骨細胞limk2基因及其表達產物的新應用

骨細胞limk2基因及其表達產物的新應用
【專利摘要】本發明公開了骨細胞LIMK2基因及其表達產物在制備用于治療與骨改建進程相關的疾病的藥物中的應用。本發明通過抑制骨細胞LIMK2基因及/或LIMK2基因表達產物，抑制骨細胞的細胞骨架在流體剪切力作用下的改建，從而直接地、特異性地上調骨細胞的力學敏感性，促進骨細胞本身的增殖，并通過骨細胞對成骨細胞和破骨細胞功能的調控，來控制骨改建的速率和平衡，最終加速骨改建進程，加快骨折、骨質疏松、骨缺損疾病、骨發育不全畸形等疾病的修復重建過程。
【專利說明】
骨細胞LIMK2基因及其表達產物的新應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，尤其涉及骨細胞UMK2基因及其表達產物在制備 用于治療與骨改建進程相關的疾病的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 骨改建是骨折、骨缺損等疾病修復重建過程中必須經歷的微觀過程，新生骨組織 必須經過骨改建成為成熟的骨組織方能承受外力。目前骨折、骨缺損等疾病的治療方法均 存在骨改建時間過長、短期內新生骨組織無法承受外力的缺點。無論是采用骨移植術(使用 自體骨、異體骨或人工骨替代品)還是牽張成骨或骨組織工程等方法進行骨折、骨缺損等疾 病的修復重建，新生的骨組織均需要經過骨改建從編織骨改建為板層骨，方能具有足夠的 強度來承受外力的作用。以骨移植術以及牽張成骨術為例，都需要經過10~12個月的骨改 建，才能形成穩固的骨組織，以達到日常活動所需的機械強度和功能需求。
[0003] 因此，如何加速骨改建的進程，使新生的骨組織盡快行使正常生理功能，是目前骨 折、骨缺損等疾病修復治療中面臨和亟待解決的重要問題。
[0004] 骨改建的細胞學基礎是基本多細胞單位(basic multicellular unit,BMU)，BMU 包括骨細胞、成骨細胞和破骨細胞，以及骨襯細胞、血源性細胞（包括巨噬細胞、淋巴細胞 等)等，其中骨細胞通過對成骨細胞和破骨細胞的調控促進骨改建的進行，調控著骨改建的 速率。骨改建過程包括啟動期(骨吸收期）、反轉期和骨形成期(終止期)等三個階段。啟動期 包括破骨前體細胞的募集、分化為成熟的破骨細胞以及骨吸收活動的激活和持續;反轉期 是破骨活動和成骨活動之間的轉換和過渡，包括破骨細胞的凋亡和成骨細胞的募集和分 化;骨形成期包括成骨細胞形成新骨并礦化以及成骨細胞的終末分化。在骨改建的過程中， 直接的效應細胞是成骨細胞和破骨細胞，骨細胞作為一個調控者，通過調控成骨細胞和破 骨細胞的功能來控制著骨改建的速率。在受到力學刺激后，骨細胞可以產生力學敏感性的 信號分子，如骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs),前列腺素 E2 (prostaglandin E 2，PGE2)，以及一氧化氮(nitric oxide,N0)，這些信號分子調控成骨細 胞和破骨細胞的募集、分化和功能活動。研究表明，骨細胞是腫瘤壞死因子配體(receptor of tumor necrosis factor ligand,RANKL)和骨保護素（osteoprotegerin，0PG)的主要來 源。骨細胞通過在樹突表面表達膜結合型RANKL，RANKL可以和破骨前體細胞(骨髓巨噬細 胞)直接結合，從而支持破骨細胞的生成。同時，骨細胞通過表達0PG，一方面0PG在骨細胞胞 內控制著RANKL在骨細胞胞膜上的表達量，另一方面，當0PG被分泌到骨細胞胞外時，可以作 為RANKL的誘騙受體，和RANKL結合，從而阻礙了 RANKL和破骨前體細胞表面的RANK結合，抑 制破骨細胞的成熟，因此，骨細胞通過調控RANKL/0PG的平衡影響著骨改建的成骨和破骨方 向。骨細胞還可以通過硬骨素等調控成骨細胞的功能，硬骨素通過與Wnt-β連環蛋白信號通 路的LRP5\4\6受體結合，抑制該信號通路的功能，抑制成骨。
[0005] 骨組織不斷受到外界的力學刺激，力學刺激主要以流體剪切力（F1 ui d shear stresS，FSS)的方式作用于骨組織細胞。骨細胞是主要的力學感受細胞，其力生化信號傳導 與肌動蛋白細胞骨架在力學刺激下的改建(actin cytoskeleton reorganization)有關。 在骨折、骨缺損等疾病修復過程中，早期制動期過后，提倡適度的功能鍛煉，以使新生的骨 組織的強度盡快得到提高。人體的日常活動和功能鍛煉可使骨組織不斷受到力學刺激，力 施加于骨組織后，通過兩種方式作用于骨組織細胞:一是通過細胞變形使細胞直接感受應 力;二是力引起骨基質發生形變，驅使位于骨陷窩-骨小管網狀結構和哈弗森系統中的間隙 液體流動，產生流體剪切力。這種液體流動對外界應力有級聯放大作用，是骨組織細胞的主 要力學刺激來源，并在骨組織細胞表面產生流體剪切力作用于骨組織細胞。骨細胞是骨組 織中含量最豐富的細胞，占骨組織細胞總量的90%以上，呈星狀包埋于鈣化的骨基質中，通 過細長的細胞突觸在骨細胞之間、骨細胞和其他骨組織細胞之間產生交流和溝通，形成一 個快速信號傳遞網絡。骨細胞是骨組織中主要的力學敏感性細胞，其對力學刺激的敏感性 大于成骨細胞和成纖維細胞。骨細胞受到流體剪切力后，可以通過多種途徑感受應力刺激。 骨細胞的包膜被間隙液和蛋白聚糖包裹著，細胞突觸中大部分是肌動蛋白，突觸上有ανβ3 整合素和蛋白栓繩(protein tethers)。蛋白栓繩在間隙液流動的作用下，可以發生形變， 隨后拖拽肌動蛋白細胞骨架，或者拉開張力激活的離子通道，允許鈣離子和其他的離子進 入細胞，激活多種化學信號級聯。流體剪切力也可以直接拖拽整合素，如α5β1整合素在細胞 突觸和胞體均有表達，也和半通道(hemi-channels)有關。激活的半通道會釋放信號分子如 ATP，發動信號級聯。機械信號可以從整合素被拖拽的部位開始傳遞，沿著肌動蛋白細胞骨 架到遠方，最終甚至可以通過LINC復合體傳遞到胞核中。施加在肌動蛋白纖維上的力也可 以直接開啟張力激活的離子通道。綜上，細胞骨架幾乎和應力感受的每一個步驟相關聯細 胞骨架影響著骨細胞對應力刺激的感受和應答。
