化合物pacma3在制備抗丙肝病毒感染藥物中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種化合物PACMA31在制備抗丙肝病毒感染藥物中的應用。所述抗丙肝病毒感染藥物為PACMA31作為唯一活性成分或包含PACMA31的藥物組合物。本發明通過實驗證實，PACMA31可在RNA水平和蛋白水平抑制丙型肝炎病毒的感染，能夠顯著抑制HCV入侵靶細胞。本發明為PACMA31提供一種制備抗丙型肝炎病毒感染藥物的用途。本發明為尋找抗丙型肝炎病毒藥物提供了新的來源。
【專利說明】
化合物PACMA3在制備抗丙肝病毒感染藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種化合物的用途，具體地說，是化合物PACMA31在制備抗丙肝病毒感 染藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] HCV(Hepatitis C virus，HCV)是單正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬， 主要經血液傳播，是引起病毒性肝炎的重要病原體。HCV感染的慢性率超過80%，HCV慢性感 染可引起肝硬化和肝細胞癌，據報道病史20年以上的慢性丙型肝炎患者，肝硬化的年發生 率為10-15%，而每年約有1-7%的肝硬化患者發展為肝癌。干擾素聯合利巴韋林是治療丙型 肝炎的主要措施，然而該藥物組合僅對50-70%的HCV感染者有效，而且還存在費用高、副作 用大、病人依從性差的缺點。雖然近年來一些藥物公司相繼研發出直接抗病毒藥物 (direct-acting antiviral agents，DAAs)，在一定程度上促進了抗HCV治療，然而這些藥 物定價普遍較高，進一步加重了病人經濟負擔。因而仍需探尋不同的治療藥物和手段。
[0003] PACMA31，全稱propynoic acid carbamoyl methyl amide，又稱為N-(2,4_ Dimethoxypheny1)-N-(l-〇x〇-2-propyn-1-yl)-2-(2-thienyl)glycy1-glycine ethyl ester，化學式C21H22N206S，CAS登陸號1401089-31-3,化學結構式如下：
PACMA31是一種酰胺類化合物，來自南加州大學的研究者發現PACMA31是一種細胞毒 劑，對卵巢癌細胞有非常明顯的毒性。其作用機制是PACMA31能夠選擇性地抑制二硫鍵異構 酶(Protein disulfide isomerase，Ρ?Ι)的活性。PDI在卵巢癌中高度表達，PACMA31 以]^1 為靶點，干預蛋白質的折疊，當癌細胞中出現許多錯誤折疊的蛋白后，就會引發細胞壓力， 最終導致癌細胞死亡。
[0004] 研究人員還發現PDI參與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV)入侵靶細胞的膜融合過程，PDI能夠促進病毒入侵靶細胞。HIV通過膜蛋白gpl20與細胞 膜的CD4結合，膜蛋白gpl20和gp41的構象在Η)Ι的作用下發生改變，進而病毒內吞進入細胞 并通過膜融合釋放病毒基因組。抑制PDI活性的小分子化合物或roi抗體能夠抑制HIV病毒 的入侵和傳播，顯著抑制病毒的感染水平。
[0005] HCV作為有包膜的單正鏈RNA病毒，其入侵肝細胞時也經過受體結合和膜融合，這 一特點與HIV感染細胞時非常相似。并且HCV的包膜蛋白E1E2上也存在二硫鍵，已有報道指 出E2的二硫鍵對于病毒的入侵是非常重要的。因此蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)在HCV入侵細 胞的過程中也可能參與重要作用，然而目前尚未見PDI與HCV相互作用的研究，也沒有關于 PDI抑制劑PACMA31與丙型肝炎病毒相關的文獻報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供PACMA31在制備抗丙型肝炎病毒感染藥物中的應用。本發 明所述PACMA31為酰胺類化合物，化學式C21H22N206S，CAS號為1401089-31-3,化學結構式 如下
[0007] 本發明中PACMA31在制備抗丙型肝炎病毒感染藥物中的應用體現為:所述抗丙肝 病毒感染藥物為PACMA31作為唯一活性成分或包含PACMA31的藥物組合物。
[0008] 上述藥物組合物中包括PACMA31和其他藥學上可接受的輔料。其中，所述藥物制劑 可以是注射制劑或口服制劑，所述注射制劑可以是凍干粉針劑，所述口服制劑可以為散片 劑、膠囊劑或顆粒劑。
[0009] 本發明通過實驗證實，PACMA31可在RNA水平和蛋白水平抑制丙型肝炎病毒的感 染，能夠顯著抑制HCV入侵靶細胞。
[0010] 本發明的優點在于:本發明為PACMA31提供一種制備抗丙型肝炎病毒感染藥物的 用途。本發明為尋找抗丙型肝炎病毒藥物提供了新的來源。
