表皮片及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明涉及生物制品領域,公開了一種表皮片及其制備方法和應用。本發明的制備方法包括:制備膠原?殼聚糖多孔支架,然后將間充質干細胞接種至膠原?殼聚糖多孔支架上,再將膠原?殼聚糖多孔支架上的間充質干細胞誘導培養為表皮細胞。本發明的表皮片能夠明顯、高效、安全地促進大面積皮膚創面的再生、重構、修復與愈合。
【專利說明】
表皮片及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物制品領域,具體地,涉及一種表皮片及其制備方法和在制備皮膚 替代品中的應用。
【背景技術】
[0002] 對于大面積的皮膚全層缺損,臨床上常用的修復方法是自體或異體皮膚移植,但 這些方法會造成供區新的創傷。同時,供皮來源和免疫排斥問題也限制了其有效的應用。伴 隨組織工程技術的發展,組織工程皮膚成為最先用于臨床的組織工程產品,這些產品雖可 暫時覆蓋創面,但仍存在一定的免疫排斥反應,且治療效果也并不理想。組織工程的關鍵問 題是種子細胞和支架結構問題。目前常用的種子細胞為自體或同種異體的角質細胞及成纖 維細胞,但這些種子細胞因其自我增殖能力有限、易老化、不易獲得,且具有一定的免疫排 斥反應等限制了其應用。因此,如何改進組織工程皮膚,使其快速、高質量的修復創面,具有 重要的研究價值和治療前景。
[0003] 尋找取材容易并能在體外大量擴增的種子細胞是目前研究的熱點之一。近年來干 細胞的研究和發展為解決這一難題提供了新的思路和可能手段。研究表明,間充質干細胞 (mesenchymal stem cel Is,MSCs)具有自我更新能力、增殖能力強、低免疫原性等優勢,能 夠促進皮膚創面的愈合,其機制包括:能夠分化為皮膚組織相關細胞、促進成纖維細胞的增 殖、加速血管生成、抑制炎癥細胞因子等,特別是在合適的條件下可以分化為表皮細胞,為 制備雙層活性組織工程皮膚、表皮片并用于大面積皮膚缺損提供了豐富的種子細胞。
[0004] 以膠原和殼聚糖兩種高分子生物為基礎的膠原-殼聚糖組織工程支架是運用多學 科的方法和手段制備的一種較為完善的工程化組織,是能夠恢復、保持或改善皮膚功能的 皮膚替代品,它可以模擬細胞外基質,構建組織再生的框架,支架的形態和微觀結構直接影 響細胞的粘附、生長、迀移、增殖和代謝功能,最終使組織得以重建,完成創面的修復與再 生。但是,其治療大面積皮膚全層缺損的效率較低,不利于促進大面積創面的修復進程與皮 膚附件的再生。
[0005] 目前,治療大面積皮膚全層缺損研究仍未取得重大突破。隨著大面積創面研究的 進一步深入,組織工程皮膚在大面積創面應用研究上有了逐步發展,但如今的難點之一(如 前所述)是目前用于構建組織工程皮膚的種子細胞(如角質細胞和成纖維細胞)自我增殖能 力有限、易老化、不易獲得,且具有一定的免疫排斥反應,進而導致運用組織工程技術治療 大面積創面存在一定限制;難點之二是無法有效地將間充質干細胞運用在大面積創面的修 復與再生上,進而如何利用間充質干細胞安全、穩定、快速、高質量地獲得組織工程皮膚的 問題也越來越突出,是亟需解決的難題。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是為了克服現有技術中的上述缺陷,提供一種表皮片及其制備方法 和應用,該表皮片用于治療創傷等造成的大面積皮膚創面,能夠明顯、高效、安全地促進大 面積皮膚創面的再生、重構、修復與愈合。
[0007] 為了實現上述目的,第一方面,本發明提供了一種表皮片的制備方法,該方法包 括:制備膠原-殼聚糖多孔支架,然后將間充質干細胞接種至膠原-殼聚糖多孔支架上,再將 膠原-殼聚糖多孔支架上的間充質干細胞誘導培養為表皮細胞。
[0008] 第二方面,本發明提供了上述方法制備得到的表皮片。
[0009] 第三方面,本發明提供了上述表皮片在制備皮膚替代品中的應用。
[0010] 本發明具有以下有益效果:
[0011] (1)本發明的表皮片,能夠明顯加快大面積皮膚創面的損傷修復,這一加速作用是 將間充質干細胞接種至膠原-殼聚糖多孔支架上并將膠原-殼聚糖多孔支架上的間充質干 細胞誘導培養為表皮細胞來實現的,為治療大面積皮膚創面提供了有效手段,能夠明顯、高 效、安全的加快其修復進程與皮膚附件再生。
[0012] (2)本發明的表皮片,可以抑制創面的炎癥反應,促進血管新生及再上皮化,促進 創面愈合及促進損傷皮膚生成毛囊等附屬結構,避免免疫排斥反應,從而使損傷部位皮膚 結構和功能趨于正常化,能夠應用于慢性創面、大面積皮膚創傷、燒傷患者等缺乏可供移植 的自體皮膚,為促進皮膚創面愈合、解決移植皮源問題提供了新的出路。
