一種生物響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體及其制備方法和應用

一種生物響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明提供了一種生物響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體，其特征在于，包括肽類樹狀大分子體系和抗腫瘤藥物前驅體；所述肽類樹狀大分子體系包括肽類樹狀大分子和成像分子，肽類樹狀大分子包括可逆化學鍵和羧基，成像分子包括可逆化學鍵或能與可逆化學鍵反應的官能團，成像分子引發肽類樹狀大分子交聯，形成肽類樹狀大分子體系；所述抗腫瘤藥物前驅體由抗腫瘤藥物經過物理或化學處理制得，抗腫瘤藥物前驅體和肽類樹狀大分子體系通過弱相互作用形成自組裝單元。本發明的肽類樹狀大分子自組裝體具有結構穩定、響應于體內特征的生物學信號、集診斷與治療一體的優點。
【專利說明】
一種生物響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體及其制 備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種生物響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體的制備方法及 其在生物醫學領域的應用研究。
【背景技術】
[0002] 近年來，我們通過發展肽類樹狀大分子及其自組裝策略，獲得了一系列性能優越 的樹狀大分子組裝系統，很大程度上減少了樹狀大分子精確合成的繁瑣步驟、改善了樹狀 大分子遞送系統的生物相容性;更為重要的是，樹狀大分子組裝系統更有利于實現納米系 統的功能整合與優化，大幅度提高了生物活性分子的傳遞效率。但是，樹狀大分子組裝體在 作為納米遞送系統的應用中也逐漸顯露出其不足之處：（1)基于弱相互作用形成的樹狀大 分子組裝體在穩定性存在不足，難以應對體內復雜的生理屏障；（2)缺乏診斷治療一體化的 多功能集成，無法滿足現代醫學的個體化治療需求。因此，利用現代分子與超分子構建策 略，發展體內循環穩定、腫瘤特定響應、診療一體的樹狀大分子組裝系統具有重要的基礎研 究和應用研究價值。

【發明內容】

[0003] 本發明針對現有技術中制備的肽類樹狀大分子組裝體存在的結構不穩定，在粒 徑、形貌和功能保持上的不足，本發明提供了一種結構穩定同時能夠響應于體內特征的生 物學信號的診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體。
[0004] 本發明采用的技術方案如下:一種生物響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝 體，包括肽類樹狀大分子體系和抗腫瘤藥物前驅體;所述肽類樹狀大分子體系包括肽類樹 狀大分子和成像分子，肽類樹狀大分子包括可逆化學鍵和羧基，成像分子包括可逆化學鍵 或能與可逆化學鍵反應的官能團，成像分子引發肽類樹狀大分子交聯，形成肽類樹狀大分 子體系;所述抗腫瘤藥物前驅體由抗腫瘤藥物經過物理或化學處理制得，抗腫瘤藥物前驅 體和肽類樹狀大分子體系通過弱相互作用形成自組裝單元。
[0005] 作為可選方式，所述肽類樹狀大分子為一代肽類樹狀大分子、二代肽類樹狀大分 子或三代肽類樹狀大分子，優選為三代肽類樹狀大分子。
[0006] 作為可選方式，所述肽類樹狀大分子為扇形肽類樹狀大分子。所述扇形肽類樹狀 大分子的外圍包括羧基，扇形肽類樹狀大分子的核心分子包括可逆化學鍵，內核具有疏水 性。所述扇形肽類樹狀大分子的結構式如下：
[0008]其中，Ri和Rm-起構成扇形肽類樹狀大分子的核心分子，m代表核心分子的官能 度，m為1或2 ;E為谷氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，組氨酸中的至少一種； D為酸性氨基酸，端基為羧基;G1.0、G2.0和G3.0分別代表一代肽類樹狀大分子、二代肽類樹 狀大分子和三代肽類樹狀大分子；
[0009]作為可選方式，所述可逆化學鍵pH敏感化學鍵、氧化還原敏感化學鍵、活性氧 (R0S)敏感化學鍵或酶敏感化學鍵中的一種。pH敏感化學鍵可以為腙鍵、酯鍵等;氧化還原 敏感化學鍵為二硫鍵、單硫鍵等;活性氧(R0S)敏感化學鍵為苯硼酸酯鍵等;酶敏感化學鍵 為組織蛋白酶敏感鍵、金屬基質蛋白酶敏感化學鍵等。可逆化學鍵能夠保證組裝體在循環 過程中穩定存在及腫瘤微環境響應敏感藥物釋放。
[0010]作為可選方式，肽類樹狀大分子的核心分子中具有類似縮醛、縮酮或縮硫酮的結 構。
[0011] 作為可選方式，所述成像分子由可修飾的成像分子制得。可修飾的成像分子可以 采用熒光分子，如鈣黃綠素(Calcein)，異硫氰酸熒光素(FITC)，羅丹明，菁染料(Cy系列染 料)中任意一種，也可以為核素分子(含 11(：、1^、150、1￥或82此等中至少一種）。優先0 75.5。
[0012] 作為可選方式，所述可逆化學鍵為HS-或-S-S^HS-或-S-S-在氧化還原環境中能 夠實現二者之間的相互轉化，能夠保證系統的穩定性及響應性。所述成像分子結構式如下： ?Λ
[0014] 其中，F為可修飾的成像分子。
[0015] 作為可選方式，所述抗腫瘤藥物采用疏水性抗腫瘤藥物或親水性腫瘤藥物。疏水 性抗腫瘤藥物可以為紫杉醇(ΡΤΧ)、疏水阿霉素(D0X)或甲氨蝶呤(ΜΤΧ)等;所述親水性抗腫 瘤藥物可以為替伊莫單抗、貝伐單抗或修飾的金屬藥物等。優選親水性抗腫瘤藥物。
[0016] 作為可選方式，所述抗腫瘤藥物采用親水性抗腫瘤藥物，其結構式如下：
[0018] 其中，Μ為金屬原子。Κ為堿性氨基酸，能夠提供氨基并與金屬發生配位作用，優選 為賴氨酸;R2為親水高分子聚合物，能夠增加抗腫瘤藥物的親水性。所述親水高分子聚合物 R2可采用聚乙二醇、聚乙二醇單甲醚和聚乙烯醇中任意一種，優選為聚乙二醇單甲醚。
[0019] 本發明還提供了一種生物響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體的制備方 法，包括如下步驟：
[0020] 1)制備肽類樹狀大分子；
[0021] 2)制備成像分子；
[0022] 3)將成像分子加入到肽類樹狀大分子的水溶液中，成像分子引發肽類樹狀大分子 的交聯，制備肽類樹狀大分子體系；