【附圖說明】
[0011] 附圖1為P A C M A 31劑量依賴性抑制丙型肝炎病毒復制的實驗結果圖，其中A為 PACMA31對Huh7細胞的細胞毒作用（CC50=200nM);B為PACMA31抑制HCV復制，半數有效濃度 為70 nM。
[0012]附圖2為PACMA31劑量時間依賴性抑制持續HCV感染的實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0013] 下面將結合具體實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述。
[0014] 實施例1 本實施例為PACMA31抑制丙肝假病毒(HCVpp)感染的試驗。采用假病毒模式有助于更安 全地實驗，降低危害性。
[0015] 試驗藥物、試劑及材料如下： 1. 化合物:PACMA31 2. 細胞系Huh7:人肝癌細胞株(具體參照以下文章 ：Liu Y，Zou Z，Zhu B，et al. CXCL10 Decreases GP73 Expression in Hepatoma Cells at the Early Stage of Hepatitis C Virus (HCV) Infection. Int J Mol Sci. 2013 Dec 13;14(12):24230- 41.) 3. 細胞系293T:人胚腎細胞系（具體參照以下文章 ：Liu Y，Zou Z，Zhu B，et al. CXCL10 Decreases GP73 Expression in Hepatoma Cells at the Early Stage of Hepatitis C Virus (HCV) Infection. Int J Mol Sci. 2013 Dec 13;14(12):24230-41.) 4. 細胞培養液:配制，其含10%胎牛血清、0.03%谷氨酰胺、非必需氨基酸、氨芐青霉素和 鏈霉素 l〇〇U/ml，調pH至7.4。
[0016] 5.細胞消化液:配制，其含0.25%胰蛋白酶，用磷酸鹽緩沖液配制。
[0017] 7. HCVpp:HCV假病毒（具體參照以下文章 ：Wang W, Guan M, Liu Y, et al. Alanine scanning mutagenesis of hepatitis C virus E2 cysteine residues: Insights into E2 biogenesis and antigenicity. Virology. 2014 Jan 5;448:229-37.) 實驗方法包括如下步驟： (一)HCVpp的制備及感染實驗 1.將處于對數生長期的HEK293T細胞傳達接種于24孔板內，置于37 °C 5%C02孵箱內培 養過夜。
[0018] 2.觀察細胞生長狀況，待細胞生長至70%匯合時，進行質粒轉染。將脂質體2ul以 及小鼠白血病病毒gag質粒、報告基因 GFP表達質粒以及HCV包膜蛋白E1E2表達質粒置于 100ul opti-MEM培養液中，混勻，室溫放置20min。
[0019] 3.吸除HEK293T細胞培養上清，加入400ul opti-MEM培養液，再加入脂質體-質粒 混合液，將細胞培養板置于孵箱內培養。
[0020] 4. 6h后吸除細胞培養上清，加入500ul含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于孵箱內 培養48h，收集細胞培養上清，高速離心去除細胞碎片。
[0021] 5.將Huh7細胞接種于96孔板內，貼壁后每孔加入50ul含HCVpp的培養上清，6h后 換新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養72h，于熒光顯微鏡下計數綠色熒光陽性細 胞個數。
[0022](二)PACMA31對HCVpp感染的抑制實驗 取對數生長期的Huh7細胞，接種96孔板，接種密度1 X 104個/孔，培養24h后加入化合物 及HCVpp，化合物按10、25、50、100 nM的濃度稀釋，培養6h后去除化合物及HCVpp混合液，更 換培養基繼續培養，72h后在免疫熒光顯微鏡下讀取各孔綠色熒光陽性細胞數。
[0023]抑制實驗的結果如下表所示： 表1 PACMA31對丙肝假病毒(HCVpp)的抑制活性
實施例2 本實施例為不同劑量PACMA31抑制丙肝病毒(HCVcc)感染的試驗 本實施例的試驗藥物、試劑及材料同實施例1 實驗方法如下： (一)HCVcc的制備 1.病毒擴增 J6JFH1嵌合型HCVcc(105ffu/ml)，取50ul感染接種于24孔板的huh7.5.1細胞，次日換 液，隨后根據細胞生長密度傳代培養，觀察細胞生長狀態，待病毒快速增殖導致的細胞病變 效應(CPE)出現后，收集培養上清，12000rpm離心5min，棄去細胞碎片，0.45μπι濾膜過濾，取 適量用于病毒滴度測定，其余分裝后凍存于_80°C冰箱備用。