[0013] (3)本發明的表皮片擁有合理的孔徑、孔隙、三維多孔結構、優良的生物降解率和 溶脹屬性,在體內可以較好的模擬正常皮膚微環境,釋放生物活性因子,有利于細胞迀移增 殖以及生長因子的浸潤,可以有效促進損傷部位移植后的快速血管新生及再上皮化,促進 大面積皮膚創面的修復再生和愈合,提高移植效率。
[0014] (4)本發明有效的揭示了表皮片在治療大面積創面中新的作用機制,為大面積創 面的治療提供了新思路。
[0015] (5)本發明的表皮片可以作為體外皮膚模型進行一些相關的基礎醫學領域比如皮 膚生理學及皮膚病理學方面的研究。
[0016] 本發明的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0017] 圖1顯示的是本發明實施例1的膠原-殼聚糖多孔支架的特性,其中,(A)為膠原-殼 聚糖多孔支架的肉眼直觀圖片,(B)為掃描電鏡(標尺長度為100μπι)下的膠原-殼聚糖多孔 支架的顯微圖片。
[0018] 圖2顯示的是本發明的采用模擬皮膚在體微環境下誘導間充質干細胞分化為表皮 細胞,即接種間充質干細胞至膠原-殼聚糖多孔支架材料表面、在條件培養基的作用下結合 氣-液培養的方式進行誘導分化為表皮細胞。(Α)體外間充質干細胞在支架上培養的HE染色 圖。(B)免疫組化檢測表皮細胞標志物的表達情況。(OWestern Blotting檢測表皮細胞標 志物的表達情況。
[0019] 圖3顯示的是細胞死活實驗(Live/Dead實驗)的結果圖,其中,綠色為活細胞,紅色 為死細胞。
[0020] 圖4顯示的是將實施例1的表皮片移植于全層皮膚損傷部位后第7天和第21天的皮 膚愈合情況圖。
[0021] 圖5顯示的是將實施例1的表皮片移植于全層皮膚損傷部位后第21天的組織學觀 察圖。
[0022] 圖6顯示的是將實施例1的表皮片移植于全層皮膚損傷部位后第7天和第21天的創 面愈合率統計圖(圖例中從左到右依次為空白對照組、單純支架組、對照組和實驗組)。
【具體實施方式】
[0023] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是,此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明,并不用于限制本發明。
[0024] 第一方面,本發明提供了一種表皮片的制備方法,該方法包括:制備膠原-殼聚糖 多孔支架,然后將間充質干細胞接種至膠原-殼聚糖多孔支架上,再將膠原-殼聚糖多孔支 架上的間充質干細胞誘導培養為表皮細胞。
[0025] 本發明的制備方法中,對于制備膠原-殼聚糖多孔支架的方法沒有特別的限定,可 以為本領域常用的各種制備方法。但是,本發明的發明人在研究中發現,在制備膠原-殼聚 糖多孔支架時,控制膠原-殼聚糖溶液中膠原和殼聚糖的特定的濃度和膠原-殼聚糖溶液的 pH值會得到孔徑大小不一的膠原-殼聚糖多孔支架。因此,為了進一步尋求更適于間充質干 細胞生長的膠原-殼聚糖多孔支架,優選情況下,制備膠原-殼聚糖多孔支架的方法包括:配 制膠原-殼聚糖溶液,使得膠原-殼聚糖溶液中膠原和殼聚糖的濃度均為l_5mg/mL,進一步 優選均為2_3mg/mL;然后將膠原-殼聚糖溶液的pH值調節為6-7,進一步優選為6.2-6.4;再 將膠原-殼聚糖溶液真空脫泡后注入模具中依次進行孵育處理、第一冷凍干燥處理、化學交 聯處理和第二冷凍干燥處理。
[0026] 本發明的制備方法中,對于配制膠原-殼聚糖溶液的溶劑沒有特別的限定,可以為 本領域常用的各種溶劑,優選情況下,所述溶劑為醋酸溶液,即,膠原-殼聚糖溶液為膠原-殼聚糖的醋酸溶液,進一步優選地,醋酸溶液中醋酸的濃度為〇. 05-0.5mol/L。
[0027] 本發明的制備方法中,對于配制膠原-殼聚糖溶液的方法沒有特別的限定,只要能 夠配制得到前述特定濃度的膠原-殼聚糖溶液即可,例如可以包括:分別將膠原粉末和殼聚 糖粉末溶解于醋酸溶液中,配制2-10mg/mL優選3-7mg/mL的膠原溶液和2-10mg/mL優選3-7mg/mL的殼聚糖溶液,然后以適當的體積比例將兩種溶液混合。
[0028]本發明的制備方法中,在制備膠原-殼聚糖多孔支架時,優選情況下,孵育處理的 條件包括:溫度為30_38°C,時間為25-40min。
[0029] 本發明的制備方法中,在制備膠原-殼聚糖多孔支架時,優選情況下,第一冷凍干 燥處理為先進行冷凍處理再進行干燥處理,冷凍處理的條件包括:溫度為-70~_90°C,時間 為18-30h;干燥處理的條件包括:溫度為-70~-90°C,時間為8-18h。