[0006]骨細胞對力學刺激的敏感性下降將不利于骨改建的進行，骨細胞力學敏感性下降 與細胞的彈性模量有關。隨著年齡的增長，機械應力導致的成骨活動會下降，其原因之一便 是骨細胞對力學刺激的敏感性下降。當骨細胞受到持續的力學刺激時，細胞對力學刺激的 敏感性會下降，而在持續的力學刺激加載過程中插入間斷期，則有利于骨細胞力學敏感性 的恢復。研究表明，3D培養的骨細胞，其形態是立體的，呈球形，球形的骨細胞的彈性模量小 于2D培養的扁平的和貼壁的骨細胞，而球形的骨細胞對力學刺激的敏感性更高。細胞彈性 模量受到力學刺激下的肌動蛋白細胞骨架的改建的影響，LIMK2/cofilin信號通路調控的 細胞骨架改建在其中有重要作用。成骨細胞受到力學刺激后，細胞骨架會發生改建，肌動蛋 白應力纖維增加，持續的力學刺激會使細胞的硬度(彈性模量)增加，使細胞對后續力學刺 激的敏感性下降。在該過程中，L頂K2/cofilin信號通路調控的細胞骨架改建發揮了重要的 作用。細胞受到應力刺激后，肌動蛋白細胞骨架本身會發生改建(reorganization)，細胞骨 架的主要成分聚合態肌動蛋白（F-actin)變得更加致密，排列方向趨向一致，細胞骨架的應 力纖維沿著主要應變的方向排列，細胞變形，細胞硬度和收縮性增加，使細胞適應力學環境 的變化，細胞的力學敏感性下降。絲切蛋白Cofi 1 in是肌動蛋白解聚因子，是細胞骨架RhoA/ R0CK/UMK2/cofilin調節通路中最下游的細胞因子，具有直接解聚F-actin的能力。而UMK 可以磷酸化cof i 1 in的絲氨酸-3殘基并使之失活，使得cof i 1 in構象發生變化，阻止cof i 1 in 與肌動蛋白的結合，從而增強肌動蛋白的穩定性。研究發現，抑制cofilinl基因可以誘導細 胞形成粗大的應力纖維，F-actin聚集成簇，穩定微絲，促進細胞骨架改建。在非洲綠猴腎細 胞和神經纖維瘤細胞中過度表達UMK2可以促進肌動蛋白的合成，而沉默纖維母細胞UMK2 的表達可以抑制轉化生長因子β?(transforming growth factor，TGF-01)誘導的細胞骨架 改建。

【發明內容】

[0007] -方面，本發明的目的在于克服現有技術存在的骨改建時間過長、短期內新生骨 組織無法承受外力的不足而提供了骨細胞LIMK2基因及其表達產物在制備用于治療與骨改 建進程相關的疾病的藥物中的應用。本發明通過抑制骨細胞LIMK2基因及/或UMK2基因表 達產物，抑制骨細胞的細胞骨架在流體剪切力作用下的改建，從而直接地、特異性地上調骨 細胞的力學敏感性，促進骨細胞本身的增殖，并通過骨細胞對成骨細胞和破骨細胞功能的 調控，來控制骨改建的速率和平衡，最終加速骨改建進程，加快骨折、骨質疏松、骨缺損疾 病、骨發育不全畸形等疾病的修復重建過程。所述藥物能夠加速骨改建進程，從而加快與骨 改建進程相關的疾病的修復。
[0008] 作為對上述技術方案的進一步改進，所述與骨改建進程相關的疾病選自骨折、骨 質疏松、骨缺損疾病、骨發育不全畸形。
[0009] 作為對上述技術方案的進一步改進，所述藥物能夠加速骨植入物的骨整合、加速 口腔正畸治療。
[0010]作為對上述技術方案的進一步改進，所述藥物包括:骨細胞UMK2基因的抑制基因 激活劑、抑制骨細胞LIMK2基因表達的蛋白激活劑、抑制骨細胞LIMK2基因表達的s i RNA、骨 細胞UMK2基因轉錄后基因表達調控的microRNA激活劑、促進骨細胞UMK2基因表達的蛋白 降解分子、促進骨細胞LIMK2基因表達的因子及蛋白抑制劑。
[0011]作為對上述技術方案的進一步改進，所述藥物包括藥學上可接受的載體。
[0012] 另一方面，本發明還提供了抑制LIMK2基因的siRNA，所述siRNA選自siRNAl、 siRNA2和siRNA3中的至少一種，其中：
[0013] siRNAl 的序列為：
[0022] 作為對上述技術方案的進一步改進，所述siRNA為siRNA2,相較于siRNAl和 siRNA3，siRNA2的抑制效果最佳。
[0023]又一方面，本發明還提供了所述的抑制UMK2基因的siRNA在制備用于治療與骨改 建進程相關的疾病的藥物中的應用。
[0024] 本發明的siRNA通過抑制骨細胞LIMK2基因，抑制骨細胞的細胞骨架在流體剪切力 作用下的改建，從而直接地、特異性地上調骨細胞的力學敏感性，促進骨細胞本身的增殖， 并通過骨細胞對成骨細胞和破骨細胞功能的調控，來控制骨改建的速率和平衡，最終加速 骨改建進程，加快骨折、骨質疏松、骨缺損疾病、骨發育不全畸形等疾病的修復重建過程。
[0025] 作為對上述技術方案的進一步改進，所述與骨改建進程相關的疾病選自骨折、骨 質疏松、骨缺損疾病、骨發育不全畸形。
[0026] 作為對上述技術方案的進一步改進，所述藥物能夠加速骨植入物的骨整合、加速 口腔正畸治療。
[0027] 相對于現有技術，本發明的有益效果為：
[0028] 本發明通過抑制骨細胞LIMK2基因及/或LIMK2基因表達產物，抑制骨細胞的細胞 骨架在流體剪切力作用下的改建，從而直接地、特異性地上調骨細胞的力學敏感性，促進骨 細胞本身的增殖，并通過骨細胞對成骨細胞和破骨細胞功能的調控，來控制骨改建的速率 和平衡，最終加速骨改建進程，加快骨折、骨質疏松、骨缺損疾病、骨發育不全畸形等疾病的 修復重建過程。本發明的方法與目前對骨細胞力學敏感性的其他研究相比，更直接、更具有 特異性，可減少對細胞和機體正常生理活動的影響。
