一種從羅漢果總皂苷中制備羅漢果醇新型衍生物的方法

一種從羅漢果總皂苷中制備羅漢果醇新型衍生物的方法
【專利摘要】本發明提供了包含有羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的組合物的合成方法，相比現有的合成羅漢果醇衍生物單體(3)的方法，此合成方法簡單、成本較低，而且還能合成新物質羅漢果醇衍生物單體(4)，同時在此基礎上，本發明還提供了制備羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的方法，此方法通過簡單的柱層析分離技術，可以低成本、高效率和大規模地分離制備羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)，為進一步開發相關的一類新藥打下基礎。
【專利說明】
一種從羅漢果總皂苷中制備羅漢果醇新型衍生物的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及醫藥領域，具體涉及羅漢果醇衍生物的合成方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，世界各國對癌癥和其它疾病(包括心腦血管疾病、糖尿病、精神憂郁、老年 性癡呆癥等)的看法正在發生重大的轉變，越來越多的醫生和研究人員，正在尋找可預防或 延緩這些疾病發生的天然藥物。目前，天然、高效、廣譜、低毒的用于預防及治療癌癥和其它 疾病的臨床研究化合物藥品，很多為天然藥物或來自天然原料的半合成產品，是當前生物 醫藥領域的研發熱點。
[0003] 最新的生物醫學研究表明，許多來自天然植物的單體活性成分藥物或多組分活性 成分藥物經人體胃腸道代謝或經肝臟代謝后所產生的各種代謝衍生物，被吸收入血后，才 成為人體內真正起藥效作用的活性成分，且具有比原形植物活性成分更顯著療效的特性。 比如:大鼠口服放射性標記的地奧心血康膠囊24h后，大鼠糞便中出現了2-3個新的衍生物， 同時也存在少量未改變的原型藥物，進一步的研究表明，這些新出現的衍生物是留體皂甙 糖基選擇性水解的一系列去糖基的次生留體皂苷，說明地奧心血康在腸內菌代謝后真正被 吸收入血的是代謝衍生物；人參皂苷是人參(三七）的主要活性成分，目前從人參(三七）中 已經分離和鑒定了 40多種單體成分（如:1^、肋1、肋2、肋3、此、1?(1、1^、1^1、1^2、1^...等），它 們經過人體代謝后會產生一些極微量的新型代謝寡單體1^3、此2、(：-1(、 &?1^和&??1'等。大量 的研究表明，未經人體代謝的原形人參皂苷對癌細胞沒有抑制作用，而這些新產生的極微 量的新型代謝寡單體(1^3、此2、1^1、(：-1(、 &??1'和&??0)以及轉化人參皂苷1^1和1^2等對癌 細胞卻有殺傷作用，其中尤其以原人參二醇aPH)對癌細胞的抑制作用最為顯著。
[0004] 由于上述原因，天然抗腫瘤藥物的研發取得了越來越多的關注。無論是抑制或殺 傷腫瘤細胞、調整機體免疫功能、改善癥狀與特征、減輕放化療毒副作用，還是腫瘤的病后 調理，天然抗癌藥物具有重要作用。由此，天然植物新療法將成為繼手術、放療、化療、生物 療法的第五大治療方法。
[0005] 羅漢果是一種名貴藥材，屬于萌蘆科多年生藤本植物，性涼味甘。羅漢果提取物中 含非糖甜味的皂苷成分，又稱羅漢果總皂苷，根據其中皂苷元連接糖基的數目以及連接位 置的不同已經在羅漢果總皂苷中分離鑒定出羅漢果二糖苷、三糖苷、四糖苷、五糖苷、六糖 苷等多種皂苷單體，分別命名為羅漢果甜苷II、m、IV、V、VI(MogrosideII、III、IV、V、VI) 等，其中羅漢果甜苷V-M〇gr〇SideV( 1A)(如圖1所示）的甜度是蔗糖的256-344倍，羅漢果甜 苷IV-M〇gr〇SideIV(lB)(如圖1所示）的甜度為蔗糖的126倍，其熱量為零，具有清熱潤肺鎮 咳、潤腸通便之功效，對肥胖、便秘、糖尿病等具有防治作用。
[0006] 羅漢果皂苷Mogrosides是兩條由四個以下葡萄糖單位組成的葡萄糖苷側鏈以β-糖苷鍵與皂苷元羅漢果醇Mogro 1 (2)的C-3、C-24相連，在側鏈葡萄糖之間的連接鍵為β-l，6 和β_1，2糖苷鍵。