[0030] 本發明的制備方法中,在制備膠原-殼聚糖多孔支架時,優選情況下,化學交聯處 理的條件包括:將第一冷凍干燥處理得到的支架浸泡于交聯劑中,浸泡溫度為4_8°C,浸泡 時間為8_18h。對于交聯劑沒有特別的限定,可以為本領域常用的各種交聯劑,優選地,所述 交聯劑為H3C/NHS交聯劑。
[0031] 本發明的制備方法中,為了去除殘余交聯劑,在化學交聯處理之后可以用去離子 水洗滌支架2-4次,每次5-1 Omin。
[0032] 本發明的制備方法中,在制備膠原-殼聚糖多孔支架時,優選情況下,第二冷凍干 燥處理為先進行冷凍處理再進行干燥處理,冷凍處理的條件包括:溫度為-70~_90°C,時間 為18-30h;干燥處理的條件包括:溫度為-70~-90°C,時間為8-18h。
[0033] 本發明的制備方法中,在制備膠原-殼聚糖多孔支架時,優選情況下,膠原的來源 為豬、牛、羊、猴或鼠,進一步優選為牛,更進一步優選為牛肌腱。制備膠原粉末的方法可以 為本領域技術人員所公知的各種方法,在此不再贅述。
[0034] 本發明的制備方法中,本領域技術人員應該理解的是,所有操作均在無菌條件下 進行。
[0035] 本發明的制備方法中,優選情況下,將間充質干細胞接種至膠原-殼聚糖多孔支架 上(表面)的方法包括如下步驟:
[0036] (1)將膠原-殼聚糖多孔支架進行滅菌,然后在無菌條件下,將膠原-殼聚糖多孔支 架的pH值調節為7-7.5;
[0037] (2)將間充質干細胞接種至膠原-殼聚糖多孔支架上,30-38Γ下孵育4_6h。
[0038] 對于將膠原-殼聚糖多孔支架進行滅菌的方法沒有特別的限定,可以為本領域常 用的各種方法,例如可以采用鈷-60或電子束輻照滅菌,輻照劑量可以為20-30kGy。
[0039] 對于將膠原-殼聚糖多孔支架的pH值調節為7-7.5的方法沒有特別的限定,可以為 本領域常用的各種方法,例如可以為:在30-38 °C下,先用1 X roS緩沖液孵育膠原-殼聚糖多 孔支架2-4次,每次30min,然后棄除PBS,在30-38 °C下用低糖DMEM培養基孵育膠原-殼聚糖 多孔支架,每3-4h更換一次低糖DMEM培養基,更換2-4次直至低糖DMEM培養基的顏色不發生 改變、并測定pH值為7-7.5即可。
[0040] 步驟(2)中,將間充質干細胞僅一次接種至膠原-殼聚糖多孔支架表面。本發明的 發明人在研究中進一步發現,步驟(2)中,向膠原-殼聚糖多孔支架上接種的間充質干細胞 的密度對制備得到的表皮片能否有效促進大面積皮膚創面的修復再生有重要影響,而間充 質干細胞的接種密度為2.5 X 105-5 X 105個間充質干細胞/cm2膠原-殼聚糖多孔支架時,能 夠有效促進大面積皮膚創面的修復再生,因此,優選情況下,步驟(2)中,間充質干細胞的接 種量為2.5 X 105-5 X 105個間充質干細胞/cm2膠原-殼聚糖多孔支架。其中,本發明的發明人 發現間充質干細胞的接種量為3 X 105個間充質干細胞/cm2膠原-殼聚糖多孔支架時制備得 到的表皮片移植于大面積創面損傷部位的治療效果最佳。
[0041]本領域技術人員應該理解的是,在膠原-殼聚糖多孔支架上接種的間充質干細胞 能夠接種到膠原-殼聚糖多孔支架的表面,作為被誘導培養為表皮細胞的細胞。其中,對于 含有間充質干細胞的培養基沒有特別的限定,可以為本領域中用于培養間充質干細胞的各 種培養基,例如可以為低糖DMEM培養基或無血清培養基,前述各培養基均可通過商購獲得。 [0042]本發明的制備方法中,優選情況下,將膠原-殼聚糖多孔支架上的間充質干細胞誘 導培養為表皮細胞的方法包括:在30_38°C下,將接種有間充質干細胞的膠原-殼聚糖多孔 支架先在液面條件下培養2-4天,然后在氣-液條件下培養7-14天。優選地,液面條件下培養 所用的培養基為低糖DMEM,氣-液條件下培養所用的培養基為含5-20μΜ全反式維甲酸的無 血清角質細胞培養基KSFM。進一步優選地,液面條件下培養的實施方式包括:將接種有間充 質干細胞的膠原-殼聚糖多孔支架完全處于培養基環境中進行培養;氣-液條件下培養的實 施方式包括:將接種有間充質干細胞的膠原-殼聚糖多孔支架處于培養基環境和空氣環境 中進行培養,更進一步優選地,在氣-液條件下,以高度計,將至少1/2的膠原-殼聚糖多孔支 架處于培養基環境中。本發明的發明人在研究中發現,將在氣-液條件下誘導培養7天得到 的表皮片移植于大面積創面損傷部位的治療效果最佳。