[0023] 4)抗腫瘤藥物的負載。包括疏水性抗腫瘤藥物或親水性腫瘤藥物的負載。首先制 備抗腫瘤藥物前驅體，再將去質子化的肽類樹狀大分子體系和抗腫瘤藥物前驅體混合，通 過弱相互作用形成肽類樹狀大分子組裝體。
[0024] 疏水性抗腫瘤藥物的裝載:將肽類樹狀大分子體系與疏水性抗腫瘤藥物共溶于少 量溶劑中，于超聲條件下緩慢滴加至大量去離子水中，超聲l〇min后，室溫下攪拌24h，濃縮， 過濾，濾液凍干，即可得到負載疏水性抗腫瘤藥物的肽類樹狀大分子組裝體；
[0025] 親水性抗腫瘤藥物的裝載:將親水性抗腫瘤藥物于水中活化制備抗腫瘤藥物前驅 體，將抗腫瘤藥物前驅體滴加至肽類樹狀大分子體系的水溶液中，室溫反應24h后，濃縮，透 析凍干，即可得到負載親水性抗腫瘤藥物的肽類樹狀大分子組裝體。
[0026] 作為可選方式，步驟1)中所述的肽類樹狀大分子的制備可選用發散法或收斂法或 發散-收斂相結合的方法。
[0027] 作為可選方式，步驟2)中成像分子的制備方法具體為：
[0028] 按比例稱取可修飾的成像分子（In當量），含引發基團的單官能團分子（1.2η當 量），縮合劑（1.2η當量)和催化劑（1.2η當量），室溫條件下在水中反應，反應結束后，透析除 去縮合劑及未反應的分子，凍干得到產物并于_20°C條件下儲存。
[0029] 作為可選方式，可采用以下制備方法制備步驟4)中所述親水性抗腫瘤藥物：
[0030] a)稱取氨基保護的的堿性氨基酸（In當量），親水高分子聚合物（In當量），縮合劑 (1.2n當量)和催化劑（1.2n當量），在0°C，氮氣保護下，加入到無水溶劑中，再往以上混合溶 液中加入有機堿(4n當量），而后在室溫條件下反應，反應結束后，所得溶液經洗滌，干燥，過 濾，減壓濃縮，經過柱層析分離得到帶有保護基團的堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物。
[0031] b)準確稱取帶有保護基團的堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物（In當量），加入 溶劑溶解后，再加入脫保護試劑（20η當量），在氮氣保護下室溫反應，脫除保護后，減壓濃 縮，通過萃取或沉淀處理得到堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物。
[0032] c)稱取抗腫瘤藥物（In當量），堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物（In當量)于室 溫條件下反應24h，濃縮透析得到親水性抗腫瘤藥物。
[0033]本發明還提供一種生物響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體(TSPDSs)的 應用，該組裝體在正常生理環境中具有良好的穩定性，但在體內特定環境的響應性實現組 裝體的迅速崩解。同時，通過成像分子和抗腫瘤藥物分子的引入，形成集成像和治療于一 體，能夠實現其在腫瘤診斷和腫瘤治療的應用。
[0034]本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥 的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0035]本發明的有益效果：
[0036] 1.本發明提供了一種超分子組裝方法，成功將成像分子及抗腫瘤藥物整合到同一 個納米粒子中，實現腫瘤的治療及載藥粒子體內外分布監測。
[0037] 2.本發明所述肽類樹狀大分子組裝體，具有精確的結構，以肽類樹狀大分子為基 礎賦予該體系良好的生物相容性，提高了整個系統的生物安全性。
[0038] 3 .本發明所述肽類樹狀大分子組裝體通過分層次組裝的方式制備，工藝簡單，可 以通過控制各原料的配比進行形貌，熒光強度，載藥量的控制，具有很強的可控性。
[0039] 4.本發明所述肽類樹狀大分子組裝體通過分層次組裝的方式制備，能夠通過不同 化學鍵的引入設計制備得到具有不同腫瘤微環境響應的載藥組裝體，實現粒子在循環過程 中的穩定性及腫瘤微環境響應性藥物釋放。
[0040] 5.本發明所述肽類樹狀大分子組裝體，提供了一種普適性的方法構建診生物響應 型診斷治療一體化的納米粒子，可以有更廣的生物醫學應用。
【附圖說明】
[0041 ]圖1為本發明實施例2中所肽類樹狀大分子的合成示意圖。
[0042]圖2為本發明實施例4中所述熒光分子前驅體的合成示意圖。
[0043]圖3為本發明實施例7中所述親水高分子聚合物修飾的抗腫瘤藥物前驅體的合成 示意圖。
[0044] 圖4為本發明生物響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體的制備流程圖。
[0045] 圖5為本發明實施例10中所述動態化學鍵穩定的組裝體包載疏水藥物D0X的熒光 光譜圖
[0046] 圖6為本發明實施例11中所述肽類樹狀大分子的臨界聚集濃度。
[0047] 圖7至圖9為本發明實施例12中所述肽類樹狀大分子，肽類樹狀大分子體系及 Tsross的粒徑和電位。
[0048] 圖10至圖12為本發明實施例12中所述肽類樹狀大分子，肽類樹狀大分子體系及 Tsross的透射電鏡圖片。
[0049] 圖13為本發明實施例12中所述Tsross的能譜分析圖。
[0050] 圖14為本發明實施例12中所述Tsross的X-射線電子能譜分析圖。
[0051 ]圖15為本發明實施例12中所述Tsross的熱重分析圖。
[0052] 圖16至圖20為本發明實施例13中所述TSH)Ss在不同環境中孵育不同時間時的粒 徑分布圖。
[0053] 圖21為本發明實施例14中所述Tsross體外藥物釋放結果。
[0054] 圖22為本發明實施例15中所述TSH)SS的蛋白吸附結果。
[0055] 圖23為本發明實施例16中所述TSH)Ss對A549細胞的毒性結果。
[0056] 圖24為本發明實施例16中所述TSH)Ss對A549細胞周期分布影響圖。
[0057]圖25為本發明實施例16中所述TSPDSs及商品化順鉑作用后細胞內Pt的分布定量 圖。
[0058]圖26和圖27為本發明實施例17中所述TSH)SS胞內遞送過程研究的激光共聚焦圖 片（附彩色圖）。
[0059]圖28為本發明實施例18中所述TSH)SS的活體成像圖片（附彩色圖）。
