物溶液，最后加入0. lmL酶液，快速混勾。設定測定波長為475nm，測定反應體系的 光密度值隨反應時間的增長直線，消光系數e = 3700L ? mor1 ? cnf1，通過酶活力，計算半抑 制率IC5〇值。
[0023]提取物對酶的抑制機理:通過固定底物濃度，改變酶量，測定不同效應物濃度下的 酶活力。在含2.8mL 0.5mmo 1 ? PL-DOPA底物的測活體系中，測定酶量為1.15，1.73,2.31， 2.89和3.46yg ? ml/1時，不同濃度螺旋藻多酚提取物作用下酶的反應速率，判斷提取物對酶 的作用機理。
[0024]提取物對酶的抑制類型、抑制常數:通過固定酶濃度，改變底物的量，測定不同效 應物濃度下的酶活力。固定酶量為2.89yg ? ml/1，在螺旋藻多酚提取物濃度分別為0，0.67， 1 ? 33，2 ? 00和2 ? 67mg ? mL-1 的測活體系中，測定L-D0PA濃度為0 ? 3，0 ? 4，0 ? 5，0 ? 6和0 ? 7mmol ? 廠1時的酶反應速率。通過Lineweave-Burk雙倒數作圖，計算并比較動力學參數Km和Vm，判斷 抑制類型。
[0025] 2結果與分析
[0026] 2.1螺旋藻多酚提取物中總酚含量
[0027] 沒食子酸的Folin-Ciocalteus反應標準曲線如圖1。沒食子酸質量濃度在0~50y g ? ml/1時，吸光值A765與標準液濃度有良好的線性關系。沒食子酸標準工作曲線的線性回歸 方程為Y = 0.00123X-0.0086，相關系數R2 = 0.9996(Y為吸光值，X為沒食子酸濃度）。根據沒 食子酸的標準工作曲線公式和螺旋藻溶液在765nm波長下的吸光值，得出螺旋藻提取物中 的多酚含量為35.05mg ? g一、
[0028] 2.2螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶活力的影響
[0029]固定L-D0PA濃度和酶濃度，測定不同濃度螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶影響。由 圖2可知，酪氨酸酶的反應速率隨著螺旋藻多酚濃度的增大而下降，說明螺旋藻多酚提取物 對酪氨酸酶活力有抑制作用，半抑制率IC 5Q為6.23mg ? ml/1。
[0030] 2.3螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶的抑制機理
[0031]固定底物L-D0PA濃度，改變測活體系中酶量，測定酶量與酶活力的關系。由圖3可 知，隨著螺旋藻多酚提取物濃度的增大，直線斜率依次降低，且直線交點為原點，說明螺旋 藻多酚提取物對酪氨酸酶的抑制過程可逆，螺旋藻多酚提取物的加入沒有減少體系中有效 酶量，但酪氨酸酶的酶活力被抑制，其催化效率降低。
[0032] 2.4螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶的抑制類型與抑制常數
[0033] 固定酶濃度，改變底物的量，測定不同濃度螺旋藻多酚提取物對酶活力的影響。如 圖4(a)所示，以提取物作用于酪氨酸酶時，酶的反應速率與多巴濃度作Lineweaver-Burk雙 倒數圖，得到交點位于第二象限的一組直線。這表明，隨著螺旋藻多酚提取物濃度的升高， 心值變大，V m值變小，其抑制類型為混合競爭型。以圖4(a)中直線的斜率和縱軸截距對螺旋 藻多酚提取物作圖4(b)，圖4(c)，得抑制常數KjPK IS分別為1.94mg ? mL-1和6.83mg ? mL-、
[0034] 2.5海藻提取物及中藥美白成分對酪氨酸酶抑制作用的比較
[0035] 藍藻(螺旋藻）、綠藻(緣管滸苔）、紅藻(真江蘺）和褐藻(鐵釘菜)及中藥(銀杏葉、 甘草)提取物對酪氨酸酶的酶動力學參數見表1。由表1可知，六種不同來源的提取物對酪氨 酸酶的抑制過程都可逆。通過比較半抑制率IC 5Q值，可得六種提取物對酪氨酸酶的抑制效果 依次為:鐵釘菜提取物〉緣管滸苔提取物〉甘草提取物〉螺旋藻多酚提取物〉銀杏葉提取物〉 真江蘺提取物。
[0036] 表1天然提取物對酪氨酸酶二酚酶抑制效果比較
[0037] Table ICompar ison of inhitory effect of natural extracts on diphenolase of tyrosinase