[0043] 本發明的制備方法中,優選情況下,間充質干細胞為骨髓間充質干細胞、脂肪間充 質干細胞或臍帶間充質干細胞。骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞和臍帶間充質干細 胞可來自SD大鼠或人。對于SD大鼠或人的骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞和臍帶間 充質干細胞的制備方法沒有特別的限定,可以分別為本領域常用的各種制備方法,此為本 領域技術人員所公知,在此不再贅述。另外,骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞和臍帶 間充質干細胞均可通過商購獲得。
[0044] 第二方面,本發明提供了上述方法制備得到的表皮片。
[0045] 第三方面,本發明提供了上述表皮片在制備皮膚替代品中的應用。
[0046] 本發明的應用中,對于皮膚替代品沒有特別的限定,可以為本領域常用的各種皮 膚替代品。
[0047] 利用本發明的表皮片制備得到的皮膚替代品能夠明顯促進大面積皮膚創面的再 生、重構、修復與愈合,明顯促進大面積皮膚創面損傷部位新生血管的再生、再上皮化和減 少炎癥細胞浸潤,以及明顯促進毛囊等附屬結構再生和膠原重排,在最大程度上促進大面 積皮膚創面損傷部位皮膚結構和功能趨于正常化。
[0048] 實施例
[0049] 以下的實施例將對本發明作進一步的說明,但并不因此限制本發明。
[0050] 以下實施例和對比例中的實驗方法,如無特殊說明,均為本領域常規方法。下述實 施例和對比例中所用的實驗材料,如無特殊說明,均可市售獲得。
[0051]殼聚糖粉末購自Sigma公司。
[0052] 掃描電鏡購自日本日立公司,型號為TM100。
[0053] SD大鼠骨髓間充質干細胞購自天津衛凱生物工程有限公司。
[0054] EDC/NHS交聯劑的配制方法為:將EDC、NHS分別溶于95 %乙醇溶液中至濃度為 33nmol/L和8nmol/L,得到EDC溶液和NHS溶液,然后將EDC溶液和NHS溶液等體積混合。
[0055] 制備例
[0056] 本制備例用于說明膠原粉末的提取方法。
[0057] (1)取新鮮牛肌腱10g,去除周圍結締組織,將牛肌腱剪成1-2_大小的組織塊。
[0058] (2)將組織塊放入0.1質量% Na2C03溶液中浸泡2h,蒸餾水漂洗3次,每次lOmin。
[0059] (3)將組織塊放入含 lmo 1 /L NaCl 的0 · 5 % Tr i s-HCl (pH = 7 · 5)溶液中浸泡 12h,蒸 餾水漂洗3次,每次lOmin。
[0060] (4)將組織塊放入250mL含500mg胃蛋白酶的0.05mol/L的醋酸溶液中,4°C浸泡 72h,期間反復攪拌至充分消化成透明糊狀。
[0061 ] (5)將混合液在4°C,5000g下離心20min,取上清。
[0062] (6)將步驟(5)中的離心沉淀再進行步驟(4)、(5)的操作,重復操作2次。
[0063] (7)向所得上清溶液中加入其體積1 %的雙氧水,4°C靜置4h,去除沉淀雜質。
[0064] (8)向所得溶液中加入NaCl至沉淀不再析出,4°C靜置12h。
[0065] (9)將混合液在4°C,5000g下離心20min,收集沉淀。
[0066] (10)將步驟(9)中的上清液再進行步驟(8)、(9)的操作一次。
[0067] (11)將所得沉淀溶解于100ml濃度為0.05mol/L的醋酸溶液中,用0.05mol/L醋酸 溶液透析2天,再用超純水透析3天,每天換液三次至膠原溶液中鹽離子濃度為0.02-0.06mol/L 之間。
[0068] (12)將透析后的所得溶液-80 °C凍干后,通過真空冷凍干燥機在-80 °C下干燥24h, 獲得固體粉末膠原。
[0069] 實施例1
[0070] 本實施例用于說明本發明的表皮片及其制備方法。
[0071] (1)將殼聚糖粉末和制備例制得的膠原粉末分別溶于0.05mol/L醋酸溶液中,得到 濃度為6mg/mL的殼聚糖溶液和濃度為4mg/mL的膠原溶液。
[0072] (2)將等體積的殼聚糖溶液和膠原溶液混合均勻,獲得膠原-殼聚糖溶液,然后用 0.0 lmol/L的NaOH溶液調節膠原-殼聚糖溶液的pH值至6.3。
[0073] (3)將膠原-殼聚糖溶液攪拌均勻,真空脫泡后注入模具中,37°C孵育30min。
[0074] (4) -80 °C冷凍24小時后,置于真空冷凍干燥機中-80 °C凍干12h,得到膠原-殼聚糖 初級支架。
[0075] (5)將膠原-殼聚糖初級支架浸泡于EDC/NHS交聯劑中,4°C放置12h,用去離子水洗 滌三次,每次5min。
[0076] (6)將步驟(5)得到的膠原-殼聚糖支架于_80°C冷凍24小時后,再置于真空冷凍干 燥機中_80°C凍干12h,即獲得膠原-殼聚糖多孔支架。