[0029] 現有治療方法中骨改建時間過長、短期內新生骨組織無法承受外力的不足，本發 明可為骨折、骨質疏松、骨缺損疾病、骨發育不全畸形等疾病的修復重建提供新思路和新方 法;有助于開發直接地、特異性地上調骨組織細胞力學敏感性的方法，從而發現骨組織疾病 治療的新靶點，有助于縮短疾病的臨床治療時間。
【附圖說明】
[0030] 圖1顯示了 FAM-siRNA轉染ML0-Y4骨細胞樣細胞熒光圖像，200X鏡下可見較多細 胞內熒光，熒光在胞內呈點狀散在分布，見細胞胞體形態呈多角形；
[0031] 圖2顯示了采用LIMK2特異性siRNA序列R1、R2、R3轉染ML0-Y4骨樣細胞系后的 UMK2 mRNA的相對表達量，其中，A:24h，siRNA序列R1、R2與對照組相比有統計學意義(P< 0.01)，siRNA序列R1、R2與siRNA序列R3相比有統計學意義(P<0.01)，采用序列R2轉染后， UMK2的mRNA相對表達量低于對照組的25% ;B:48h，siRNA序列R1、R2、R3抑制效果均有所下 降，與對照組相比較有統計學差異(P<〇. 01)，采用序列R2轉染后，UMK2的mRNA相對表達量 低于對照組的50%;
[0032] 圖3顯示了隨著轉染時間的增加，siRNA(Rl)組，UMK2蛋白表達水平呈現了先下降 后上升的趨勢，在36h LIMK2蛋白的表達水平是NC siRNA組的25%以下，36h之后，siRNA (R1)組和NC siRNA組之間UMK2蛋白表達差異有統計學意義(P<0.01);siRNA(R2)組，在 36h之后，UMK2蛋白的表達水平是NC siRNA組的30%以下，在各個時間點，siRNA(R2)組和 NC siRNA組之間UMK2蛋白表達差異有統計學意義(P<0.01);siRNA(R3)組，UMK2蛋白表 達水平在各個時間點均為是NC siRNA組的50%以上，在2411、36、7211，8丨1?財（1?3)組和叱 siRNA組之間UMK2蛋白表達差異有統計學意義(P<0.01)，其中，A、B、C、D分別代表24h、36、 48h，72h，Western Blotting檢測LIMK2蛋白表達水平；
[0033] 圖4顯示了 siRNA轉染24/48/72h后ML0-Y4細胞增殖活性，細胞增殖活性，與未進行 siRNA轉染的對照組相比較，采用RNA干擾抑制了 ML0-Y4骨細胞樣細胞的UMK2蛋白表達后， 兩組細胞的0D值差異不具有統計學差異(P>0.05);
[0034] 圖5為F-Actin細胞骨架熒光圖片（200X)，其顯示:在FSS( + )組中，NC siRNA轉染， FSS作用下，肌動蛋白細胞骨架F-Actin發生改建，細胞樹突伸長，F-Actin呈細絲狀排列；而 UMK2特異性siRNA轉染，FSS作用下，肌動蛋白細胞骨架F-Actin未發生改建，細胞樹突長度 和非加載組相近，F-Actin排列不規則，呈彌散狀;FSS(-)組，無論是否轉染，F-Actin綠色熒 光較弱，呈不連續的彌散狀；
[0035]圖6顯示了 RNAi沉默UMK2基因 FSS加載lh后單個細胞肌動蛋白細胞骨架平均熒光 強度。FSS加載后，NC siRNA組和siRNA組的熒光強度均有提高，加載后與加載前的單個細胞 平均熒光強度差異有統計學意義(P<〇.〇5)，NC siRNA組加載后單個細胞的平均熒光強度 是加載前的3.5倍，siRNA組加載后單個細胞的平均熒光強度是加載前的1.3倍。FSS加載后， NC siRNA組單個細胞的平均熒光強度是siRNA組的2倍，二者的差異有統計學意義（P< 0.01)。*與加力/陰性siRNA轉染組相比較有統計學差異，P<0.01。
[0036] 圖7顯示了 RNAi沉默UMK2基因 FSS加載lh后加載液中PGE2的濃度在開始加載后的 5min，siRNA組和NC siRNA組的PGE2釋放增加，5min之后，兩組的PGE2釋放減緩，siRNA組 PGE2釋放量始終高于NC siRNA組，5min之后的每個時間點，兩組之間的差異有統計學意義 (P<0.01)〇
[0037] 圖8顯示了RNAi沉默UMK2基因 FSS加載lh后ML0-Y4C0X-2 mRNA的表達FSS( + )組的 COX-2 mRNA相對表達水平較FSS(-)組高，在FSS( + )組，siRNA組⑶X-2的表達水平較NC siRNA組高，差異有統計學意義(P<0.01)。*與FSS(-)組相比有統計學差異，P<0.01。
【具體實施方式】
[0038] 本發明通過抑制骨細胞LIMK2基因及/或LIMK2基因表達產物，抑制骨細胞的細胞 骨架在流體剪切力作用下的改建，從而直接地、特異性地上調骨細胞的力學敏感性，促進骨 細胞本身的增殖，并通過骨細胞對成骨細胞和破骨細胞功能的調控，來控制骨改建的速率 和平衡，最終加速骨改建進程，加快骨折、骨質疏松、骨缺損疾病、骨發育不全畸形等疾病的 修復重建過程。相對于成骨細胞，骨細胞具有以下優勢：
[0039] (1)在成年動物中，骨細胞占全部骨組織細胞的90~95%，其數量遠遠大于成骨細 胞。
[0040] (2)細胞對力學刺激的敏感性下降將不利于骨改建的進行。研究表明骨細胞是骨 組織中主要的力學敏感性細胞，其對力學刺激的敏感性大于成骨細胞。
[0041] (3)本發明的目的是通過加速骨改建進程，促進骨折、骨缺損疾病的修復。骨改建 的細胞學基礎是基本多細胞單位(basic multicellular unit,BMU)，BMU主要包括骨細胞、 成骨細胞和破骨細胞。骨改建過程包括啟動期(骨吸收期）、反轉期和骨形成期(終止期）等 三個階段。啟動期包括破骨前體細胞的募集、分化為成熟的破骨細胞以及骨吸收活動的激 活和持續;反轉期是破骨活動和成骨活動之間的轉換和過渡，包括破骨細胞的凋亡和成骨 細胞的募集和分化;骨形成期包括成骨細胞形成新骨并礦化以及成骨細胞的終末分化。在 骨改建的過程中，直接的效應細胞是成骨細胞和破骨細胞，成骨細胞僅參與成骨過程。而骨 細胞作為一個調控者，能通過調控成骨細胞和破骨細胞的功能來控制骨改建的速率。骨細 胞既參與破骨過程，又參與成骨過程，在骨改建的過程中發揮重要的作用。