[0007] 許多研究表明，羅漢果皂苷能提高葡萄糖和脂肪的利用，增加胰島素的敏感性，但 羅漢果降血糖作用的有效成分和作用機制并不明確。中科院上海藥物研究所胡立宏課題組 和沈旭課題組對羅漢果的降血糖作用進行了研究，首先在HepG2細胞中，對羅漢果中含量最 高的羅漢果甜苷V(1A)進行測試，發現它對AMPK沒有活性;而羅漢果醇M 〇gr〇l(2)(如圖2所 示）及其衍生物3α-羥基-25-脫羥基-24-酮-羅漢果醇（Sa-hydroxy-SS-dehydroxyjd-oxomogrolKS) 卻能夠激活 AMPK(Chen X.B.，et al;Bioorganic&Medicinal Chemistry 2011,19:5776)。雖然文獻報道了羅漢果醇衍生物單體(3)(Chen X.B.，et al;Bioorganic& Medicinal Chemistry 2011,19:5776)的制備，但產率低、分離純化困難，難以工業化生產， 另外該方法無法同時制備羅漢果醇衍生物單體(4);目前也沒有任何專利和文獻公開報道 通過羅漢果提取物同時合成羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的方法。

【發明內容】

[0008] 本發明要解決的技術問題是提供了包含有羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍 生物單體(4)的組合物的合成方法，在此基礎上，本發明還分別提供了羅漢果醇衍生物單體 (3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的制備方法。
[0009] 本發明第一方面提供了一種組合物，至少包括如下結構
[0010]
的羅漢果醇衍生物單體(3)和如下結構
[0011]
的羅漢果醇衍生物單體(4)。
[0012] 本發明第二方面提供了上述組合物的合成方法，包括:將含羅漢果總皂苷的羅漢 果提取物溶于呈酸性的醇的水溶液中進行加熱反應即得。
[0013] 在一優選例中，所述呈酸性的醇的水溶液的制備方法為：用酸性物質將醇的水溶 液調節為酸性。
[0014] 在一優選例中，所述醇為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丙三 醇和聚乙二醇中的至少一種。
[0015] 在一優選例中，所述醇的水溶液中醇與水的體積比為1:10~10:1。
[0016] 在一優選例中，所述醇的水溶液中醇與水的體積比為1:3~3:1。
[0017] 在一優選例中，所述醇的水溶液中醇與水的體積比為1:1。
[0018] 在一優選例中，所述酸性物質為無機酸或有機酸。
[0019] 在一優選例中，所述無機酸為鹽酸、硫酸和磷酸中的至少一種。
[0020] 在一優選例中，所述有機酸為甲酸、乙酸、鹵代乙酸、乙二酸、丙二酸和檸檬酸中的 至少一種。
[0021] 在一優選例中，所述呈酸性體現為PH值為2.5~3.5。
[0022] 在一優選例中，所述呈酸性體現為PH值為2.8~3.0。
[0023] 在一優選例中，當所述含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物中羅漢果總皂苷的重量百 分比為70%以上時，所述含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物與呈酸性的醇的水溶液的質量體 積比為1:10~1:3。
[0024] 在一優選例中，所述含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物與呈酸性的醇的水溶液的質 量體積比為1:5。
[0025] 在一優選例中，所述加熱反應的條件是:在100~140°C下加熱1~3小時。
[0026]在一優選例中，所述加熱反應的條件是:在120°C下加熱2小時。
[0027] 在一優選例中，所述加熱反應后還包括對加熱反應得到的反應液用堿性物質進行 中和，加熱將醇蒸發，得到含組合物的濃縮液。
[0028] 在一優選例中，用堿性物質進行中和是中和至PH到6.5~7.5。
[0029] 在一優選例中，用堿性物質進行中和是中和至PH到7.0。
[0030] 在一優選例中，所述堿性物質為無機堿和/或鹽。
[0031] 在一優選例中，所述無機堿和/或鹽為Na0H、K0H和Na2C〇3中的至少一種。
[0032] 在一優選例中，上述組合物的合成方法，還包括對含組合物的濃縮液洗滌后得到 咖啡色浸膏的步驟。
[0033] 在一優選例中，所述對含組合物的濃縮液洗滌后得到咖啡色浸膏的步驟:在含組 合物的濃縮液中加入蒸餾水冷卻靜置，棄去上面水層，得到含組合物的咖啡色浸膏。
[0034] 在一優選例中，所述濃縮液與蒸餾水的體積比為1:5~1: 3。
[0035] 在一優選例中，上述的組合物的合成方法，還包括對含組合物的咖啡色浸膏進行 萃取和濃縮，得到含組合物的淺咖啡色固體。
[0036]在一優選例中，所述萃取所采用的萃取溶劑為乙酸乙酯。
[0037] 在一優選例中，每次萃取的固液比1:6~1: 3。
[0038] 在一優選例中，所述萃取的次數為2~5次，將每次萃取液合并。
[0039] 在一優選例中，所述萃取的次數為3次。
[0040] 在一優選例中，第一次萃取所用的萃取溶劑的體積是第二次萃取或第三次萃取所 用的萃取溶劑的體積的2倍。