[0077] (7)將步驟(6)得到的膠原-殼聚糖多孔支架進行鈷-60輻照滅菌,輻照劑量為 25kGy,然后在37°C、無菌條件下,將滅菌處理得到的膠原-殼聚糖多孔支架放置于6孔板,先 用1 X PBS緩沖液孵育膠原-殼聚糖多孔支架3次,每次30min,然后棄除PBS,用低糖DMEM培養 基孵育膠原-殼聚糖多孔支架,每3h更換一次低糖DMEM培養基,更換3次直至低糖DMEM培養 基的顏色不發生改變,測定膠原-殼聚糖多孔支架的pH值為7.2。
[0078] (8)棄除步驟(7)的低糖DMEM培養基,向每個孔板的膠原-殼聚糖多孔支架中加入 1〇〇μ1含有1.35X 106個骨髓間充質干細胞的低糖DMEM培養基,37°C下孵育5h。
[0079] (9)在37°C下,向每個孔板的膠原-殼聚糖多孔支架中加入2ml低糖DMEM培養基,將 步驟(8)得到的接種有骨髓間充質干細胞的膠原-殼聚糖多孔支架完全處于低糖DMEM培養 基環境中液面培養2天,然后棄除前述低糖DMEM培養基,向每個孔板的膠原-殼聚糖多孔支 架中加入1.5ml含10μΜ全反式維甲酸的KSFM培養基,將膠原-殼聚糖多孔支架在氣-液條件 下培養7天,所述氣-液條件為將液面培養后的膠原-殼聚糖多孔支架處于培養基環境和空 氣環境中進行培養,其中,以高度計,將2/3的膠原-殼聚糖多孔支架處于KSFM培養基環境 中,將1/3的膠原-殼聚糖多孔支架處于空氣中。
[0080] (10)從步驟(9)得到的膠原-殼聚糖多孔支架取樣,進行免疫組化實驗(一抗為鼠 抗cytokeratinl9(即細胞角蛋白19,1: 200)和鼠抗involucin(即外皮蛋白,1:1000),二抗 為山羊抗小鼠二抗(1:250))和Western Blotting實驗(一抗為鼠抗cytokeratinl9(l: 500) 和鼠抗involucin( 1:1000),二抗為山羊抗小鼠二抗(1:2000))以檢測表皮細胞標志物角蛋 白19和外皮蛋白的表達情況。其中,免疫組化實驗檢測表皮細胞標志物的表達結果如圖2 (B)所示,Western Blotting實驗檢測表皮細胞標志物的表達結果如圖2(C)所示。結果表明 膠原-殼聚糖多孔支架表面的細胞表達呈陽性,說明已成功誘導膠原-殼聚糖多孔支架表面 的骨髓間充質干細胞分化為表皮細胞并構建成表皮片。
[0081 ] 實施例2
[0082]本實施例用于說明本發明的表皮片及其制備方法。
[0083] (1)將殼聚糖粉末和制備例制得的膠原粉末分別溶于0.05mol/L醋酸溶液中,得到 濃度為5mg/mL的殼聚糖溶液和濃度為5mg/mL的膠原溶液。
[0084] (2)將等體積的殼聚糖溶液和膠原溶液混合均勻,獲得膠原-殼聚糖溶液,然后用 0.0 lmol/L的NaOH溶液調節膠原-殼聚糖溶液的pH值至6.2。
[0085] (3)將膠原-殼聚糖溶液攪拌均勻,真空脫泡后注入模具中,38°C孵育25min。
[0086] (4) -70 °C冷凍30小時后,置于真空冷凍干燥機中-90 °C凍干8h,得到膠原-殼聚糖 初級支架。
[0087] (5)將膠原-殼聚糖初級支架浸泡于EDC/NHS交聯劑中,6°C放置18h,用去離子水洗 滌三次,每次5min。
[0088] (6)將步驟(5)得到的膠原-殼聚糖支架于-90°C冷凍8小時后,再置于真空冷凍干 燥機中-70 °C凍干18h,即獲得膠原-殼聚糖多孔支架。
[0089] (7)將步驟(6)得到的膠原-殼聚糖多孔支架進行鈷-60輻照滅菌,輻照劑量為 20kGy,然后在30°C、無菌條件下,將滅菌處理得到的膠原-殼聚糖多孔支架放置于6孔板,先 用1 X PBS緩沖液孵育膠原-殼聚糖多孔支架2次,每次30min,然后棄除PBS,用低糖DMEM培養 基孵育膠原-殼聚糖多孔支架,每4h更換一次低糖DMEM培養基,更換4次直至低糖DMEM培養 基的顏色不發生改變,測定膠原-殼聚糖多孔支架的pH值為7.3。
[0090] (8)棄除步驟(7)的低糖DMEM培養基,向每個孔板的膠原-殼聚糖多孔支架中加入 100μΙ含有1.125 X 106個骨髓間充質干細胞的低糖DMEM培養基,30°C下孵育6h。
[0091] (9)在37°C下,向每個孔板的膠原-殼聚糖多孔支架中加入2ml低糖DMEM培養基,將 步驟(8)得到的接種有骨髓間充質干細胞的膠原-殼聚糖多孔支架完全處于低糖DMEM培養 基環境中液面培養4天,然后棄除前述低糖DMEM培養基,向每個孔板的膠原-殼聚糖多孔支 架中加入1.5ml含8μΜ全反式維甲酸的KSFM培養基,將膠原-殼聚糖多孔支架在氣-液條件下 培養14天,所述氣-液條件為將液面培養后的膠原-殼聚糖多孔支架處于培養基環境和空氣 環境中進行培養,其中,以高度計,將3/4的膠原-殼聚糖多孔支架處于KSFM培養基環境中, 將1/4的膠原-殼聚糖多孔支架處于空氣中。