[0042] 綜上所述，抑制骨細胞UMK2基因對骨改建的促進作用比抑制成骨細胞UMK2基因 對骨改建的促進作用更好。
[0043]為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例對本發明 作進一步說明。其中，siRNAl與1?1、8丨尺祖(1?1)、8丨尺祖1?1、8丨1?嫩序列1?1可替換使用；8丨1?嫩2與 尺2、8丨1?嫩(1?2)、8丨尺祖1?2、8丨1?嫩序列1?2可替換使用；8丨1?嫩3與1?3、8丨尺祖(1?3)、8丨尺祖1?3、81尺· 序列R3可替換使用。
[0044] 實施例1
[0045] ML0-Y4骨樣細胞系UMK2基因的RNA干擾及其對ML0-Y4骨樣細胞系在流體剪切力 作用下細胞骨架改建的影響
[0046] 1.材料：
[0047] 1.1.實驗細胞：
[0048] P35 ML0-Y4骨樣細胞系，美國Lynda F Bonewald教授惠贈。
[0049] 1.2.主要的實驗儀器：
[0050]
[0051 ] 1.3.主要的試劑和耗材：


[0055] 1.4.主要的溶液配制：
[0056] 1)含5%血清的α-ΜΕΜ培養基：一袋α-ΜΕΜ粉劑（8)，恥!1〇) 32.28，加(1詘20定容至比， 磁力攪拌器攪拌60min，調節pH為7.2，過濾除菌，加入熱滅活的胎牛血清(FBS-2.5% )和小 牛血清(CS-2.5 % )，配制成血清含量為5 %的培養基。
[0057] 2)DPBS緩沖液：一袋DPBS粉劑(g)，加入ddH20定容至1L，高溫高壓滅菌。
[0058] 3)鼠尾I型膠原溶液：1.2ml膠原，44.4微升乙酸，38755.6微升滅菌ddH20混合配成 40ml濃度為0.15mg/ml的鼠尾I型膠原溶液。
[0059] 4) SDS-PAGE電泳液：取一瓶可以配制1L SDS-PAGE電泳液的粉劑，加 ddH20定容至 lL〇
[0000] 5)Western轉膜液：取一瓶可以配制1L Western轉膜液的粉劑，加入ddH2〇到 700ml，加入200ml無水乙醇，加入ddH2〇定容至1L。
[0061 ] 6)TBS緩沖液：Tris 1.21g，NaCl 8.77g，ddH20 800ml，用 1M的HC1 調pH至8.0,加 ddH2〇 定容至 1000ml。
[0062] 7) TBS-T緩沖液:將0 · 1 %的Tween-20加入配好的TBS中。
[0063] 8)封閉緩沖液:將5%質量體積比脫脂奶粉溶于TBS-T。
[0064] 9)配制 Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 的 12%分離膠：將10%505(0.051111)、1111〇1/11^8 (PH8.8,1.3ml)、10%過硫酸胺(0.05ml)、30%丙烯酰胺(2.0ml)、雙蒸水（1.6ml)混勻后，加 入TEMED，立即混勻并將其倒入固定好的玻璃板中，注意留出空間以備加入濃縮膠。將水小 心緩慢注入，直至位于膠液面上約2_3mm高。待分離膠完全聚合后傾斜倒出覆蓋的水層，殘 留的水用濾紙吸干凈。
[0065] 10)配制 Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 的 5% 濃縮膠：把 10%SDS(0.02ml)、lmol/lTris(PH 6.8，0· 25ml)、10%過硫酸胺（0.02ml)、30%丙烯酰胺(0.33ml)、雙蒸水（1.4ml)混勻。加入 TEMED，加入后快速旋動混合物并倒入玻璃板中，插入梳子，將凝膠置于室溫，濃縮膠聚合后 即可處理樣品。
[0066] 11)3.7%多聚甲醛固定液:將3.7g多聚甲醛加入80ml PBS中，微熱攪拌直至固體 全部溶解，調節pH值為7.4，PBS定容至100ml，4°C避光保存。
[0067] 12)FITC-Phalloidin工作液的配制：加入1 .5ml甲醇，得到濃度為6.6μΜ的 Pha 11 〇 i d in溶液，-20 °C避光保存。
[0068] 2 ·實驗方法：
[0069] 2.1 ML0-Y4骨細胞樣細胞的培養、傳代、凍存及復蘇
[0070] 2.1.1 ML0-Y4骨細胞樣細胞的復蘇、培養及傳代
[0071]往100mm的培養皿加入8mL膠原溶液，室溫包被lh后，傾斜培養皿數min，移去溶液， 用DPBS沖洗去除多余的酸。將凍存管至于37°C水浴融化，將細胞懸液轉移入15mL離心管中， 加入9mL含2.5 % FBS+2.5 % CS血清的α-ΜΕΜ培養基，離心后棄上清，加入含有5 % FBS和5 % CS 的α-ΜΕΜ培養基，待細胞長到60 %~70 %融合度，可以1:6~1:7進行傳代。將細胞培養液去， 然后在平皿內加入2~4mL胰酶后置于培養箱內消化，然后以1:1~1:2的體積加入含血清的 培養基終止消化，將細胞以1:6左右的比例分裝，加入培養基至12mL/100_。
[0072] 2 · 1 · 2 ML0-Y4骨細胞樣細胞的凍存
[0073] 將細胞培養液移去，消化后進行細胞計數，離心1000~1500r/min 5min，同時避光 條件下，配制凍存液(60%<1-|^1，30^^83，10%0130)。細胞離心后，棄上清，加入凍存液，以 1 X 106cel ls/mL/的密度分裝，每管1~1.5mL，迅速放入梯度凍存盒內，放入-20 °C冰箱內， 24h后移入-80 °C冰箱，盡快放入液氮。