[0060]圖29為本發明實施例18中所述Tsross的離體分布圖片。
[00611圖30為本發明實施例19中所述Tsross對A549荷瘤鼠腫瘤體積影響結果。
[0062]圖31為本發明實施例19中所述TSroSs對A549荷瘤鼠體重影響結果。
[0063]圖32為本發明實施例19中所述TSPDSs對A549荷瘤鼠的腫瘤進行組織形態學及免 疫組化分析圖片。
[0064]圖33為本發明實施例19中所述TSH)SS對A549荷瘤鼠的心、肝、脾和肺進行組織形 態學分析圖片。
[0065]圖34為本發明實施例19中所述TSPDSs對A549荷瘤鼠的腎臟進行組織形態學及免 疫組化分析圖片。
[0066]圖35為本發明實施例19中所述TSPDSs對A549荷瘤鼠治療結束后的血尿素氮及肌 酐兩項生化指標進行檢測的結果。
[0067]圖36為本發明實施例20中所述TSH)SS的藥代動力學分析結果。
[0068]圖37為本發明實施例21中所述TSPDSs單次給藥后，Pt在腎及腫瘤組織處的分布結 果。
【具體實施方式】
[0069] 下面結合是實施例對本發明作進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例 證的目的，絕不限制本發明的保護范圍。以下實施例中所述原料選用分析純且均為市售。
[0070] 實施例1:肽類樹狀大分子的制備
[0071] a)對氨基酸進行官能團保護:根據所要制備的肽類樹狀大分子的核心分子表面官 能團的不同對氨基酸進行保護，如核心分子表面官能團為氨基則對氨基酸的氨基進行保 護，如核心分子表面官能團為羧基則對氨基酸的羧基進行保護；
[0072] b)制備一代肽類樹狀大分子:按比例稱取核心分子(官能度為n，n = l或2)、含保護 基團的氨基酸（1.5n當量），縮合劑（1.5n當量)和催化劑（1.5n當量），在0°C，氮氣保護下，加 入到無水溶劑中，再往混合溶液中加入有機堿(4n當量)進行脫水縮合反應，而后在室溫條 件下反應，反應結束后，所得溶液經洗滌，干燥，過濾，減壓濃縮，經過柱層析分離得到帶有 保護基團的第一代肽類樹狀大分子；
[0073] c)脫保護:準確稱取帶有保護基團的第一代肽類樹狀大分子（In當量)和脫保護試 劑(20η當量），用溶劑溶解，在氮氣保護下室溫反應，脫除保護，減壓濃縮，通過萃取或沉淀 處理得到第一代肽類樹狀大分子；
[0074] d)制備二代肽類樹狀大分子:按比例稱取第一代肽類樹狀大分子(官能度為2η)、 含保護基團的氨基酸(3η當量），縮合劑(3η當量)和催化劑(3η當量），在0°C，氮氣保護下，加 入到無水溶劑中，再加入有機堿(8n當量)進行脫水縮合反應，而后在室溫條件下反應，反應 結束后，所得溶液經洗滌，干燥，過濾，減壓濃縮，經過柱層析分離得到帶有保護基團的第二 代肽類樹狀大分子。
[0075] e)脫保護:準確稱取帶有保護基團的第二代肽類樹狀大分子（In當量)和脫保護試 劑(40η當量），用溶劑溶解，在氮氣保護下室溫反應，脫除保護，減壓濃縮，通過萃取或沉淀 處理得到第二代肽類樹狀大分子；
[0076] 重復以上縮合反應和脫保護步驟，可得到第三、第四代負電荷表面的肽類樹狀大 分子。
[0077] 本實施例中所述縮合劑、催化劑、有機堿、溶劑，可選擇現有技術中已知的用于羧 基與氨基的脫水縮合的各種縮合劑、催化劑、有機堿、溶劑。
[0078]實施例2:肽類樹狀大分子的具體合成例(合成路線如圖1)
[0079] a) -代肽類樹狀大分子(LA-G lu-COOH)的合成
[0080] 稱取lg硫辛酸（LA)，1.51g H-Glu(0tBu)-0tBu，1.12g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和0.79gl-羥基苯并三唑(Η0ΒΤ)于100mL帶支管的燒瓶中，抽真 空，充氮氣，反復三次，加入50mL重蒸二氯甲烷(DCM)，冰浴攪拌溶解，加入19.2mLN，N-二異 丙基乙胺(DIPEA)，繼續反應0.5h，撤去冰浴反應24h。依次用飽和NaCl，NaHC0 3和HCl(lmol/ L)洗滌，Na2S04干燥后，過濾，減壓除去溶劑，柱層析(洗脫劑為二氯甲烷/甲醇(DCM/Me0H = 15:1))分離得到淺黃色固體LA-G lu (OtBu) -OtBu。
[0081] b)脫保護
[0082] 稱取1.50gLA-Glu(0tBu)-0tBu于50mL帶支管的單頸瓶中，抽真空，充氮氣，加入 5mL重蒸DCM溶解原料，接著加入5.2mL三氟乙酸(TFA)反應4h，減壓除去TFA，油栗抽干后加 入無水乙醚攪拌得到白色沉淀，即為LA-Glu-COOH。產物無需提純，直接用于下一步反應。 [0083] c)二代肽類樹狀大分子(LA-G lu (G2) -C00H)的合成
[0084] 稱取l·00gLA-Glu-C00H，l·87gH-Glu(0tBu)-0tBu，l·39gEDCI和0·98gH0BT于 100mL帶支管的燒瓶中，抽真空，充氮氣，反復三次，加入50mLDCM，冰浴攪拌溶解，加入 24. OmLDIPEA，繼續反應0.5h，撤去冰浴反應24h。依次用飽和NaCl，NaHC03和HC1 (lmol/L)洗 滌，Na2S〇4干燥后，過濾，減壓除去溶劑，柱層析(洗脫劑為DCM/Me0H= 15:1)分離得到淺黃色 固體 LA-Glu(G2)(0tBu)-0tBu。
[0085] d)脫保護
[0086] 稱取1.00gLA-Glu (G2) (OtBu) -OtBu于50mL帶支管的單頸瓶中，抽真空，充氮氣，加 入3mL重蒸DCM溶解原料，接著加入3.7mL TFA反應4h，減壓除去TFA，油栗抽干后加入無水乙 醚攪拌得到白色沉淀，即為LA-Glu(G2)-C00H。產物無需提純，直接用于下一步反應。
[0087] e)三代肽類樹狀大分子(LA-Glu(G3)_C00H)的合成
[0088] 稱取0.50gLA-Glu(G2)_⑶0H，1.00g H-Glu(0tBu)-0tBu，0.73g EDCI和0.52g Η0ΒΤ于100mL帶支管的燒瓶中，抽真空，充氮氣，反復三次，加入50mLDCM，冰浴攪拌溶解，加 入2. lmLDIPEA，繼續反應0.5h，撤去冰浴反應48h。依次用飽和NaCl，NaHC03和HC1 (lmol/L) 洗滌，Na2S〇4干燥后，過濾，減壓除去溶劑，柱層析(洗脫劑為DCM/Me0H= 15:1)分離得到淺黃 色固體 LA-Glu(G3)(0tBu)-0tBu。