[0092] (10)從步驟(9)得到的膠原-殼聚糖多孔支架取樣,進行免疫組化實驗和Western Blotting實驗(條件同實施例1)以檢測表皮細胞標志物角蛋白19和外皮蛋白的表達情況。 其中,免疫組化實驗檢測表皮細胞標志物的表達結果與圖2(B)相一致,Western Blotting 實驗檢測表皮細胞標志物的表達結果與圖2(C)相一致。結果表明膠原-殼聚糖多孔支架表 面的細胞表達呈陽性,說明已成功誘導膠原-殼聚糖多孔支架表面的骨髓間充質干細胞分 化為表皮細胞并構建成表皮片。
[0093] 實施例3
[0094] 本實施例用于說明本發明的表皮片及其制備方法。
[0095] (1)將殼聚糖粉末和制備例制得的膠原粉末分別溶于0.05mol/L醋酸溶液中,得到 濃度為4mg/mL的殼聚糖溶液和濃度為6mg/mL的膠原溶液。
[0096] (2)將等體積的殼聚糖溶液和膠原溶液混合均勻,獲得膠原-殼聚糖溶液,然后用 0.01m 〇l/L的NaOH溶液調節膠原-殼聚糖溶液的pH值至6.4。
[0097] (3)將膠原-殼聚糖溶液攪拌均勻,真空脫泡后注入模具中,37°C孵育40min。
[0098] (4) -90 °C冷凍18小時后,置于真空冷凍干燥機中-70 °C凍干18h,得到膠原-殼聚糖 初級支架。
[0099] (5)將膠原-殼聚糖初級支架浸泡于EDC/NHS交聯劑中,8 °C放置8h,用去離子水洗 滌三次,每次5min。
[0100] (6)將步驟(5)得到的膠原-殼聚糖支架于_70°C冷凍30小時后,再置于真空冷凍干 燥機中-90 °C凍干8h,即獲得膠原-殼聚糖多孔支架。
[0101] (7)將步驟(6)得到的膠原-殼聚糖多孔支架進行鈷-60輻照滅菌,輻照劑量為 30kGy,然后在37°C、無菌條件下,將滅菌處理得到的膠原-殼聚糖多孔支架放置于6孔板,先 用1 X PBS緩沖液孵育膠原-殼聚糖多孔支架4次,每次30min,然后棄除PBS,用低糖DMEM培養 基孵育膠原-殼聚糖多孔支架,每4h更換一次低糖DMEM培養基,更換3次直至低糖DMEM培養 基的顏色不發生改變,測定膠原-殼聚糖多孔支架的pH值為7.1。
[0102] (8)棄除步驟(7)的低糖DMEM培養基,向每個孔板的膠原-殼聚糖多孔支架中加入 100μΙ含有2.25X 106個臍帶間充質干細胞的低糖DMEM培養基,38°C下孵育4h。
[0103] (9)在37°C下,向每個孔板的膠原-殼聚糖多孔支架中加入2ml低糖DMEM培養基,將 步驟(8)得到的接種有骨髓充質干細胞的膠原-殼聚糖多孔支架完全處于低糖DMEM培養基 環境中液面培養3天,然后棄除前述低糖DMEM培養基,向每個孔板的膠原-殼聚糖多孔支架 中加入1.5ml含15μΜ全反式維甲酸的KSFM培養基,將膠原-殼聚糖多孔支架在氣-液條件下 培養10天,所述氣-液條件為將液面培養后的膠原-殼聚糖多孔支架處于培養基環境和空氣 環境中進行培養,其中,以高度計,將3/5的膠原-殼聚糖多孔支架處于KSFM培養基環境中, 將2/5的膠原-殼聚糖多孔支架處于空氣中。
[0104] (10)從步驟(9)得到的膠原-殼聚糖多孔支架取樣,進行免疫組化實驗和Western Blotting實驗(條件同實施例1)以檢測表皮細胞標志物角蛋白19和外皮蛋白的表達情況。 其中,免疫組化實驗檢測表皮細胞標志物的表達結果與圖2(B)相一致,Western Blotting 實驗檢測表皮細胞標志物的表達結果與圖2(C)相一致。結果表明膠原-殼聚糖多孔支架表 面的細胞表達呈陽性,說明已成功誘導膠原-殼聚糖多孔支架表面的骨髓間充質干細胞分 化為表皮細胞并構建成表皮片。
[0105] 對比例1
[0106] 按照實施例1的方法,不同的是,步驟(9)為:
[0107] (9)在37°C下,將步驟(8)得到的接種有骨髓間充質干細胞的膠原-殼聚糖多孔支 架完全處于低糖DMEM培養基環境中液面培養2天。
[0108] 試驗例1
[0109] 分別對本發明實施例1-3的步驟(6)得到的膠原-殼聚糖多孔支架的生物學性能和 機械性能進行評估,評估內容和方法如下:
[0110] (1)膠原-殼聚糖多孔支架的宏觀和微觀結果評估。本發明的膠原-殼聚糖多孔支 架的肉眼直觀圖片如圖1(A)所示,掃描電鏡下的實施例1的膠原-殼聚糖多孔支架的顯微圖 片如圖1(B)所示。其中,本發明實施例1的膠原-殼聚糖多孔支架的孔徑為115-145μπι、孔隙 約為94%,為相互交聯、高度均一的三維多孔網狀結構。