[0074] 2.2脂質體介導的siRNA轉染ML0-Y4骨細胞樣細胞
[0075] 2.2.1實驗分組:根據轉染時使用的siRNA濃度的不同分為9組:其中1~9組中每組 siRNA/脂質體的用量分別為 0.5/0 ·5、0· 5/1、0· 5/1.5、1/0.5、1/1、1/1.5、1.5/0.5、1.5/1、 1 · 5/1 · 5(yL)。另設一空白對照組，只加 lyL的Lipofectamine?2000。
[0076] 2.2.2消化并接種細胞:在轉染前一天，將細胞以9.5 X 104個/孔的密度接種到鼠 尾一型膠原包被的24孔板中，加入0.5mL的培養基，這樣細胞在轉染時將會達到50%的匯合 度。
[0077] 2.2.3配制轉染混合物:分別將3以1^、6以1^、9以1^奸41標記的陰性8丨1?祖溶于45(^1^的 Opti-MEM中，輕輕混勻。分別將3yL、6yL、9yL的Lipofectamine?2000溶于450yL的Opti-MEM 中，輕輕混勻，室溫孵育5min。將含有siRNA和Lipofectamine?2000的溶液各取150yL、交叉 配對混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，配成1~9組s iRNA/脂質體復合物。
[0078] 2.2.4轉染細胞：將細胞培養基換成含有1 %FBS+1 % CS血清的a-MEM450mL，將 siRNA/脂質體混合物依次加入24孔板中，每孔加入50μΙ^81ι后換成含2.5%FBS+2.5%CS的 a-MEM培養基500yL。14h后冷PBS洗3次，倒置熒光顯微鏡觀察。
[0079] 2.2.5轉染效率觀察:倒置熒光顯微鏡下觀察24孔板，拍照存檔。
[0080] 2.3 RNA干擾后的UMK2 mRNA水平的檢測 [0081 ] 2 · 3 · 1使用siRNA轉染ML0-Y4骨細胞樣細胞
[0082] 1)在轉染前一天，將細胞以4.75X 105個/孔的密度接種到鼠尾一型膠原包被的6 孔板中，加入2mL的培養基，轉染前將細胞培養基換成含有1%FBS + 1%CS血清的a-MEM1.7mL〇
[0083] 2)分組設計
[0084] 組1:空白對照
[0085] 組2:使用 siRNAl(Rl)轉染
[0086] 組3:使用 siRNA2(R2)轉染
[0087] 組4:使用 siRNA3(R3)轉染 [0088] 組5:使用陰性對照s iRNA轉染
[0089] 組6:使用陽性對照siRNA轉染(特異性抑制β-Actin的mRNA表達）
[0090] 3)配制轉染混合液:將2.5yL siRNA溶于125yL的Opti-MEM中，輕輕混勻。將2.5yL Lipofectamine?2000溶于125yL的Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫孵育5min。將含有siRNA和 Lipofectamine?2000的溶液輕輕混勾，室溫孵育20min，加入到6孔板中。
[0091] 2 · 3 · 2使用Trizol提取細胞總RNA
[0092] 細胞轉染后24、36、48、72h后取出6孔板，用冷DPBS漂洗3次，每孔加入500yL的 Trizol，室溫靜置5min，吹打，收入1.5mLEP管中，加入200yL氯仿，劇烈振蕩15~30s，室溫靜 置5min，4°C，12000g/min離心15min。吸上清至新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勾10 ~20次，室溫靜置10min，4°C，12000g/min離心10min，棄上清，加入lmL預冷的75%的乙醇， 振蕩，4°C，7500g/min，離心5min。棄上清，靜置揮發，10~30yLDEPC水溶解，分光光度計測量 細胞總RNA濃度和純度，-80 °C儲存備用。
[0093] 2 · 3 · 3qRT_PCR 檢測
[0094] 1)引物的設計合成:在GenBank中查找小鼠 UMK2的cDNA序列（編號NM-005569)。設 計并由廣州瑞真合成引物：
[0095] UMK2-F 5'-ATCATCCACCGGGACCTGAA-3'
[0096] UMK2-R 5'-GTGACAGCCCAAAGTCGGCTA-3'
[0097] GAPDH-F 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'
[0098] GAPDH-R 5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3，
[0099] 2)反轉錄反應：使用PrimeScriptTM RT reagent Kit合成cDNA
[0100] 去除基因組DNA反應：于冰上配置Master Mix，以每管3yL分裝到200mLEP管中，加 入RNA和Rnase Free Water至總體積為10yL，室溫孵育30min。反轉錄反應：于冰上配置 Master Mix，加入i中的反應液10yL，輕柔混合組成20yL的逆轉錄反應體系，立即放入熱循 環儀中進行逆轉錄反應。
[0101] 3)PCR反應:使用SYBR?Premix Ex TaqTM II進行PCR反應。
[0102] PCR反應板中每孔加入SYBR Premix Ex Taq II 10yL、PCR上下游引物各0.8yL、 DNA模板2yL，滅菌雙蒸水6.4yL，組成20yL的反應體系，采用LC480PCR反應儀進行PCR反應。 [0103] 2.3.4統計分析
[0104] 采用統計分析軟件SPSS 22.0對數據進行重復測量設計資料的方差分析。α = 0.05〇