[0089] f)脫保護
[0090] 稱取1.00gLA-Glu(G3)(0tBu)-0tBu于50mL帶支管的單頸瓶中，抽真空，充氮氣，加 入3mL重蒸DCM溶解原料，接著加入3.7mL TFA反應8h，減壓除去TFA，油栗抽干后加入無水乙 醚攪拌得到淺黃色沉淀，即為LA-Glu(G3)-C00H。產物無需提純，直接用于下一步反應。
[0091] 如圖1中所示的LA-G 1 u (G3) -C00H的結構式，可以明顯看出LA-G 1 u (G3) -C00H是外 圍包括羧基，核心分子包括可化學逆鍵-S-S-的扇形肽類樹狀大分子。
[0092] 實施例3:熒光分子前驅體的制備
[0093]可修飾的成像分子采用熒光分子制備的成像分子即為熒光分子前驅體。
[0094]方法一:單官能團反應
[0095]按比例稱取熒光分子（In當量），含引發基團的單官能團分子（1.2η當量），縮合劑 (1.2η當量)和催化劑（1.2η當量），室溫條件下在水中反應，反應結束后，透析除去縮合劑及 未反應的分子，凍干得到產物并于-20°C條件下儲存。
[0096]方法二:雙官能團反應
[0097] 按比例稱取含引發基團的雙官能團分子（In當量），熒光分子(2.2η當量），縮合劑 (2.2η當量)和催化劑(2.2η當量），室溫條件下在水中反應，反應結束后，透析除去縮合劑及 未反應的分子，凍干得到產物冰浴-20°C條件下儲存。
[0098] 實施例4:熒光分子前驅體的具體合成例(合成路線如圖2)
[0099] 稱取1.10mgCy5.5-活性酯（Cy5.5-NHS)溶于200μ1二甲基亞砜(DMS0)，緩慢加至 O.lOmg胱胺的lmL水溶液中，室溫避光反應24h后，4°C透析(截留分子量為1000)除去有機溶 劑及未反應的分子。凍干得到Cy5.5-cystamine-Cy5.5,并于-20°C條件下儲存。根據圖2中 Cy5.5-cystamine_Cy5.5的結構式可知，Cy5.5-cystamine_Cy5.5 包括可逆化學鍵-S-S-。
[0100] 實施例5:肽類樹狀大分子體系的制備
[0101] 稱取100mg LA-Glu(G3)-C00H溶于水中，在其臨界膠束濃度之上，成為LA為疏水內 核，谷氨酸羧基為親水外圍的納米粒子。〇 . 90mg三（2-羧乙基）膦(TCEP)于水中與8.79mg Cy5.5-cystamine_Cy5.5反應45min將二硫鍵原位還原為疏基，并將其加入上述納米粒子溶 液中引發納米粒子的交聯，反應24h后去離子水中透析48h，凍干得到核穩定的肽類樹狀大 分子體系。
[0102] 實施例6:親水高分子聚合物修飾的抗腫瘤藥物前驅體的制備
[0103] a)稱取氨基保護的的堿性氨基酸（In當量），親水高分子聚合物（In當量），縮合劑 (1.2n當量)和催化劑（1.2n當量），在0°C，氮氣保護下，加入到無水溶劑中，再往以上混合溶 液中加入有機堿(4n當量），而后在室溫條件下反應，反應結束后，所得溶液經洗滌，干燥，過 濾，減壓濃縮，經過柱層析分離得到帶有保護基團的堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物。
[0104] b)脫保護:準確稱取帶有保護基團的堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物（In當 量），加入溶劑溶解后，再加入脫保護試劑(20η當量），在氮氣保護下室溫反應，脫除保護后， 減壓濃縮，通過萃取或沉淀處理得到堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物。
[0105] c)親水性抗腫瘤藥物前驅體制備:稱取抗腫瘤藥物（In當量），堿性氨基酸修飾的 親水高分子聚合物（In當量)于室溫條件下反應24h，濃縮透析得到親水性抗腫瘤藥物。堿性 氨基酸修飾的親水高分子聚合物中的端基為氨基，氨基和親水性抗腫瘤藥物中的金屬原子 形成配位鍵。將親水性抗腫瘤藥物（In當量)與AgN0 3(1.9n當量)于37°C條件下避光反應4h， 得到的白色沉淀通過lOOOOrpm離心15min，通過0.22μπι濾膜過濾即得抗腫瘤藥物前驅體。
[0106] 實施例7:親水高分子聚合物修飾的抗腫瘤藥物前驅體的具體合成例(合成路線如 圖3)
[0107] a)稱取lg甲氧基聚乙二醇(mPEG)，0· 35g Boc_Lys(Boc)-Boc，0· 23g EDCI和0· 16g Η0ΒΤ于lOOmL帶支管的燒瓶中，抽真空，通氮氣，反復三次，加入50mL DCM，冰浴攪拌溶解，加 入0.7mL DIPEA，繼續反應0.5h，撤去冰浴反應24h。依次用飽和NaCl，NaHC03和HC1 (lmo 1/L) 洗滌，Na2S〇4干燥后，過濾，減壓除去溶劑，柱層析(洗脫劑為DCM/Me0H=20:1)分離得到白色 固體Bo c_Ly s (Bo c) -mPEG (mPEG-K-Bo c)。
[0108] b)脫保護：稱取lg mPEG-K-Boc于50mL帶支管的單頸瓶中，抽真空，充氮氣，加入 lmL重蒸DCM中溶解原料，接著加入1. lmLTFA反應4h，減壓除去TFA，油栗后加入無水乙醚攪 拌得到白色沉淀，即為具有良好親水性的NH2-Lys-mPEG(mPEG-K)。產物無需提純，直接用于 下一步反應。
[0109] C)稱取lOO.OOmg K2PtCl4溶于2mL水中，向其中緩慢滴加68yL DMS0,室溫避光攪拌 4h，得到淺黃色沉淀，冰水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥得到Pt(DMSO)2Cl 2。
[0110] C)親水性抗腫瘤藥物前驅體制備:稱取50.00mg Pt(DMSO)2Cl2分散于lmLMeOH中， 緩慢滴加至133.89mg mPEG-K的MeOH中，室溫反應24h，mPEG-K的一端的NH2-中的氮原子與 Pt(DMSO)2Cl2中的Pt原子形成配位鍵，過濾除去未反應的固體，濾液濃縮得到親水性抗腫瘤 藥物Pt(II)-K-mPEG。稱取 100.OmgPt(II)-K-mPEG溶于水中，并與25.84mg AgN03于室溫避 光條件下反應4h以除去氯離子。白色沉淀通過lOOOOrpm離心15min，再通過0.22μηι濾膜過濾 去除上清液即得到親水高分子聚合物修飾的抗腫瘤藥物前驅體。