[0041] 在一優選例中，所述濃縮是：100-120°C下用旋轉蒸發儀濃縮，把萃取溶劑完全蒸 干。
[0042]本發明第三方面提供了一種具有如下結構
[0043]
的羅漢果醇衍生物單體(3)的制備方法，包 括將含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物溶于呈酸性的醇的水溶液中進行加熱反應，然后分離 純化即得。
[0044] 在一優選例中，包括對權利要求7的含組合物的淺咖啡色固體進行分離和純化的 步驟。
[0045] 在一優選例中，所述分離為層析分離。
[0046] 在一優選例中，所述層析分離為硅膠柱層析分離。
[0047]在一優選例中，所述硅膠柱層析分離采用的洗脫液為乙腈和水；
[0048] 在一優選例中，所述乙腈和水的體積比為95:5~20:1;
[0049] 在一優選例中，對含組合物的淺咖啡色固體進行分離后還要進一步濃縮；
[0050] 在一優選例中，濃縮后進行層析純化；
[0051 ]在一優選例中，所述層析純化為硅膠柱層析純化；
[0052]在一優選例中，所述硅膠柱層析純化采用的洗脫液為氯仿和乙醇。
[0053]在一優選例中，所述氯仿和乙醇的體積比為16:1~8:1。
[0054]在一優選例中，所述氯仿和乙醇的體積比為12:1。
[0055] 本發明第四方面提供了一種具有如下結構
[0056]
的羅漢果醇衍生物單體(4)的制備方法， 包括將含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物溶于呈酸性的醇/水溶液中進行加熱反應，然后分 離純化即得。
[0057]在一優選例中，包括對上述含組合物的淺咖啡色固體進行分離和純化的步驟。 [0058]在一優選例中，所述分離為層析分離。
[0059] 在一優選例中，所述層析分離為硅膠柱層析分離。
[0060] 在一優選例中，所述硅膠柱層析分離采用的洗脫液為乙腈和水。
[0061 ] 在一優選例中，所述乙腈和水的體積比為95:5~20:1。
[0062] 在一優選例中，對含組合物的淺咖啡色固體進行分離后還要進一步濃縮。
[0063] 在一優選例中，濃縮后進行層析純化。
[0064] 在一優選例中，所述層析純化為硅膠柱層析純化。
[0065]在一優選例中，所述硅膠柱層析純化采用的洗脫液為石油醚和乙酸乙酯。
[0066] 在一優選例中，所述石油醚和乙酸乙酯的體積比為3:2~4:1。
[0067]在一優選例中，所述石油醚和乙酸乙酯的體積比為3:1。
[0068] 本發明使用的術語具有以下定義，除非另有描述：
[0069] 本文所用的術語"羅漢果醇衍生物單體(3)"意指3α_羥基-25-脫羥基-24-酮-羅漢 果醇（3<1-]17(11'(?7-25-〇6117(11'(?7-24-(?〇1]1(^1'〇1) ;本文所用的術語"新型羅漢果醇衍生物 單體(4)"意指3<1-羥基-22、24-二稀-24、25-脫羥基-羅漢果醇（3€[-]17(11'(?7-22、24-(1丨6116-24、25_dehydroxy-mogrol)(4)〇
[0070] 本發明提供了包含有羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的組合 物的合成方法，相比現有的合成羅漢果醇衍生物單體(3)的方法，此合成方法簡單、成本較 低，而且還能合成新物質羅漢果醇衍生物單體(4)，同時在此基礎上，本發明還提供了制備 羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的方法，此方法通過簡單的柱層析分離 技術，可以低成本、高效率和大規模地分離制備羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物 單體(4)，為進一步開發相關的一類新藥打下基礎。
【附圖說明】
[0071 ]圖1為羅漢果甜苷V( ΙΑ)、VI (1B)的分子結構示意圖。
[0072]圖2為羅漢果醇M〇gr〇l(2)的分子結構示意圖。
[0073] 圖3為羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)形成的組合物的合成方 法示意圖。
【具體實施方式】
[0074] 羅漢果總皂苷在酸性條件下通過糖降解形成中間體羅漢果醇(2)，羅漢果醇(2)是 一個相對不穩定的中間體化合物，在本發明中不直接進行分離，它在酸性條件下可以通過 側鏈上的羥基脫水形成衍生物(3)和(4)(如圖3所示），和其它多數萌蘆科植物中直接提取 分離的高氧化萌蘆烷類四環三萜化合物不同，羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物 單體(4)均是低氧化的萌蘆烷類四環三萜化合物，其特點是C-3和C-11上連接的是-OH，而不 是=〇,氧化程度大大減低，特別是化合物(4)的側鏈含有一個共輒雙鍵，氧化程度比化合物 (3)更低，抗氧化性更強。