[0105] 2.4 RNA干擾后的LIMK2蛋白的Western-blot檢測
[0106] 2 · 4 · 1使用siRNA轉染ML0-Y4骨細胞樣細胞
[0107] 1)分組設計
[0108] 組1:使用siRNAl(Rl)轉染
[0109] 組 2:使用 siRNA2(R2)轉染 [0110]組 3:使用 siRNA3(R3)轉染
[0111] 組4:使用陰性對照s iRNA轉染
[0112] 組5:空白對照
[0113] 2)轉染過程同上
[0114] 2.4.2提取細胞總蛋白及蛋白濃度檢測
[0115] 1)細胞用預冷的DPBS洗滌3次，吸凈DPBS后置于冰上。
[0116] 2)以即？4:?10^=100:1配置裂解液，6孔板每孔加入3(^1^的裂解液，于冰上裂解 30min，搖床慢搖，收集入EP管中，14000rpm，4°C離心30min，上清保存于-80 °C備用。
[0117] 3)用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度
[0118] 按照說明書制備標準品，每個濃度設置2個復孔;將樣本按照2yL+18yLDPBS稀釋， 每個樣本設置2個復孔。配置BCA工作液，加入BCA工作液混合后，37 °C孵育30min。冷卻至室 溫3~5min，酶標儀562吸光度測定吸光值，分析，計算定量后加入loading buffer(5 X )，離 心混勻，煮沸變性，置于-20 °C保存。
[0119] 2.4.3SDS-PAGE膠的制備及電泳
[0120] SDS-PAGE膠的制備的具體方法見上。加樣、電泳:將電泳緩沖液倒入電泳槽，拔梳 后沖洗膠孔，取20yL樣品快速上樣。在濃縮膠內電泳電壓為70V，等溴酚藍進入分離膠以后 將電壓提高到120V電泳約90min，至溴酚蘭到達分離膠的底部結束電泳。
[0121] 2.4.4 轉膜
[0122] 把海綿、濾紙與PVDF膜預先浸泡在轉移緩沖液中約20min。電泳結束后，小心揭膠， 去掉積層膠部分，右下方切角標記，把膠放入轉移緩沖液中平衡20min。從負極到正極按海 綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿的順序將電轉移裝置安裝，固定好后放置于轉移槽內， PVDF膜朝向正極，加入轉移緩沖液及冰盒，以恒流200mA轉移lh。
[0123] 2.4.5抗體孵育
[0124] 一抗:UMK2用抗體稀釋液1: 2000稀釋，GAPDH用抗體稀釋液1:1500稀釋;二抗：用 含5%脫脂奶粉的TBST以1:1000稀釋。轉膜結束后，用TBST將PVDF膜洗5minX3次。用含5% 脫脂奶粉的TBST封閉60min，剪膜，加入稀釋的一抗，于4°C搖床孵育161UTBST洗膜3次， 5min/次。加入稀釋的二抗(HRP標記），室溫搖床孵育lh。TBST洗膜5min X 3次。
[0125] 2.4.6顯影、曝光
[0126] 將顯影液滴加到PVDF膜表面，避光孵育3~5min，在ImageQuant Las4000成像系統 中連續曝光，拍照。
[0127] 2.4.7結果分析
[0128] Western Blotting結束后，使用Image J分析各蛋白條帶的灰度值。采用統計分析 軟件SPSS 22.0對數據進行重復測量設計資料的方差分析。α = 0.05。
[0129] 2.5 CCK8法檢測siRNA轉染后ML0-Y4骨細胞樣細胞的增殖活性
[0130] 2 · 5 · 1分組:s iRNA2 (R2)轉染組，未轉染組。
[0131 ] 2.5.2細胞接種及檢測:細胞計數，制備成密度為4 X 104/mL細胞懸液，接種到96孔 板中，每孔加入1〇〇μL，同一個樣本5個復孔。37°C培養箱中培養2~4h貼壁，于接種后12、24、 48、72h加入10yLCCK8檢測試劑，培養2h，測定450nm吸光度。
[0132] 2.5.3統計及分析
[0133] 使用酶標儀得到各處理組0D值。采用SPSS20.0統計軟件，多組間比較采用單因素 方差分析。檢驗水準α = 0.05。
[0134] 2.6 RNA干擾抑制LIMK2后對ML0-Y4骨細胞樣細胞在流體剪切力作用下細胞骨架 改建的影響
[0135] 2.6.1ML0-Y4骨細胞樣細胞的轉染
[0136] 1)分組設計
[0137] 組 l(FSS( + )，UMK2siRNA 組）：siRNA2(R2)轉染，加載 lh
[0138] 組2(FSS( + )，NC siRNA組）：陰性對照RNA轉染，加載lh
[0139] 組 3(FSS(-)，UMK2siRNA 組）：siRNA2(R2)轉染，不加載
[0140] 組4(FSS(_)，UMK2siRNA組）：陰性對照RNA轉染，不加載
[0141] 2)鼠尾I型膠原包被載玻片及細胞接種
[0142] 按3800ML/每板將鼠尾I型膠原均勻包被無菌載玻片，室溫孵育lh，DPBS漂洗三 次，將轉染24h后的細胞消化，制成細胞懸液，以每張玻片36 X 104的密度接種，置于培養箱 中培養。
[0143] 2.6.2細胞加載
[0144] 將接種有細胞的玻片放入平行平板，打開蠕動栗，產生大小為12dyneS/Cm2的流體 剪切力加載ML0-Y4骨細胞樣細胞lh以含1%FBS+1%CS的α-ΜΕΜ作為灌流液。除不進行流體 剪切力加載外，非加載組細胞與加載組處理相同。
[0145] 2.6.3固定、染色、觀察
[0146] 每組細胞加載完成后立刻用預溫的PBS沖洗2遍。室溫下，用溶解于PBS的甲醇固定 lOmin，以PBS洗2次。用0.1 %Tritonx-100透化處理5min，PBS洗2次。稀釋Phalloidin，每5yL 的Phalloidin加入200yLPBS，再加入1%BSA，每張玻片加入15yL的Phalloidin工作液，室溫 染色20min，PBS洗2次。加入DAPI工作液，染色10min，PBS洗3次。倒置熒光顯微鏡觀察，拍照。