[0111] 實施例8:環境響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體的制備
[0112]稱取88.70mg核穩定的肽類樹狀分子體系，在3.20mg NaOH的水溶液中反應去質子 化，再與AgN03處理的Pt (II) -K-mPEG于37 °C條件下反應24h。去離子水中透析(截留分子量 為3500)48h，凍干得到穩定的環境響應型的肽類樹狀大分子組裝體(TSPDSshPtdD-K-mPEG中的Pt能夠和肽類樹狀大分子體系中外圍的羧基通過配位鍵實現藥物的裝載。圖4為 制備環境響應型診療一體化的肽類樹狀大分子組裝體的流程圖。
[0113]實施例9:疏水性抗腫瘤藥物的裝載
[0114]將核穩定的肽類樹狀分子體系與疏水性抗腫瘤藥物(一定質量比）共溶于少量良 溶劑(如二甲基亞砜）中，于超聲條件下緩慢滴加至大量去離子水中，超聲l〇min后，室溫下 攪拌24h，濃縮，過濾，濾液凍干，即可得到負載疏水性抗腫瘤藥物的生物響應型診療一體化 肽類樹狀大分子組裝體。
[0115] 實施例10:疏水藥物D0X的具體裝載實例
[0116] 稱取100.00mg核穩定的肽類樹狀分子體系和10.00mg疏水阿霉素(D0X)，溶于100μ L二甲基亞砜中，于超聲條件下緩慢滴加至10mL去離子水中，超聲10min后，室溫下劇烈攪拌 24h，濃縮，450μπι濾膜過濾，收集濾液，凍干，即可得到負載疏水D0X的組裝體。
[0117] D0X作為具有熒光的疏水模型藥物。通過熒光光譜可以驗證其是否包載入該組裝 體中。如圖5所示，與游離D0X相比，相同濃度下包載入組裝體內的D0X顯示出更低的熒光強 度，這是由于D0X聚集而導致的熒光淬滅，表明D0X被包載如組裝體疏水空腔。
[0118] 實施例11:肽類樹狀大分子臨界聚集濃度的測定實例
[0119]肽類樹狀大分子的臨界聚集濃度通過芘熒光法進行測定。具體的，將芘溶于丙酮 中制備到濃度6.0Xl(T5m〇l/L。肽類樹狀大分子lmL水溶液配置成一系列濃度（1.0ΠΓ 6至 1.0mg/mL)。向其中加入10yL花的丙酮溶液，超聲30min講丙酮徹底揮干。固定395nm發射波 長測定300nm至360nm的發射光譜。以濃度的對數為橫坐標，1338/1334為縱坐標，擬合得到 兩條直線，兩條直線的交點即為肽類樹狀大分子的臨界聚集濃度。
[0120]如圖6所示，該肽類樹狀大分子的臨界聚集濃度為43.6yg/mL。
[0121] 實施例12:TSPDSs的表征
[0122] 1)粒徑，電位及形貌表征
[0123] 肽類樹狀大分子，肽類樹狀大分子體系及肽類樹狀大分子組裝體(TSPDSs)配置成 水溶液l〇〇yg/mL，采用動態光散射法(DLS)測定其水合粒徑和Zeta電位，每個樣品重復3次。
[0124] 結果如圖7,圖8和圖9所示，肽類樹狀大分子粒徑為160.9±2.4nm，電位為-8.79土 0.45mV，肽類樹狀大分子體系粒子粒徑為67.6 ± 5.7nm，電位為-9.12 ± 0.20mV，結果表明肽 類樹狀大分子交聯后粒子具有更加緊實的結構，粒徑較小。通過超分子作用實現藥物裝載 及PEG化后，粒子粒徑進一步變大為126.4 ± 3.7nm，電位為-20.20 ± 0.27mV。
[0125] 對肽類樹狀大分子，肽類樹狀大分子體系及肽類樹狀大分子組裝體用透射電鏡 (TEM)進行形貌及粒徑的表征。將lOOyg/mL的樣品滴在銅網上，室溫條件下干燥后即可進行 檢測，如圖10-圖12所示，透射電鏡的結果均與DLS的結果相符合。
[0126] 2)特征能譜分析(EDS)及X-射線電子能譜(XPS)
[0127] 鉑元素在TSPDSs中的存在及存在形式通過特征能譜分析及X-射線電子能譜進行 分析。
[0128] TSPDSs在進行掃描電鏡檢測時同時進行特征能譜分析，如圖13所示，TSPDSs中可 見C、0、S、C1及Pt的特征峰。
[0129] TSroSs進行X-射線電子能譜分析，如圖14所示，Pt的結合能，75.8eV和72.3eV，表 明Pt以+2價的形式存在。
[0130] 3)熱重分析(TGA)
[0131] 準確稱取10mg的TSH)Ss，置于坩堝中，使用德國耐馳公司的熱失重分析儀，在空氣 氛圍中，以10°C/min的升溫速率測定TSroSs從40°C到900°C的質量變化曲線。同時相同條件 下對肽類樹狀大分子及mPEG-K的混合物做熱重分析用做對比。
[0132] 結果如圖15所示，肽類樹狀大分子及mPEG-K的混合物在溫度上升至420°C時，殘余 質量趨于平穩，溫度上升至600°C時，殘余質量為1.46%，而TSroSs在530°C時殘余質量趨于 平穩，最終殘余質量為14.44%。該結果表明在空氣氛圍中，隨著溫度的上升，有機物逐漸被 燃燒氧化并被吹掃氣帶走，最后至剩下無法被燃燒的金屬。殘余質量的差值為12.98%即為 tstoss中Pt的含量。
[0133] 實施例13: TSPDSs在不同生理環境中的粒徑變化
[0134] 將 TSPDSs 配置成100yg/mL 不同條件(磷酸鹽緩沖液、ρΗ=7·4、ρΗ = 6·8、ρΗ=5·0、 ΙΟμΜ DTT及10mM DTT)的水溶液，分別模擬正常生理環境，腫瘤組織環境及腫瘤細胞內環 境。孵育不同時間（011，0.511，1.011，6.011和12.011)后，通過01^測定粒子的粒徑變化。設置三 個平行樣。
[0135] 如圖16到圖20所示，在正常生理環境及腫瘤組織環境中（即pH 7.4，pH 6.8及10μ MDTT)，TSroSs的粒徑變化不大，而在腫瘤細胞內環境中（ρΗ= 5.0)，低pH條件下，TSPDSs粒 徑明顯變小，表明在酸性條件下該TSPDSs脫去PEG層釋放抗腫瘤藥物。而在強還原環境中 (10mM DTT)，該TSPDSs粒徑變大，表明該組裝體呈現解組裝的過程。這一結果揭示了該 Tsross在體內循環過程中穩定存在，當其到達腫瘤部位時能夠實現抗腫瘤藥物的釋放，同 時實現組裝體的崩解。
[0136] 實施例14: TSPDSs體外釋放行為的研究