[0039] 3 討論
[0040] 黑色素沉積會導致皮膚色斑和果蔬褐變，其生成量同酪氨酸酶的活性有關。從天 然植物中分離提取出安全、高效的酪氨酸酶抑制劑并應用于開發果蔬保鮮、化妝品美白等 產品一直是研究熱點，但關于海藻活性成分對酪氨酸酶抑制的研究報道較少。
[0041]螺旋藻中富含多種營養成分和生物活性物質，因具有解毒、增強免疫、抗菌、抗氧 化、抗腫瘤等功效而備受青睞。研究螺旋藻活性成分用于開發功能食品、化妝品和藥物成為 新熱點。我國經過近幾十年的發展已成為世界螺旋藻原料生產大國，但我國的螺旋藻原材 料以簡單利用為主，產品精加工程度不夠。
[0042]本文以螺旋藻粉為原料，利用乙醇從螺旋藻粉中萃取出多酚類物質，研究其對酪 氨酸酶活力的抑制效應，并比較了海藻活性成分和中藥美白成分的抑制效果。從研究結果 可知，80%乙醇提取的螺旋藻多酚提取物中，螺旋藻多酚含量較低，多酚含量為35.05mg ? g'螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶有抑制作用，對二酚酶的半抑制率（IC5Q)為6.29mg ? mL 提取物對酪氨酸酶二酚酶的抑制可逆，表明螺旋藻多酚提取物會降低酶催化效率，而不 減少有效酶量。螺旋藻多酚提取物對酶抑制類型為混合型，抑制常數Ki = l .94mg ? =6.83mg ? ml/1，表明螺旋藻多酚提取物可同時與游離酶和酶-底物復合物結合，且與游離 酶的結合能力更強；比較四種海藻提取物和中藥美白成分的動力學參數可知，海藻提取物 抑制酪氨酸酶活性，且部分提取物的抑制效果優于市場上的中藥提取物美白劑(甘草、銀杏 葉提取物），這為繼續研究螺旋藻中其它活性成分對酪氨酸酶的抑制作用提供了可能。
[0043] 螺旋藻多酚提取物對酪氨酸酶活性的抑制，將為其應用于皮膚美白、醫療、果蔬保 鮮等領域提供可靠的理論依據，也將為綜合利用螺旋藻資源和研究安全、經濟的酪氨酸酶 抑制劑提供新途徑。
[0044] 以上所述，僅為本發明較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的范圍，即依 本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。
【主權項】
1. 一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的用途，其特征在于：以螺旋藻多 酚提取物作為活性成分之一或唯一的活性成分用于制備酪氨酸酶抑制劑。2. 如權利要求1所述的一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的用途，其特 征在于：以螺旋藻多酚提取物作為活性成分之一或唯一的活性成分用于抗老年斑或抑制食 品褐變的保鮮劑。3. 如權利要求1所述的一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的用途，其特 征在于:所述螺旋藻多酚提取物的制備方法:采用體積濃度為80 %的乙醇提取螺旋藻，得到 螺旋藻多酚粗提液，再將螺旋藻多酚粗提液于40°C減壓濃縮，冷凍干燥后得到固態的螺旋 藻多酚提取物。4. 如權利要求1所述的一種螺旋藻中的多酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的用途，其特 征在于:螺旋藻多酚含量的測定方法:采用分光光度法，用福林酚試劑對提取物中的多酚顯 色，確定多酚含量:超純水溶解〇. 1 l〇g沒食子酸，采用l〇〇mL容量瓶定容，得沒食子酸標準儲 備溶液;再用沒食子沒食子酸標準儲備溶液分別稀釋成10、20、30、40和5(^8*!111/ 1的系列溶 液，以超純水做空白對照，分別取1. OmL稀釋液置于比色管中，加入5. OmL福林酚溶液，反應 6min，加入4.OmL 7.5%Na2C〇3溶液，混勾，避光放置lh后，在波長765nm下測定吸光值，制作 標準曲線;螺旋藻多酚含量根據標準曲線比色測定。
【文檔編號】A23L5/41GK105853342SQ201610326240
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】王力, 李健, 李莉莉, 鄧陽陽, 蘇文金
【申請人】集美大學