[0075] 具體來說，本發明首先提供了一種組合物，至少包括如下結構
[0076]
的羅漢果醇衍生物單體(3)
[0077] 和如下結構
[0078]
的羅漢果醇衍生物單體(4)。
[0079] 本發明還提供了上述組合物的合成方法，包括:將含羅漢果總皂苷的羅漢果提取 物溶于呈酸性的醇的水溶液中進行加熱反應即得。
[0080] 所述的醇為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇；乙二醇、丙二醇、丙三醇；聚乙二醇 中的至少一種。
[0081 ]所述呈酸性的醇的水溶液的制備方法為：用酸性物質將醇的水溶液調節為酸性， 優選的，所述醇的水溶液中醇與水的體積比為1:1 〇~1 〇: 1;優選為1:3~3:1 ;，進一步優選 為 1:1〇
[0082]優選的，所述酸性物質為無機酸或有機酸;進一步優選的，所述無機酸為鹽酸、硫 酸和磷酸中的至少一種;所述有機酸為甲酸、乙酸、鹵代乙酸、乙二酸、丙二酸和檸檬酸中的 至少一種。
[0083] 優選的，所述呈酸性體現為PH值為2.5~3.5;進一步優選的，所述呈酸性體現為PH 值為2.8~3.0。酸性太強會導致副反應太多，酸性太弱反應進行的不徹底，因此其PH必須控 制在上述范圍內。
[0084] 優選的，所述含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物中羅漢果總皂苷的重量百分比是 70%以上時，在此基礎上，所述含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物與呈酸性的醇的水溶液的 質量體積比為1:10~1:3;進一步優選的，所述含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物與呈酸性的 醇的水溶液的質量體積比為1:5。
[0085] 優選的，所述加熱反應的條件是:在100~140°C下加熱1~3小時;進一步優選的， 所述加熱反應的條件是:在120°C下加熱2小時。加熱反應如果溫度較低，反應慢且進行的不 完全。
[0086] 所述加熱反應后還包括對加熱反應得到的酸性反應液用堿性物質進行中和，加熱 將醇蒸發，得到含組合物的濃縮液;中和是為了更有利于后面的分離和純化。
[0087]優選的，用堿性物質進行中和是中和至PH到6.5~7.5;進一步優選的，用堿性物質 進行中和是中和至PH到7.0。
[0088] 優選的，所述堿性物質為無機堿和/或鹽;進一步優選的，所述無機堿和/或鹽為 Na0H、K0H和Na2C03中的至少一種。
[0089] 優選的，所述得到含組合物的濃縮液后，還包括對含組合物的濃縮液洗滌后得到 咖啡色浸膏的步驟。
[0090] 所述對含組合物的濃縮液洗滌后得到咖啡色浸膏的步驟為:在含組合物的濃縮液 中加入蒸餾水冷卻靜置，棄去上面水層，得到含組合物的咖啡色浸膏。
[0091 ]優選的，所述濃縮液與蒸餾水的體積比為1:5~1: 3。
[0092]所述得到含組合物的咖啡色浸膏后，還包括對含組合物的咖啡色浸膏進行萃取和 濃縮，得到含組合物的淺咖啡色固體。
[0093]優選的，所述萃取是采用的萃取溶劑為乙酸乙酯。
[0094] 優選的，每次萃取的固液比1:6~1:3。
[0095] 優選的，所述萃取的次數為2~5,將每次萃取液合并;進一步優選的，所述萃取的 次數為3次，第一次萃取所用的萃取溶劑的體積是第二次萃取或第三次萃取所用的萃取溶 劑的體積的2倍。
[0096] 優選的，所述濃縮是在100~120°C下用旋轉蒸發儀濃縮，把萃取的溶劑完全蒸干。 [0097]本發明還提供了一種具有如下結構
[0098]
的羅漢果醇衍生物單體(3)的制備方法，包 括將含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物溶于呈酸性的醇/水溶液中進行加熱反應，然后分離 純化即得。
[0099] 優選的，包括對上述含組合物的淺咖啡色固體進行分離和純化的步驟。
[0100] 進一步優選的，所述分離為層析分離；進一步優選的，所述分離為硅膠柱層析分 離;進一步優選的，所述硅膠柱層析分離采用的洗脫液為乙腈和水;進一步優選的，所述乙 腈和水的體積比為95:5~20:1;進一步優選的，對含組合物的淺咖啡色固體進行分離后還 要進一步濃縮;進一步優選的，濃縮后進行層析純化；
[0101 ]優選的，所述層析純化為硅膠柱層析純化;進一步優選的，所述硅膠柱層析純化采 用的洗脫液為氯仿和乙醇;進一步優選的，所述氯仿和乙醇的體積比為16:1~8:1;進一步 優選的，所述氯仿和乙醇的體積比為12:1。