[0137] 在lmL pH 7·4，ρΗ 6·8+10μΜ DTT，pH 5.0,及pH 5.0+10mM DTT的磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)中分別溶解lmgTSPDSs。分別將上述制備的溶液轉移至截留分子量為2000的透析袋 中，并浸沒于20mL相應的PBS中，于37°C條件搖床中孵育。在設定的時間點時，取出0.5mL透 析袋外的液體，并及時補充相應的新鮮PBS。設置三個平行樣。釋放的Pt用電感耦合等離子 共振質譜儀進行分析。
[0138] 結果如圖21所示，？!17.4條件下，釋放4811時，？七的釋放量不足20%;?!16.8+1(^1 DTT條件下，釋放48h時，Pt的釋放量不足50 %。而在pH 5.0條件下，釋放8h，Pt的釋放量即到 達50%以上。pH 5.0+10mM DTT條件下，釋放8h，Pt的釋放量達到了65%。表明腫瘤微環境低 pH條件能夠觸發Pt的釋放，同時強還原環境能夠觸發組裝體的崩解進而加速Pt的釋放。而 在正常生理環境中，TSPDSs能夠保持穩定，避免了藥物的提前釋放對正常組織造成損傷。
[0139] 實施例15: TSPDSs抗蛋白吸附研究
[0140]以牛血清蛋白（BSA)為模型蛋白，考察TSH)SS的蛋白吸附行為。將BSA配置成100μ g/mL的roS(pH 7.4)溶液。與等體積等濃度的商品化順鉑溶液于37°C孵育lh，2h，4h和6h后， 取lmL樣品，8000rpm離心15min，上清液用紫外可見(UV-Vis)分光光度計檢測280nm處的吸 收，通過標準曲線法測定吸附的蛋白量。設置三個平行樣。
[0141] 結果如圖22所示，商品化順鉑及TSPDSs的蛋白吸附量很低，均在20 %以下。表明 Tsross具有較好的抗蛋白吸附作用，具有較長的血液循環時間同時在血液循環過程中能夠 很好的保持其形態。
[0142] 實施例16: TSPDSs體外生物學評價
[0143] 1)細胞毒性評價
[0144] 利用CCK-8法測定TSPDSs的體外細胞毒性。選取處于生長活躍期的人肺腺癌細胞 (A549細胞)接種于96孔板中，初始細胞接種密度為8X 103個/孔，加入lOOyL RPMI 1640培 養基培養 24h，配置不同 Pt 濃度(0.002、0.01、0.02、0.1、0.2、1、2、4、10和2(^8/1^)的材料的 培養基溶液與細胞孵育48h。不同Pt濃度下等量的肽類樹狀大分子(D)，mPEG-K，D+mPEG-K的 培養基溶液作實驗對照。細胞不做任何處理作為空白對照。孵育48h后，移除培養基，PBS (pH 7.4)洗滌三遍，加入1 OOyL無血清培養基稀釋10倍的CCK-8，無細胞僅1 OOyL無血清培養基稀 釋10倍的CCK-8作對照，37 °C孵育2h后，用酶標儀測定450nm處的吸光值。每個濃度設置6個 平行樣。相對細胞存活率按以下公式計算：
[0145] Cell Viability = (0Dsampie-0Dbackgr_d)/(0Dcontr〇i-0Dbackgr_d) X 100%
[0146] 結果如圖23所示，D、mPEG-K，及兩者的物理混合物(D+mPEG-K)在低濃度和高濃度 時細胞存活率均在100 %左右，顯示出良好的生物相容性，而Tsross在Pt濃度為lyg/mL時從 100%的細胞存活率降至90%，隨著Pt濃度的增加，細胞存活率逐漸減低，4yg/mL時，細胞存 活率降至50%左右，10yg/mL時細胞存活率將至10%以下。肽類樹狀大分子及mPEG-K作為基 礎材料顯示出良好的生物安全性，而構建的TSH)S S具有較好的體外抗腫瘤效果。
[0147] 2)細胞周期檢測
[0148] 采用碘化丙錠(PI)染色流式細胞術(FACS)對材料對細胞周期的影響進行檢測。選 取處于生長活躍期的A549細胞接種于6孔板中，初始細胞接種密度為2 X105個/孔，將D+ mPEG-K，商品化順鉑及TSPDSs(Pt濃度為1.5yg/mL)分別與細胞孵育，細胞不做任何處理作 為空白對照。24h后，移除培養基，PBS(pH 7.4)洗滌一次，胰酶消化后收集細胞，lOOOrpm離 心5min，棄掉上清液，用冰浴預冷的70 %乙醇于4 °C固定2h后，冰浴預冷的roS洗兩次，按照 碧云天公司提供實驗操作手冊用500yLPI工作液重懸細胞，37°C條件下避光孵育30min，最 后使用流式細胞儀檢測細胞周期分布，488nm激發光，收集575nm處發射光。每個實驗組設置 三個平行樣。
[0149] 結果如圖24所示，未進行任何材料處理的細胞及D+mPEG-K處理的細胞顯示很低的 凋亡(subGl期細胞不足2% )，同時60%左右細胞處于G0/G1期，10%左右細胞處于S期，30% 左右細胞處于G2/M期。而商品化順鉑及TSPDSs處理的細胞顯示較低的凋亡細胞（subGl期 4%左右），但僅15 %左右的細胞處于G0/G1期，10%左右細胞處于S期，75 %左右細胞處于 G2/M期。相關研究表明，鉑類藥物能夠與DNA堿基發生配位，抑制DNA的復制，使得細胞周期 阻滯于G2/M期，最終引起細胞凋亡。實驗結果顯示通過設計制備得到的TSPDSs具有與順鉑 類似的抗腫瘤機制，而肽類樹狀大分子及mPEG-K對細胞周期無影響。
[0150] 3)胞內Pt分布
[0151] 選取處于生長活躍期的A549細胞接種于6孔板中，初始細胞接種密度為2X105個/ 孔，將商品化順鉑和TSPDSs(Pt濃度為1.5yg/mL)分別與細胞孵育24h后，移除培養基，PBS (pH 7.4)洗滌一次，胰酶消化后收集細胞，進行細胞計數后，lOOOrpm離心5min，收集細胞， 按照Thermo Fisher Scientific公司操作手冊進行細胞核細胞質分離。H202和HN03消解 后，利用ICP-MS進行細胞質細胞核內Pt含量的測定。
[0152] 結果如圖25所示，TSPDSs在細胞內的富集量為211.4ng Pt/106個細胞，略多于商 品化順鉑（196.5ng Pt/106個細胞）。同時TSH)Ss能夠遞送更多的Pt進入細胞核（52.1 % )， 商品化順鉑僅能遞送49.7%Pt如細胞核。
[0153] 實施例17: TSPDSs體外細胞遞送
[0154] 選取處于生長活躍期的A549細胞按初始密度為5 X103個/皿接種于玻底皿中，培 養24h，加入TSH)Ss分別孵育lh和3h，用roS(pH 7.4)洗滌兩遍，用4%多聚甲醛固定511^11后， 0:10進行細胞膜染色25111；[11，？133(。!17.4)洗滌兩遍，在激光共聚焦顯微鏡(0011；1；'003113861 scanning microscope，CLSM)下觀察并采集焚光圖片。