[0111] (2)對實施例1-3的膠原-殼聚糖多孔支架進行支架溶脹率測定,其中,以實施例1 的膠原-殼聚糖多孔支架的溶脹率的測定為例,測定方法包括:對實施例1的膠原-殼聚糖多 孔支架進行稱重,計為W1,在室溫下浸泡到去離子水中一定時間(如1、3、6、9、12天),然后再 稱重,計為W2,計算支架溶脹率(% ) = (W2-W1) /W1 X 100 %。
[0112] 實施例1-3的膠原-殼聚糖多孔支架的溶脹率如表1所示,由表1數據可以看出:本 發明的方法得到的膠原-殼聚糖多孔支架的溶脹性能良好。
[0113] 表1
[0114]
[0115] (3)對實施例1-3的膠原-殼聚糖多孔支架進行支架降解率測定,其中,以實施例1 的膠原-殼聚糖多孔支架的降解率的測定為例,測定方法包括:對實施例1的膠原-殼聚糖多 孔支架進行稱重,計為W1,在37°C將實施例1的膠原-殼聚糖多孔支架置于含lmg/mL的I型膠 原酶的1 XPBS溶液中,一定時間后(如第1、2、3、4、5天)取出支架,去離子水漂洗后烘干稱 重,計為W2,計算殘余質量(% ) = W2/W1 X 100%。
[0116] 實施例1-3的膠原-殼聚糖多孔支架的殘余質量如表2所示。生物材料在體內的降 解速度,應該滿足細胞對支架的降解要求,以促進修復細胞的增殖及迀移。由表2可以看出, 本發明的膠原-殼聚糖多孔支架均具有較為優良的生物降解性能以配合組織修復再生。
[0117] 表2
[0118]
[0119] (4)對實施例1-3的膠原-殼聚糖多孔支架進行機械性能測定,其中,以實施例1的 膠原-殼聚糖多孔支架的測定為例,測定方法包括:將實施例1的膠原-殼聚糖多孔支架剪裁 為40mm X 5mm X 0 · 3mm的條形,采用KES-G1材料試驗機測試其干燥狀態下的機械性能,拉伸 速度為10mm/min。同時將實施例1的膠原-殼聚糖多孔支架在去離子水中浸泡24h后取出,濾 紙吸去表面水分后相同條件下測定支架在濕性狀態下的機械性能。
[0120] 本發明實施例1-3中的膠原-殼聚糖多孔支架在干燥狀態和濕性狀態的拉伸強度 如表3所示。由表3中數據可知,本發明的方法得到的膠原-殼聚糖多孔支架均具有較好的機 械性能,在干燥狀態下,隨著殼聚糖濃度的增加,支架材料的斷裂程度逐漸增強,表明支架 的機械性能逐漸增強;但在干燥及濕性兩種狀態進行對比后發現,干濕狀態相差較少時比 較好,得到的膠原-殼聚糖多孔支架的拉伸強度較大且干濕狀態下可變范圍較小,說明該支 架具有優良的柔韌度。
[0121] 表3
[0123] 試驗例2
[0124] (1)通過細胞活性實驗檢測本發明實施例1-3的步驟(8)得到的接種有間充質干細 胞的膠原-殼聚糖多孔支架上的間充質干細胞的生長狀況。實施例1的結果如圖3所示,幾乎 所有細胞均為活細胞。實施例2-3的結果與實施例1相同,在此不再贅述。
[0125] (2)分別將本發明實施例1-3的步驟(8)得到的接種有間充質干細胞的膠原-殼聚 糖多孔支架用10%福爾馬林溶液中固定24小時,將固定好的支架材料進行脫水處理,放入 石蠟進行包埋,包埋好的蠟塊固定于切片機上,切成5-8微米厚的薄片,放于45°C恒溫箱中 烘干待用,進行蘇木精-伊紅染色,觀察間充質干細胞在支架材料中的排列分布情況。實施 例1的蘇木精-伊紅染色圖如圖2(A)所示。實施例2-3的結果與實施例1相同,在此不再贅述。 由上述結果可知,接種間充質干細胞的接種密度為2.5 X 105-5 X 105個間充質干細胞/cm2膠 原-殼聚糖多孔支架時,能夠將間充質干細胞接種至膠原-殼聚糖三維支架材料表面,細胞 在材料表面均勻分布,并且在材料表面能夠形成細胞層,類似于皮膚結構。
[0126] 試驗例3
[0127] 分別將實施例1步驟(7)得到的膠原-殼聚糖多孔支架(即單純支架組)、實施例1得 到的表皮片(即實驗組)和對比例1得到的支架(即對照組)移植于糖尿病全層皮膚損傷部位 (除支架不同外,其他條件均相同),觀察相應的損傷部位的愈合情況,同時對相同條件的損 傷部位不進行任何處理,作為空白對照組進行對比。
[0128] (1)檢測損傷部位在不同時間點愈合面積的動態變化。創面愈合率(%) = (原始傷 口面積-不同時間點的傷口面積)/原始傷口面積X100 %。
[0129] 上述不同處理組在第7天、第21天的皮膚愈合情況圖如圖4所示,結果表明:在損傷 后第0-21天,本發明的表皮片能夠明顯減少創面瘢痕的形成,明顯促進全層皮膚損傷部位 愈合。
[0130] (2)分別取移植21天后的空白對照組、單純支架組、實驗組及對照組的皮膚損傷組 織,于10%福爾馬林溶液中固定24小時。將固定好的組織塊進行脫水處理,放入石蠟進行包 埋,包埋好的蠟塊固定于切片機上,切成5-8微米厚的薄片,放于45°C恒溫箱中烘干待用,進 行蘇木精-伊紅染色。電鏡觀察不同處理組損傷部位的皮膚病理學改變及膠原分布情況。