[0102] 本發明還提供了一種具有如下結構
[0103]
的羅漢果醇衍生物單體(4)的制備方法， 包括將含羅漢果總皂苷的羅漢果提取物溶于呈酸性的醇/水溶液中進行加熱反應，然后分 離純化即得。
[0104] 優選的，包括對上述含組合物的淺咖啡色固體進行分離和純化的步驟。
[0105] 進一步優選的，所述分離為層析分離；
[0106] 進一步優選的，所述分離為硅膠柱層析分離;進一步優選的，所述硅膠柱層析分離 采用的洗脫液為乙腈和水;進一步優選的，所述乙腈和水的體積比為95:5~20:1;進一步優 選的，對含組合物的淺咖啡色固體進行分離后還要進一步濃縮;進一步優選的，濃縮后進行 層析純化；
[0107] 優選的，所述層析純化為硅膠柱層析純化；，所述硅膠柱層析純化采用的洗脫液為 石油醚和乙酸乙酯；
[0108] 進一步優選的，所述石油醚和乙酸乙酯的體積比為3:2~4:1;進一步優選的，所述 石油醚和乙酸乙酯的體積比為3:1。
[0109] 除非特殊說明，本發明所用術語具有本發明所屬領域中的一般含義。
[0110] 下面參考具體實施例，對本發明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明 性的，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的 文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者， 均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0111] 實施例1:從羅漢果總皂苷98%的提取物制備羅漢果醇衍生物單體(3)和(4)
[0112] 將羅漢果提取物50g(羅漢果總皂苷98%，含55%羅漢果甙V，購買于桂林萊茵生物 科技股份有限公司）加入250mL的乙醇的水溶液（乙醇和水的體積比為1:1)(預先用鹽酸調 節至PH值為3.0)，在反應釜中攪拌溶解，然后升溫至120°C下加熱2小時，冷卻至室溫25°C 后，反應液用1M的NaOH堿液中和至PH值為7，在90-95°C下將乙醇盡量蒸出，剩下的濃縮液加 入200mL蒸餾水，充分攪拌后冷卻、靜置，將上面的水層分離棄去，得到咖啡色浸膏；分別用 100mL、50mL、50mL乙酸乙酯萃取咖啡色浸膏3次，合并3次萃取液后，在100-120°C下用旋轉 蒸發儀濃縮，把乙酸乙酯完全蒸干，即得到含羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單 體(4)的淺咖啡色固體18.2g;用乙醇將淺咖啡色固體載入硅膠柱，用乙腈:水(體積比20:1) 梯度洗脫，按先后順序收集不同的流出液，濃縮后得到A(6.8g)、B(5.6g)兩組分;先收集得 到的A(6.8g)組分再用硅膠柱分離(氯仿：乙醇/60: 5洗脫），得到羅漢果醇衍生物單體(3) llgCHPLOgg^hESIMSm/z 503(458+45)[M+H⑶0-] -(calcd for C3iH5i〇5);13C-匪R (600MHz,Me0D)5ppm:29.1(C-l),31.7(C-2),79.4(C-3),42.8(C-4),144.1(C-5),120.7(C-6),25.2(C-7),44.8(C-8),41.1(C-9),35.4(C-10),77.7(C-11),30.6(C-12),48.3(C-13), 49.6(C-14),34.9(C-15),27.5(C-16),50.7(C-17),17.2(C-18),26.6(C-19),41.1(C-20), 19.0(C-21),37.8(C-22),40.3(C-23),218.2(C-24),35.4(C-25),18.8(C-26),18.8(C-27)，26 · 4(C-28)，19 · 9(C-29)，19 · 3(C-30);與文獻報道的3a-羥基-25-脫羥基-24-羰基-羅 漢果醇（3a-hydroxy-25-Dehydroxy-24_oxomogrol)碳譜數據比較，二者基本一致(Chen X.B.,et al；Bioorganic&Medicinal Chemistry2011，19:5776)〇