[0147] 2.6.4統計分析
[0148] 對各組熒光圖片進行肌動蛋白細胞骨架熒光強度定量，每個細胞的平均熒光強度 (平均熒光強度=熒光強度/細胞面積），采用統計軟件SPSS 22.0進行單因素方差分析。α = 0.05〇
[0149] 2.7 PGE2檢測
[0150] 2.7.1實驗分組
[0151] 組 l:siRNA2(R2)轉染，加載 lh
[0152] 組2:陰性對照RNA轉染，加載lh
[0153] 組 3:siRNA2(R2)轉染，不加載
[0154] 組4:陰性對照RNA轉染，不加載
[0155] 2.7.2樣本收集
[0156] 轉染、接種、加載過程同上。在加載后511^11、101^11、20、40、601^11分別收集50(^1^培 養基，lOOOrpm離心2min去除雜質后置于-80°C冰箱備用。在加載完畢后，將玻片上的細胞消 化，計數。
[0157] 2.7.3加樣及檢測
[0158] 1 performing the Assay
[0159] 按照下表在ELISA反板中加樣(yL):
[0161] 2)Development of the Plate
[0162] 吸干孔中的液體，Wash Buffer洗5次，每孔加入200yL的Ellman's Reagent，TA孔 加入5yL的Tracer，避光，室溫下搖床孵育90min。
[0163] 3)Reading the Plate:將孔板放入酶標儀中，410nm吸光度檢測。
[0164] 2.7.4統計分析
[0165] 使用酶標儀得到各處理組0D值。采用統計分析軟件SPSS 22.0對數據進行單因素 方差分析。α = 0.05。
[0166] 2.8 ML0-Y4骨細胞樣細胞力學敏感性基因 C0X-2的mRNA檢測
[0167] 2.8.1實驗分組
[0168] 組 l(FSS( + )，siRNA組）：siRNA2(R2)轉染，加載 lh
[0169] 組2(FSS( + )，NC siRNA組）：陰性對照RNA轉染，加載lh
[0170] 組 3(FSS(-)，siRNA組）：siRNA2(R2)轉染，不加載
[0171] 組4(FSS(_)，NC siRNA組）：陰性對照RNA轉染，不加載
[0172] 2.8.2樣本收集
[0173]轉染、接種、加載過程同上。在加載完成后，提取細胞總RNA，-80 °C儲存備用。
[0174] 2.8.3 qRT-PCR檢測
[0175] 1)引物的設計合成:在GenBank中查找小鼠的C0X-2的cDNA序列。設計并由廣州瑞 真合成引物：
[0176] C0X-2-F 5'-CTGGAACATGGACTCACTCAGTTTG-3'
[0177] C0X-2-R 5'-AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3'
[0178] GAPDH-F 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'
[0179] GAPDH-R 5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3，
[0180] 2)使用PrimeScriptTM RT reagent Kit合成cDNA，使用SYBR?Premix Ex TaqTM II進行PCR反應
[0181] 2.8.4統計分析
[0182] 熒光定量PCR反應結束后，由計算機自動分析擴增曲線并計算結果。采用統計分析 軟件SPSS 22.0對實驗數據進行雙因素方差分析，α = 〇. 05。
[0183] 3.試驗結果
[0184] 3.1脂質體介導的s iRNA轉染ML0-Y4骨樣細胞系的轉染效率
[0185] 采用FAM標記的陰性siRNA轉染ML0-Y4骨樣細胞系后，熒光顯微鏡下可見較多細胞 內熒光(如圖1所示），只加入Lip 〇feCtamineTM2000的對照組無熒光，各組中陽性細胞數、總 細胞數和死細胞數見表1。組1、7、8的轉染效率均達到了 90 %以上，其中組1的 LipofectamineTM2000脂質體用量最小，故選用組1的siRNA、脂質體用量用于后續實驗，即 24孔板，每孔siRNA用量為0.5yL，Lipof ectamineTM2000脂質體用量為0.5yL。鏡下可見較多 細胞內熒光，熒光在胞內呈點狀散在分布，可見細胞胞體形態呈多角形（X 100)。
[0186] 表1不同濃度siRNA/脂質體轉染ML0-Y4骨樣細胞系的轉染效率
[0187]
[0189] 3.2 siRNA轉染對ML0-Y4骨樣細胞系UMK2 mRNA表達的影響
[0190] UMK2特異性siRNA序列R1、R2、R3轉染ML0-Y4骨樣細胞系24h、48h后，qRT-PCR檢測 UMK2 mRNA表達水平。方差分析結果顯示，三條siRNA序列轉染處理和檢測時間點時間不存 在交互作用(P>〇.05)。隨即進行三條siRNA序列與對照組的兩兩比較，發現組間差異有統 計學意義(Ρ<〇.〇1)，其中siRNA序列R2對UMK2 mRNA的抑制效果最好。具體結果如圖2所 不。
[0191] 3.3 siRNA轉染對ML0-Y4骨樣細胞系UMK2蛋白表達的影響
[0192] LIMK2 特異性 siRNA 序列 R1、R2、R3 轉染 ML0-Y4 骨樣細胞系 2處、3611、4811、7211后， Western Blotting檢測UMK2蛋白表達水平。方差分析結果顯示，三條siRNA序列轉染處理 和檢測時間點時間存在交互作用(P<〇. 01)。進一步分析發現，siRNA序列R2在轉染36h之后 對UMK2蛋白的抑制已達到60%以上，可被認為已達到siRNA的抑制效果，且在三條序列中 對UMK2 mRNA的抑制效果最好，故選擇序列2進行后續實驗，FSS加載時間應在轉染后至少 36h后進行。具體結果如圖3所示。