[0155] 結果如圖26所示，紅色熒光代表TSH)Ss，綠色代表DiO標記的細胞膜，lh時即能在 細胞能找到Tsross的紅色熒光。隨著孵育時間的增加，越來越多的紅色熒光進入細胞內。
[0156] 選取處于生長活躍期的A549細胞按初始密度為5X 103個/皿接種于玻底皿中，24h 后，加入了3?038分別孵育311和611，用?83(?!17.4)洗滌兩遍，用含有1^〇1^〇1?^81116 0冊-22(50mM)的培養基標記溶酶體，然后用PBS(pH 7.4)洗滌兩遍。細胞與谷胱甘肽乙酯(GSH-0Et)預先孵育2h后再與TSroSS孵育3h后進行溶酶體染色作比較。利用CLSM進行熒光圖像采 集。
[0157] 結果如圖27所示，紅色熒光代表TSPDSs，藍色代表LysoTracker標記的溶酶體。孵 育3h時，TSPDSs的紅色熒光和溶酶體的藍色熒光幾乎重疊，表明Tsross內吞進入溶酶體，隨 著孵育時間的增長，6h時，TSPDSs的紅色熒光和溶酶體的藍色熒光部分分離，表明Tsross從 溶酶體中逃逸出來。通過對細胞預先GSH-〇Et處理，提高細胞內GSH含量，在孵育3h即可觀察 到明顯的溶酶體逃逸現象。表明該Tsross通過溶酶體途徑進入細胞，并在溶酶體弱酸性條 件及高GSH濃度環境中發生崩解及藥物的釋放，同時熒光基團的引入能夠有效的實現整個 胞內途徑的示蹤。
[0158] 實施例18: TSPDSs體內成像效果評價
[0159] 1)體內成像
[0160] 選取4周齡的BALB/c雄性裸鼠，在其腋下接種2X 106個A549癌細胞，待其上腫瘤長 至100mm3左右，尾靜脈注射TSPDSs，單次給藥劑量為3.25mg Pt/kg/只，將小鼠用4%的水合 氯醛麻醉后，使用CRi Maestro EX活體成像儀，以675nm為激發波長，695nm為發射波長，在 注射前，及注射后lh，3h，6h進行活體成像研究。使用Maestro measurement software對成 像結果進行處理。
[0161] 結果如28所示，TSPDSs在給藥后lh開始在腫瘤組織處富集，隨著時間的增加， Tsross在腫瘤組織處富集量增大。表明Tsross能夠通過增強腫瘤滲透及滯留（epr)效應在 腫瘤組織處富集，通過診療粒子的構建能夠有效的將粒子在腫瘤組織處的富集過程可視 化，同時粒子在腫瘤組織處的富集能夠有效的降低藥物在其他組織的分布，從而降低藥物 的毒副作用。
[0162] 2)離體成像
[0163] 2處后，將裸鼠處死并將心、肝、脾、肺、腎及腫瘤進行剝離，用?85(?!17.4)洗滌兩 遍，置于CRi Maestro EX活體成像儀，以675nm為激發波長，695nm為發射波長進行成像研 究，小鼠尾靜脈注射生理鹽水的臟器最為對照。使用Maestro measurement software對成 像結果進行處理。
[0164] 結果如圖29所示，TSPDSs在腫瘤處富集量最大，與活體成像結果一致。
[0165] 實施例19:TSPDSs體內抗腫瘤效果評價
[0166] 1)小鼠腫瘤體積變化及體重變化
[0167] 選取4周齡的BALB/c雄性裸鼠，在其右后腿上部接種2X 106個A549癌細胞，待其上 腫瘤長至100mm3左右，將老鼠隨機分為4組(6只每組），分別尾靜脈注射生理鹽水，D+mPEG-K，商品化順鉑及TSPDSs，給藥劑量為3.25mg Pt/kg/只，每三天給藥一次，共給藥4次，同時 進行腫瘤體積及小鼠體重的測量。每三天測量一次，共持續21天。
[0168] 腫瘤體積變化結果如圖30所示，生理鹽水及D+mPEG-K組腫瘤體積增長至初始腫瘤 的6倍左右，而商品化順鉑及TSPDSs組腫瘤體積僅增長至初始腫瘤的1.5倍左右，且TSH)S S 的治療效果稍稍好于商品化順鉑。
[0169] 小鼠體重變化結果如圖31所示，生理鹽水及D+mPEG-K組小鼠體重變化不明顯，到 治療結束，小鼠體重稍稍上升。商品化順鉑組在第四次給藥時，小鼠體重開始下降，體重僅 為初始體重的90%，第五次體重測量時，小鼠的體重下降至最低，僅初始體重的85%，整個 治療結束，小鼠的體重未能恢復，僅為初始體重的87 %。而TSH)Ss組小鼠體重未見下降，且 小鼠體重有緩慢上升的趨勢。
[0170] 2)腫瘤及臟器切組織學及免疫組化分析
[0171] 小鼠在完成21天治療后，取其中三只斷頸處死，剝離心肝脾肺腎及腫瘤，4%福爾 馬林固定24h，石蠟包埋后切片，用蘇木精伊紅(H&E)染色進行組織病理學分析，用⑶31，Ki-67及TUNEL染色進行免疫組化分析。
[0172] 結果如圖32所示，腫瘤組織的病理學及免疫組化結果顯示，生理鹽水組及D+mPEG-K組，小鼠腫瘤組織腫瘤細胞形態正常，且分布密實緊湊，而商品化順鉑及TSPDSs組的腫瘤 組織處腫瘤細胞明顯變小，腫瘤組織疏松，不密實。通過⑶31對新生血管進行染色，Ki-67對 增殖細胞進行染色，及TUNEL對凋亡細胞進行染色，實驗結果表明生理鹽水及D+mPEG-K組新 生血管，增殖細胞很明顯，而凋亡的細胞較少。TSPDSs組小鼠腫瘤組織的新生血管及增殖的 細胞明顯減少，同時凋亡的細胞明顯增多。這一結果顯示，TSPDSs能夠有效的殺傷癌細胞， 抑制新生血管的生成及癌細胞的增殖，同時引起癌細胞的凋亡。
[0173] 對心肝脾肺臟器進行H&E染色分析，結果如圖33顯示，生理鹽水，D+mPEG-K及 TSPDSs組對小鼠的心肝脾肺四個臟器無明顯影響，商品化順鉑對小鼠的心脾肺無明顯影 響，但肝組織處干細胞的形態出現不正常，表明商品化順鉑對肝組織有一定的損傷。對腎臟 進行H&E染色劑TUNEL染色分析，結果如圖34所示，生理鹽水，D+mPEG-K及TSH)Ss組小鼠的腎 臟形態正常，而商品化順鉑組小鼠的腎臟出現明顯的病變，如腎小球的腫脹，邊緣糊化，同 時出現腎臟細胞的凋亡。
[0174]以上結果表明，通過整合納米技術能夠有效的進行癌癥治療其效果與商品化順鉑 相當，減少小分子藥物對正常組織產生的毒性從而降低藥物的毒副作用。
[0175] 3)生化指標分析
[0176] 小鼠在完成21天治療后，每組取三只，眼球取血至肝素管中，3000rpm離心15min， 分離得到血清進行血尿素氮及肌酐含量測定。