[0024] 2.病毒滴定 Huh7細胞接種24孔板，密度5X104個/孔，培養12h后，棄去培養上清，每孔加入100ul 10倍梯度稀釋的HCVcc，共孵育6h，更換為新鮮的培養基，繼續培養72h，通過免疫熒光法檢 測HCV陽性細胞，一抗用1:100稀釋的HCV抗體陽性病人血清，二抗用1:200稀釋的FITC標記 的羊抗人IgG。在熒光顯微鏡下觀察發光細胞，并記錄最后一個可觀察到綠色熒光陽性細胞 的孔內焚光陽性細胞數及相應的稀釋梯度，計算出focus forming unit/ml(ffu/ml)數值， 以此代表HCVcc滴度。
[0025] 3. PACMA31對Huh7細胞的細胞毒作用 為了評價PACMA31對Huh7細胞的細胞毒作用，將Huh7細胞接種96孔板，接種密度5 X 104 個/孔，培養6小時后加入不同劑量的?401^31(0、10、25、50、100 1^)，共孵育6小時后，應用 CCK8細胞活力檢測試劑盒檢測細胞活力，計算半數細胞毒性的藥物劑量（med ian cytotoxic concentration，CC50)〇
[0026] 4. PACMA31抑制HCV感染的實驗 取處于對數生長期的Huh7細胞，調整細胞濃度為1 X 105個/ml，取100μ1接種96孔板，培 養24h后加入化合物和HCVcc，化合物按0、10、25、50、100 ηΜ濃度稀釋，37度培養6小時后去 除化合物和HCVcc混合液，換培養液繼續培養;48小時后進行實時定量PCR和western blot 法檢測Huh7細胞內丙肝病毒RNA和蛋白水平，計算出半數有效濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50)〇
[0027] 通過細胞毒實驗和HCV感染實驗，我們發現化合物PACMA31劑量依賴性抑制HCVcc 的復制（如附圖1所示），EC50為70 nM，CC50約為200 ηΜ。
[0028] 實施例3 本實施例為PACMA31劑量時間依賴性抑制持續HCV感染的實驗 本實施例的試驗藥物、試劑及材料同實施例1。
[0029]實驗方法如下 1、HCVcc持續感染Huh7細胞構建 Huh7細胞接種10cm培養皿，接種密度5X106個/孔，培養12小時后，以HCVcc感染(Μ0Ι = 2)，在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養至細胞鋪滿平皿，以1比3傳代，繼續同條件培 養。連續培養14天，即建立HCV持續感染的Huh7細胞株。
[0030] 2、PACMA31對持續性HCVcc感染細胞的病毒抑制實驗 將HCVcc持續感染的Huh7細胞接種96孔板，密度5 X 104個/孔，于C02孵箱內培養6小時 后，加入化合物PACMA31(70 nM、100 nM)，繼續培養6小時，用100μ1完全培養基洗滌細胞3 次，加入新鮮培養基，繼續培養，并于化合物加入后不同時間點（1天、2天、3天、5天、9天），收 集細胞，抽提細胞總RNA，以實時定量PCR方法檢測細胞內HCV的RNA水平。
[0031] 三、實驗結果 如附圖2所示，PACMA31對持續性HCVcc感染呈現時間劑量依賴性抑制作用。在藥物作用 第9天時，細胞內HCV的RNA水平降低60%以上。
[0032] 上述實驗結果表明，化合物PACMA31能夠顯著的抗丙型肝炎病毒活性，因此可用于制備 抗丙型肝炎病毒的藥物。本發明為尋找抗丙型肝炎病毒藥物提供了新的來源。
[0033] 以上實施例僅僅是本發明的優選實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施 例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于 本發明保護的范圍。同時，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思 想，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在【具體實施方式】及應用范圍上均會有 改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。
【主權項】
1.化合物PACMA31在制備抗丙肝病毒感染藥物中的應用，所述PACMA31為酷胺類化合 物，化學式C21肥2N206S，CAS號為1401089-31-3,化學結構式如下其特征在于:所述抗丙肝病毒感染藥物為PACMA31作為唯一活性成分或包含PACMA31的 藥物組合物。
【文檔編號】A61K31/381GK105832722SQ201610245898
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】劉媛
【申請人】劉媛