[0113] 后收集得到的B(5.6g)組分再用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯/5:2洗脫），得到羅 漢果醇衍生物單體(4)。3.2 8(冊1^099%)<^51]\^111/2 441[]\1+!1] + (〇31〇(^(^〇3()1149〇2);13(：-NMR(600MHz，MeOD)Spp m: 23 · 5(C-1 )，29· 5(C-2) ,87 ·8(03)，44.2(04)，144.1(05) ,121.8 (C-6),25.5(C-7),40.9(C-8),40.8(C-9),51,3(C-10),71,9(C-11),41,5(C-12),48.2(C-13),52.2(C-14),35.3(C-15),24.9(C-16),54.3(C-17),15.2(C-18),18.6(C-19),40.2(C-20),20.3(C-21),137.4(C-22),128.8(C-23),125.4(C-24),143.3(C-25),19.7(C-26), 25.7(C-27)，21.7(C-28)，21.7(C-29)，18.6(C-30)。
[0114] 實施例2:從羅漢果總皂苷95%的提取物制備羅漢果醇衍生物單體(3)和(4)
[0115] 將羅漢果提取物50g(羅漢果總皂苷95%，含45%羅漢果甙V，從桂林萊茵生物科技 股份有限公司購買）加入250mL的甲醇的水溶液（甲醇和水的體積比為3:2)(預先用硫酸調 節至PH值為2.8)，在反應釜中攪拌溶解，然后升溫至120°C下加熱2小時，冷卻至室溫后，反 應液用1M的KOH堿液中和至PH值為7，在90-95°C下將甲醇盡量蒸出，剩下的濃縮液加入 200mL蒸餾水，充分攪拌后冷卻、靜置，將上面的水層分離棄去，得到咖啡色浸膏；分別用 100mL、50mL、50mL乙酸乙酯萃取咖啡色浸膏3次，合并3次萃取液后，在100-120°C下用旋轉 蒸發儀濃縮，把乙酸乙酯完全蒸干，即得到含羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單 體(4)的淺咖啡色固體15.5g;用甲醇將淺咖啡色固體載入硅膠柱，用乙腈:水（19:1)梯度洗 脫，按先后順序收集不同的流出液，濃縮后得到A(6.0g)、B(5.2g)兩組分;先收集得到的A (6.0g)組分再用硅膠柱分離（氯仿：乙醇/60: 5洗脫），得到羅漢果醇衍生物單體（3)3.9g (HPLC>99%);HPLC、13C-NMR、ES頂S檢測結果和實施例1中的化合物(3)-致。后收集得到的B (5.2g)組分再用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯/3:1洗脫），得到羅漢果醇衍生物單體(4)。 3.0g(HPLC>99%);HPLC、 13C-NMR、ES頂S檢測結果和實施例1中的羅漢果醇衍生物單體(4) 一 致。
[0116] 實施例3:從羅漢果總皂苷90%的提取物制備羅漢果醇衍生物單體(3)和(4)
[0117] 將羅漢果提取物50g(羅漢果總皂苷90%，含40%羅漢果甙V，從桂林萊茵生物科技 股份有限公司購買）加入250mL的正丙醇的水溶液(正丙醇和水的體積比為2:3)(預先用甲 酸調節至PH值為3.2,在反應釜中攪拌溶解，然后升溫至120°C下加熱2小時，冷卻至室溫后， 反應液用1M的NaOH堿液中和至PH值為7，在90-95°C下將正丙醇盡量蒸出，剩下的濃縮液加 入200mL蒸餾水，充分攪拌后冷卻、靜置，將上面的水層分離棄去，得到咖啡色浸膏；分別用 100mL、50mL、50mL乙酸乙酯萃取咖啡色浸膏3次，合并3次萃取液后，在100-120°C下用旋轉 蒸發儀濃縮，把乙酸乙酯完全蒸干，即得到含羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單 體(4)的淺咖啡色固體14.2g;用甲醇/乙醇將淺咖啡色固體載入硅膠柱，用乙腈:水(20:1) 梯度洗脫，按先后順序收集不同的流出液，濃縮后得到A(5.4g)、B(4.3g)兩組分;先收集得 到的A(5.4g)組分再用硅膠柱分離(氯仿：乙醇/60: 5洗脫），得到羅漢果醇衍生物單體(3) 3.58(!^099%);!^(：、13(：-匪1?』3頂3檢測結果和實施例1中的化合物(3)-致。后收集得 到的B(4.3g)組分再用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯/6:4洗脫），得到羅漢果醇衍生物單體 (4)2.8g(HPLC>99%);HPLC、 13C-匪R、ESIMS檢測結果和實施例1中的羅漢果醇衍生物單體 (4) 一致。
[0118] 實施例4:從羅漢果總皂苷80%的提取物制備羅漢果醇衍生物單體(3)和(4)