[0131] 上述不同處理組在移植后第21天的糖尿病全層皮膚損傷部位的蘇木精-伊紅染色 圖如圖5所示。結果顯示在移植后第21天,本發明的表皮片能夠明顯促進損傷部位新生血管 的再生、再上皮化和減少炎癥細胞浸潤,以及明顯促進真皮毛囊等附屬結構再生,在最大程 度上促進損傷部位皮膚結構和功能趨于正常化。
[0132] (3)支架移植于全層皮膚損傷部位后第7天和第21天的創面愈合率統計圖如圖6所 示,結果顯示:在移植后第7天、21天,空白對照組的創面愈合率分別為50%和85%,而單純 支架組的創面愈合率分別為55%和88%,對照組的創面愈合率分別為59%和90%,實驗組 的創面愈合率則高達70 %和100 %。即,本發明的表皮片能夠明顯、高效、安全地促進大面積 皮膚創面的再生、重構、修復與愈合。
[0133] 以上詳細描述了本發明的優選實施方式,但是,本發明并不限于上述實施方式中 的具體細節,在本發明的技術構思范圍內,可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型,這 些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。
[0134] 另外需要說明的是,在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征,在不矛 盾的情況下,可以通過任何合適的方式進行組合,為了避免不必要的重復,本發明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0135] 此外,本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合,只要其不違背本 發明的思想,其同樣應當視為本發明所公開的內容。
【主權項】
1. 一種表皮片的制備方法,其特征在于,該方法包括:制備膠原-殼聚糖多孔支架,然后 將間充質干細胞接種至膠原-殼聚糖多孔支架上,再將膠原-殼聚糖多孔支架上的間充質干 細胞誘導培養為表皮細胞。2. 根據權利要求1所述的方法,其中,將間充質干細胞接種至膠原-殼聚糖多孔支架上 的方法包括如下步驟: (1) 將膠原-殼聚糖多孔支架進行滅菌,然后在無菌條件下,將膠原-殼聚糖多孔支架的 pH值調節為7-7.5; (2) 將間充質干細胞接種至膠原-殼聚糖多孔支架上,30-38Γ下孵育4-6h。3. 根據權利要求2所述的方法,其中,步驟(2)中,間充質干細胞的接種量為2.5 X105-5 X 1〇5個間充質干細胞/cm2膠原-殼聚糖多孔支架。4. 根據權利要求1所述的方法,其中,所述誘導培養的方法包括:在30-38Γ下,將接種 有間充質干細胞的膠原-殼聚糖多孔支架先在液面條件下培養2-4天,然后在氣-液條件下 培養7-14天; 優選地,液面條件下培養所用的培養基為低糖DMEM,氣-液條件下培養所用的培養基為 含5-20μΜ全反式維甲酸的KSFM培養基。5. 根據權利要求1所述的方法,其中,膠原-殼聚糖多孔支架的制備方法包括:配制膠 原-殼聚糖溶液,使得膠原-殼聚糖溶液中膠原和殼聚糖的濃度均為l_5mg/mL,優選均為2-3mg/mL;然后將膠原-殼聚糖溶液的pH值調節為6-7,優選為6.2-6.4;再將膠原-殼聚糖溶液 真空脫泡后注入模具中依次進行孵育處理、第一冷凍干燥處理、化學交聯處理和第二冷凍 干燥處理; 優選地,所述膠原-殼聚糖溶液為膠原-殼聚糖的醋酸溶液; 優選地,所述孵育處理的條件包括:溫度為30-38°C,時間為25-40min。6. 根據權利要求5所述的方法,其中,所述化學交聯處理的條件包括:將第一冷凍干燥 處理得到的支架浸泡于交聯劑中,浸泡溫度為4-8°C,浸泡時間為8-18h,優選地,所述交聯 劑為EDC/NHS交聯劑。7. 根據權利要求5所述的方法,其中,所述第一冷凍干燥處理和第二冷凍干燥處理均為 先進行冷凍處理再進行干燥處理,冷凍處理的條件包括:溫度為-70~-90°C,時間為18-30h;干燥處理的條件包括:溫度為-70~-90 °C,時間為8-18h。8. 根據權利要求1-7中任意一項所述的方法,其中,所述間充質干細胞為骨髓間充質干 細胞、脂肪間充質干細胞或臍帶間充質干細胞。9. 根據權利要求1-8中任意一項所述的方法制備得到的表皮片。10. 權利要求9所述的表皮片在制備皮膚替代品中的應用。
【文檔編號】A61L27/50GK105833354SQ201610333659
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月19日
【發明人】韓為東, 付小兵, 郝好杰, 陳德云, 鄭敬曦
【申請人】中國人民解放軍總醫院