[0177] 結果如圖35所示，血尿素氮及肌酐表征腎的生理機能，商品化順鉑組血尿素氮及 肌酐兩項指標均高于其他三組，表明商品化順鉑對于腎臟有相應的毒副作用，也正是鉑類 藥物對腎臟的毒性限制著其在臨床上的應用。
[0178] 實施例20: TSPDSs藥代動力學分析
[0179] 選取4周齡BALB/c雄鼠，商品化順鉑及TSPDSs進行尾靜脈單次給藥，給藥劑量為 3.25mg Pt/kg/只，在給藥后特定的時間點(0.05h，0.5h，lh，6h和12h)對小鼠進行眼球取血 lmL，樣品用H2〇2和HN〇3進行消解后定容成5mL水溶液，ICP-MS測定樣品中Pt的含量。設置三 個平行樣。
[0180] 結果如圖36所示，0.05h時，商品化順鉑組Pt的血藥濃度僅13yg/mL左右，0.5h時， 血液中Pt的濃度已趨近于0，而TSroSs組在0.05h時，血液中Pt的濃度約為100yg/mL，6h時， Pt的濃度約為10yg/mL，表明TSroSs能夠有效的增加藥物的半衰期，增長藥物在血液中的滯 留時間。
[0181] 實施例21: TSPDSs組織分布分析
[0182] 選取4周齡的BALB/c雄性裸鼠，在其右后腿上部接種2 X 106個A549癌細胞，待其上 腫瘤長至100mm3左右，商品化順鉑及TSPDSs進行尾靜脈單次給藥，給藥劑量為3.25mg Pt/ kg/只，在給藥后2h和12h后將小鼠處死，剝腎和腫瘤，記錄重量后，用H2O2和HN〇3進行消解后 定容成5mL水溶液，ICP-MS測定樣品中Pt的含量。設置三個平行樣。
[0183] 結果如圖37所示，2h和12h時，商品化順鉑組藥物在腎組織處的量大于其在腫瘤處 的量。而TSPDSs組，藥物在腫瘤組織處的量明顯大于其在腎臟處的量，同時隨著時間的增 長，藥物在腫瘤組織處的量會明顯增加。
【主權項】
1. 一種生物響應型診療一體化的膚類樹狀大分子組裝體，其特征在于，包括膚類樹狀 大分子體系和抗腫瘤藥物前驅體;所述膚類樹狀大分子體系包括膚類樹狀大分子和成像分 子，膚類樹狀大分子包括可逆化學鍵和簇基，成像分子包括可逆化學鍵或能與可逆化學鍵 反應的官能團，成像分子引發膚類樹狀大分子交聯，形成膚類樹狀大分子體系;所述抗腫瘤 藥物前驅體由抗腫瘤藥物經過物理或化學處理制得，抗腫瘤藥物前驅體和膚類樹狀大分子 體系通過弱相互作用形成自組裝單元。2. 根據權利要求1所述的膚類樹狀大分子組裝體，其特征在于，所述膚類樹狀大分子為 一代膚類樹狀大分子、二代膚類樹狀大分子或Ξ代膚類樹狀大分子，優選為Ξ代膚類樹狀 大分子。3. 根據權利要求1所述的膚類樹狀大分子組裝體，其特征在于，所述膚類樹狀大分子為 扇形膚類樹狀大分子。4. 根據權利要求3所述的膚類樹狀大分子組裝體，其特征在于，所述扇形膚類樹狀大分 子的外圍包括簇基，扇形膚類樹狀大分子的核屯、分子包括可逆化學鍵，內核具有疏水性;所 述扇形膚類樹狀大分子的結構式如下： 式1其中，扣和Rm-起構成扇形膚類樹狀大分子的核屯、分子，m代表核屯、分子的官能度，m為！ 或2;E為谷氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，組氨酸中的至少一種;D為酸性 氨基酸;G1.0、G2.0和G3.0分別代表一代膚類樹狀大分子、二代膚類樹狀大分子和Ξ代膚類 樹狀大分子。5. 根據權利要求4所述的膚類樹狀大分子組裝體，其特征在于，所述可逆化學鍵抑敏感 化學鍵、氧化還原敏感化學鍵、活性氧(ROS)敏感化學鍵或酶敏感化學鍵。6. 根據權利要求1所述的膚類樹狀大分子組裝體，其特征在于，所述抗腫瘤藥物采用親 水性抗腫瘤藥物，其結構式如下： 式3其中，K為堿性氨基酸;化為親水高分子聚合物;Μ為金屬原子。7. 根據權利要求6所述的膚類樹狀大分子組裝體，其特征在于，所述親水高分子聚合物 R2為聚乙二醇、聚乙二醇單甲酸和聚乙締醇中任意一種。8. -種生物響應型診療一體化的膚類樹狀大分子組裝體的制備方法，其特征在于，包 括如下步驟： 1) 制備膚類樹狀大分子； 2) 制備成像分子； 3) 將成像分子加入膚類樹狀大分子的水溶液中，成像分子引發膚類樹狀大分子的交 聯，制備膚類樹狀大分子體系； 4) 抗腫瘤藥物的負載。9. 根據權利要求8中所述的膚類樹狀大分子組裝體的制備方法，其特征在于，所述抗腫 瘤藥物的負載包括W下步驟： 疏水性抗腫瘤藥物的裝載:將膚類樹狀大分子體系與疏水性抗腫瘤藥物共溶于少量溶 劑中，于超聲條件下緩慢滴加至大量去離子水中，超聲lOmin后，室溫下攬拌2地，濃縮，過 濾，濾液凍干，即可得到負載疏水性抗腫瘤藥物的膚類樹狀大分子組裝體； 親水性抗腫瘤藥物的裝載:將親水性抗腫瘤藥物于水中活化制備抗腫瘤藥物前驅體， 將抗腫瘤藥物前驅體滴加至膚類樹狀大分子體系的水溶液中，室溫反應24h后，濃縮，透析 凍干，即可得到負載親水性抗腫瘤藥物的膚類樹狀大分子組裝體。10. 根據權利要求9中所述的膚類樹狀大分子自組裝體的制備方法，其特征在于，所述 親水性抗腫瘤藥物的制備包括W下步驟： 1) 稱取氨基保護的堿性氨基酸（In當量），親水高分子聚合物（In當量），縮合劑（1.2n當 量)和催化劑（1.化當量），在〇°C，氮氣保護下，加入到無水溶劑中；再往W上混合溶液中加 入有機堿(4n當量），室溫條件下反應，反應結束后的溶液經洗涂、干燥、過濾、減壓濃縮，經 過柱層析分離得到帶有保護基團的堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物； 2) 準確稱取帶有保護基團的堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物（In當量），加入溶劑 溶解后，再加入脫保護試劑(20η當量），在氮氣保護下室溫反應，脫除保護后，減壓濃縮，通 過萃取或沉淀處理得到堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物； 3) 稱取抗腫瘤藥物（In當量），堿性氨基酸修飾的親水高分子聚合物（In當量)于室溫條 件下反應24h，濃縮透析得到親水性抗腫瘤藥物。
【文檔編號】A61K45/06GK105833294SQ201610282064
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】顧忠偉, 徐翔暉, 李蕓焜, 李亞超, 張曉 , 張志軍
【申請人】四川大學