[0119] 將羅漢果提取物50g(羅漢果總皂苷80%，含20%羅漢果甙V，從桂林萊茵生物科技 股份有限公司購買）加入250mL的乙醇的水溶液（乙醇和水的體積比為1:1)(預先用乙二酸 調節至PH值為2.6)，在反應釜中攪拌溶解，然后升溫至120°C下加熱2小時，冷卻至室溫后， 反應液用1M的Na 2C03堿液中和至PH值為7，在90-95°C下將乙醇盡量蒸出，剩下的濃縮液加 入200mL蒸餾水，充分攪拌后冷卻、靜置，將上面的水層分離棄去，得到咖啡色浸膏；分別用 100mL、50mL、50mL乙酸乙酯萃取咖啡色浸膏3次，合并3次萃取液后，在100-120°C下用旋轉 蒸發儀濃縮，把乙酸乙酯完全蒸干，即得到含羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單 體(4)的淺咖啡色固體8.8g;用甲醇/乙醇將淺咖啡色固體載入硅膠柱，用乙腈:水(95:5)梯 度洗脫，按先后順序收集不同的流出液，濃縮后得到A(3.8g)、B(3.0g)兩組分;先收集得到 的A(3.8g)組分再用硅膠柱分離(氯仿：乙醇/60:5洗脫），得到羅漢果醇衍生物單體(3)2. lg (HPLC>99%);HPLC、13C-NMR、ES頂S檢測結果和實施例1中的化合物(3)-致。后收集得到的B (3.Og)組分再用硅膠柱分離（石油醚：乙酸乙酯/4:1洗脫），得到羅漢果醇衍生物單體(4) 1.88(即1^099%);即^：、 13(：-匪1?43頂3檢測結果和實施例1中的羅漢果醇衍生物單體(4)一 致。
[0120] 實施例5:羅漢果醇衍生物單體(4)抑制細胞增殖實驗
[0121] 實驗樣品：
[0122] 測試藥物:實施例1制備得到的羅漢果醇衍生物單體(4);
[0123] 對照藥物：紫杉醇（SELLECK; Cat. #S1150);人參皂苷單體Rg3(自上海源葉生物科 技有限公司購買，商品貨號為B21059)。
[0124] 實驗步驟：
[0125] 以24種細胞系（包括23種腫瘤細胞系和1種人臍靜脈內皮細胞系）為實驗用細胞 系，取對數生長期細胞(3x 104/mL至2.5x 105/mL)，以每孔100yL接種在96孔板內，每個細胞 系用一個96孔板;然后，除對照藥物紫杉醇以外，以高濃度150μΜ至低濃度2μΜ取7個對數遞 減濃度(每個濃度設兩個復孔），分別加入測試藥物溶液和對照藥物溶液500nL(測試藥物溶 液或對照藥物溶液配制:分別采用測試藥物或對照藥物溶于0.5 %的DMS0溶液）。紫杉醇的 加入濃度為由高濃度ΙμΜ至低濃度0.0014μΜ的7個三倍遞減濃度。經測試/對照藥物溶液作 用72小時后，用CeUTiter-Gl〇?(Pr 〇mega;Cat.#G7573)發光細胞活力檢測法求出各細胞 系中的每種藥物的每個濃度對該系細胞的增殖抑制百分率，并繪制量效關系圖，最后根據 圖中曲線測算IC 5Q和最高抑制百分率(Emax)，如表1和表2所示。
[0126] 表1:羅漢果醇衍生物單體(4)以及對照藥Rg3抑制細胞增殖活性實驗檢測結果。
[0127]
[0129]表2:羅漢果醇衍生物單體(4)以及對照藥紫杉醇、Rg3抑制細胞增殖有效性實驗檢 測結果。
[0130]
[0132]使用SPSS Statistics軟件（提供者：IBM corporation,軟件版本:XL fit 21)提 供統計學分析。
[0133]用假設方差不相等的獨立樣本檢驗（independent-sample τ-test)來檢測藥物組 與對照組平均值的差異是否呈現統計顯著(P〈〇. 05或P〈0.01)。
[0134] 分析結果：
[0135] 1.本發明羅漢果醇衍生物單體(4)在24個細胞系中的平均IC50與對照藥物人參皂 苷單體Rg3在24個細胞系中的平均IC50比較時，差異呈現統計顯著(P〈0.05同時P〈0.01)。
[0136] 2.本發明羅漢果醇衍生物單體(4)在24個細胞系中的平均最高抑制百分率與對照 藥物紫杉醇以及對照藥物人參皂苷單體Rg3在24個細胞系中的平均最高抑制百分率比較 時，差異呈現統計顯著(P〈〇. 05同時P〈0.01)。
[0137] 結論：
[0138] 1.本發明羅漢果醇衍生物單體(4)在所有24種所測細胞系中的抑制細胞增殖活性 均高于同類對照藥物人參皂苷單體Rg3(羅漢果醇衍生物單體(4)的IC5Q小于人參皂苷單體 Rg3 的 IC50)〇
[0139] 2.在所有被測細胞系中，本發明羅漢果醇衍生物單體(4)在人臍血靜脈內皮細胞 系HUVEC中具有最高抑制細胞增殖活性（IC 5Q = 10.72yM)，表現出其強大的抗腫瘤血管生成 潛力；羅漢果醇衍生物單體(3)在結直腸腺癌細胞系HCT-8中抑制細胞增殖活性排在其次 (IC 5〇=14.83yM)〇
[0140] 3.本發明羅漢果醇衍生物單體(4)對所有24種被測細胞系的最高抑制率(有效性） 都非常接近100% ;而對照藥紫杉醇和人參皂苷單體Rg3在已測的24種細胞系中，均只對2種 細胞系有近100%的抑制率。這表明羅漢果醇衍生物單體(4)的有效性明顯高于對照藥物， 且其高抗癌有效性適用于多類癌種。
【主權項】