[0193] 3.4 siRNA轉染對ML0-Y4骨樣細胞系的增殖活性的影響
[0194] 采用CCK-8檢測UMK2特異性siRNA序列2轉染ML0-Y4骨樣細胞系對細胞增殖活性 的影響，發現與未進行轉染的對照組相比較，siRNA轉染，抑制UMK2蛋白的表達不會影響細 胞的增殖活性，具體結果如圖4所示。
[0195] 3.5 RNA干擾抑制LIMK2后對ML0-Y4骨樣細胞系在流體剪切力作用下細胞骨架改 建的影響
[0196] 如圖5、圖6所示，結果表明，RNA干擾抑制UMK2蛋白表達后，可以抑制ML0-Y4骨樣 細胞系在流體剪切力作用下的細胞骨架改建。倒置熒光顯微鏡下，可見F-Actin呈綠色熒 光，在FSS(-)組（即FSS非加載組），無論是否轉染，F-Actin綠色熒光較弱，呈不連續的彌散 狀，在FSS (+)組（即FSS加載組），采用NC s iRNA(也即陰性對照RNA)轉染的細胞，在流體剪切 力作用下，細胞骨架發生改建，可見F-Actin呈細絲狀排列，而采用UMK2特異性siRNA2轉染 的細胞，在流體剪切力的作用下F-Actin未發生改建，呈與FSS(-)相似的彌散狀。Image J對 肌動蛋白細胞骨架熒光強度進行分析，顯示RNA干擾抑制UMK2蛋白表達后，細胞骨架熒光 強度是非抑制組的1/2,二者的差異有統計學意義(P<0.01)。
[0197] 3.6 RNA干擾抑制ML0-Y4骨樣細胞系在流體剪切力作用下細胞骨架改建后，對 ML0-Y4骨樣細胞系前列腺素2釋放的影響
[0198] 結果表明，流體剪切力可以促進ML0-Y4骨樣細胞系的PGE2釋放，與陰性對照siRNA 轉染的骨細胞相比較，RNA干擾抑制ML0-Y4骨樣細胞系在流體剪切力作用下細胞骨架改建 后，PGE2釋放增加，且隨著時間的推移，PGE2持續釋放。非加載組因 PGE2濃度太低，無法檢 測，數據未呈現于本文。具體結果如圖7所示。
[0199] 3.7 RNA干擾抑制ML0-Y4骨樣細胞系在流體剪切力作用下細胞骨架改建后，對 ML0-Y4骨樣細胞系力學敏感性相關基因 C0X-2的mRNA表達的影響
[0200] 圖8顯示:FSS( + )組的COX-2 mRNA相對表達水平較FSS(-)組高，在FSS( + )組，siRNA 組C0X-2的表達水平較NC siRNA組高，差異有統計學意義(P<0.01)。
[0201]最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保 護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當 理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質 和范圍。
【主權項】
1. 骨細胞LIMK2基因及其表達產物在制備用于治療與骨改建進程相關的疾病的藥物中 的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述與骨改建進程相關的疾病選自骨折、 骨質疏松、骨缺損疾病、骨發育不全畸形。3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述藥物能夠加速骨植入物的骨整合、加 速口腔正畸治療。4. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述藥物包括:骨細胞LIMK2基因的抑制基 因激活劑、抑制骨細胞LIMK2基因表達的蛋白激活劑、抑制骨細胞LIMK2基因表達的siRNA、 骨細胞UMK2基因轉錄后基因表達調控的microRNA激活劑、促進骨細胞UMK2基因表達的蛋 白降解分子、促進骨細胞LIMK2基因表達的因子及蛋白抑制劑。5. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述藥物包括藥學上可接受的載體。6. 抑制LIMK2基因的siRNA，其特征在于：所述siRNA選自siRNAl、siRNA2或siRNA3,其 中： siRNAl的序列為： 正義鏈:5 ' -ACGCACCUUACGCAAGAGU-3 ' 反義鏈:5 ' -ACUCUUGCGUAAGGUGCGUdTdT-3 ' siRNA2的序列為： 正義鏈:5 ' -UCACAAAGCCACAGGCAAA-3 ' 反義鏈:5 ' -UUUGCCUGUGGCUUUGUGAdTdT-3， siRNA3的序列為： 正義鏈：5 ' -GAUAAAAGAGCCUGGAUUA-3 ' 反義鏈:5 ' -UAAUCCAGGCUCUUUUAUCdTdT-3 '。7. 根據權利要求6所述的抑制UMK2基因的siRNA，其特征在于:所述siRNA為siRNA2。8. 根據權利要求6或7所述的抑制LIMK2基因的siRNA在制備用于治療與骨改建進程相 關的疾病的藥物中的應用。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述與骨改建進程相關的疾病選自骨折、 骨質疏松、骨缺損疾病、骨發育不全畸形。10. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述藥物能夠加速骨植入物的骨整合、加 速口腔正畸治療。
【文檔編號】A61K48/00GK105833276SQ201610397915
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】付強, 譚淑儀, 宋子珺, 黃春煌, 任林
【申請人】付強