1. 一種組合物，至少包括如下結構的羅漢果醇衍生物單體(4)。2. 根據權利要求1的組合物的合成方法，其特征在于，包括:將含羅漢果總皂巧的羅漢 果提取物溶于呈酸性的醇的水溶液中進行加熱反應即得。3. 根據權利要求2的組合物的合成方法，其特征在于，所述呈酸性的醇的水溶液的制備 方法為:用酸性物質將醇的水溶液調節為酸性； 任選的，所述醇為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、下醇、乙二醇、丙二醇、丙Ξ醇和聚乙二 醇中的至少一種。 任選的，所述醇的水溶液中醇與水的體積比為1:10~10:1; 任選的，所述醇的水溶液中醇與水的體積比為1:3~3:1; 任選的，所述醇的水溶液中醇與水的體積比為1:1; 任選的，所述酸性物質為無機酸或有機酸； 任選的，所述無機酸為鹽酸、硫酸和憐酸中的至少一種； 任選的，所述有機酸為甲酸、乙酸、面代乙酸、乙二酸、丙二酸和巧樣酸中的至少一種； 任選的，所述呈酸性體現為PH值為2.5~3.5; 任選的，所述呈酸性體現為PH值為2.8~3.0; 任選的，當所述含羅漢果總皂巧的羅漢果提取物中羅漢果總皂巧的重量百分比為70% W上時，所述含羅漢果總皂巧的羅漢果提取物與呈酸性的醇的水溶液的質量體積比為1:10 ~1:3; 任選的，所述含羅漢果總皂巧的羅漢果提取物與呈酸性的醇的水溶液的質量體積比為 1:5。4. 根據權利要求2的組合物的合成方法，其特征在于，所述加熱反應的條件是:在100~ 140 °C下加熱1~3小時； 任選的，所述加熱反應的條件是:在120 °C下加熱2小時。5. 根據權利要求2的組合物的合成方法，其特征在于，所述加熱反應后還包括對加熱反 應得到的反應液用堿性物質進行中和，加熱將醇蒸發，得到含組合物的濃縮液； 任選的，用堿性物質進行中和是中和至P硬化.5~7.5; 任選的，用堿性物質進行中和是中和至PH到7.0。 任選的，所述堿性物質為無機堿和/或鹽； 任選的，所述無機堿和/或鹽為化0H、K0H和化2〇)3中的至少一種。6. 根據權利要求5的組合物的合成方法，其特征在于，還包括對含組合物的濃縮液洗涂 后得到咖啡色浸膏的步驟， 任選的，所述對含組合物的濃縮液洗涂后得到咖啡色浸膏的步驟:在含組合物的濃縮 液中加入蒸饋水冷卻靜置，棄去上面水層，得到含組合物的咖啡色浸膏； 任選的，所述濃縮液與蒸饋水的體積比為1:5~1:3。7. 根據權利要求6的組合物的合成方法，其特征在于，還包括對含組合物的咖啡色浸膏 進行萃取和濃縮，得到含組合物的淺咖啡色固體； 任選的，所述萃取所采用的萃取溶劑為乙酸乙醋； 任選的，每次萃取的固液比1:6~1:3; 任選的，所述萃取的次數為2~5次，將每次萃取液合并； 任選的，所述萃取的次數為3次； 任選的，第一次萃取所用的萃取溶劑的體積是第二次萃取或第Ξ次萃取所用的萃取溶 劑的體積的2倍； 任選的，所述濃縮是：100-120°C下用旋轉蒸發儀濃縮，把萃取溶劑完全蒸干。8. -種具有如下結構的羅漢果醇衍生物單體(3)的制備方法，其特征 在于，包括將含羅漢果總皂巧的羅漢果提取物溶于呈酸性的醇的水溶液中進行加熱反應， 然后分離純化即得； 任選的，包括對權利要求7的含組合物的淺咖啡色固體進行分離和純化的步驟； 任選的，所述分離為層析分離； 任選的，所述層析分離為硅膠柱層析分離； 任選的，所述硅膠柱層析分離采用的洗脫液為乙臘和水； 任選的，所述乙臘和水的體積比為95:5~20:1; 任選的，對含組合物的淺咖啡色固體進行分離后還要進一步濃縮； 任選的，濃縮后進行層析純化； 任選的，所述層析純化為硅膠柱層析純化； 任選的，所述硅膠柱層析純化采用的洗脫液為氯仿和乙醇； 任選的，所述氯仿和乙醇的體積比為16:1~8:1; 任選的，所述氯仿和乙醇的體積比為12:1。9. 一種具有如下結構的羅漢果醇衍生物單體(4)的制備方法，其特征在于，包括將含羅漢果總皂巧的羅漢果 提取物溶于呈酸性的醇的水溶液中進行加熱反應，然后分離純化即得； 任選的，包括對權利要求7的含組合物的淺咖啡色固體進行分離和純化的步驟； 任選的，所述分離為層析分離； 任選的，所述層析分離為硅膠柱層析分離； 任選的，所述硅膠柱層析分離采用的洗脫液為乙臘和水； 任選的，所述乙臘和水的體積比為95:5~20:1; 任選的，對含組合物的淺咖啡色固體進行分離后還要進一步濃縮； 任選的，濃縮后進行層析純化； 任選的，所述層析純化為硅膠柱層析純化； 任選的，所述硅膠柱層析純化采用的洗脫液為石油酸和乙酸乙醋； 任選的，所述石油酸和乙酸乙醋的體積比為3:2~4:1; 任選的，所述石油酸和乙酸乙醋的體積比為3:1。
【文檔編號】C07J9/00GK105832748SQ201610296723
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】余佩華, 鄧躍敏, 鐘牧源
【申請人】深圳以諾生物制藥有限公司