可吸收的仿生韌帶假體的制作方法
【專利摘要】本發明具體涉及一種人工韌帶假體，值得注意的是，該假體包括全部或部分由PCL纖維構成的層。本發明的韌帶假體是一種可生物降解和“生物融合”的人工韌帶，消除了對不可降解的人工合成支架的擔憂和不確定性。此假體結構受天然組織啟發并與其類似，可生物降解，同時還可被消毒。其可被任意地種植以促進具有可控細胞及組織活性的功能性組織的形成，其具有所需的機械性能。本發明的假體可被緩慢吸收，以被等同于天然韌帶的功能性組織逐步地取代。
【專利說明】
可吸收的仿生韌帶假體
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種可吸收的仿生韌帶假體及其制備方法。
【背景技術】
[0002]膝蓋的前交叉韌帶(ACL)撕裂是一種常見傷病，在美國和歐洲居民中每年發病率為IZ^OOOt3ACL撕裂主要見于運動員:因而，超過65%的病史始于體育事故(滑雪，足球，橄欖球，對抗類運動)，受傷的平均年齡在20到29歲之間，70%的受其困擾的病人年齡在20到40歲之間。
[0003]ACL是穩定膝蓋的必要部分。一旦發生撕裂，由于其關節內位置及不充分的血管形成，ACL無法自動愈合，并發展為撕裂端的收縮和退化。由此引發的膝蓋松弛會導致不穩定的功能影響，其將阻礙或阻止體育活動、甚至日常活動的進行。另外，這種松弛在長期容易引起半月板損傷，進而導致膝蓋的骨關節炎樣退化，85%的患者在30歲時被觀察到這種退化(HAS報告，2008年6月)。基于以上原因，特別是年輕患者，常常求助于手術。在法國，2010年35,723位患者在ACL撕裂后接受手術(來源:PMSI，2010年)。
[0004]常見的手術技術基于使用自體移植體替換ACL:髕韌帶(肯尼斯-瓊斯技術)或內直肌和半腱肌的韌帶(DIDT技術)。但是使用自體移植體并非沒有缺陷(與組織取樣相關的病征，移植體在骨骼上的錨定缺陷，撕裂率仍然過高，失敗率估測約為15%)，且導致重新進行體育活動的恢復大為延遲(大于6個月)。
[0005]可替代方案使用合成韌帶替換撕裂的韌帶，減少由手術導致的醫源損傷，并提供即時的機械支撐。一些外科醫生推薦這項方案給高水平運動員，他們需要快速的功能恢復，以及經受不常見但更嚴重的多重韌帶損傷的病人。在后者的情況下，足量移植體的缺乏可導致帶有病毒傳播風險的異體移植物的使用，或者用于后交叉韌帶的、作為治療輔助的合成韌帶假體的使用。這種應用還有經濟方面的需求，可以降低功能復建和停止活動期的間接成本。
[0006]1970-80年間人工韌帶的開發意圖解決與韌帶自體和異體移植相關的不足和并發癥。多種人工韌帶應運而生，先是由碳制造，之后由聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯(Leeds-Ke1韌帶)、聚丙烯(肯尼迪韌帶強化設備)，或聚四氟乙烯(戈爾特斯(Gore-tex)，或ABCSurgicraft)。雖然這些韌帶在短期內治療ACL撕裂的效果良好，但其材料選擇完全不足，導致其抗磨損性低、疲勞態斷裂率高和融合率低，觀察到中期內治療的失敗。碎裂產生的韌帶殘渣是炎癥性滑膜炎和確切軟骨損傷的原因。對外移植的韌帶進行病理檢查，進一步揭示組織集落化不均，韌帶構成了破壞結構而非機械加強的部分。在初期的熱忱后，這些韌帶的使用逐漸變得有限，其作為增強自體韌帶結構的材料而非真正的替代。這些第一代韌帶的不理想結果使得法國在前交叉韌帶修復術的框架中不推薦其作為第一選擇。
[0007]在1990-2000年間，一種第二代合成韌帶被開發，使得在此領域出現一種創新方案(韌帶LARS(LigamentS LARS)) JARS假體(由PET制成的人工韌帶)是第二代韌帶假體，具有創新結構，是十五年來最廣泛使用的人工韌帶之一。但是，由于現在沒人知道合成結構在膝蓋的關節存在的長期影響，第三代人工韌帶也被提出。這些在FR0300495專利中描述的具生物活性的人工韌帶不會引發宿主的敵對反應，可以改善組織集落化、組織的功能性和骨骼錨定。
[0008]為克服這些不足，本申請提出開發一種具生物活性、可生物降解(生物混合)的韌帶，其沒有現有韌帶的任何缺陷，并構成一種可由從業者輕易操作并可誘導受損組織真正重生的醫療設備。
【發明內容】
[0009]因此本發明尤其涉及一種人工韌帶假體，制得注意的是，該假體包括全部或部分由可生物降解的纖維組成的層，優選為PCL。
[0010]根據本發明的一個優選實施方案，所述人工韌帶為關節或關節周圍的韌帶。根據一個完全優選的實施方案，所述人工韌帶為前或后交叉韌帶。
[0011]有利地，所述韌帶假體由所述層自身卷曲或折疊形成，所述層完全有利地包含兩個骨內的末端部分和一個中間的關節內部分。所述中間部分優選地由縱向瑋線的網絡組成，其橫向上相鄰但沒有連接在一起。在安裝韌帶的時候，對每根活動線進行縱向扭轉，形成左旋或右旋韌帶，其再造呈彎曲狀的韌帶的天然扭轉。
[0012]在本發明的框架內，術語“可生物降解”是指在生物體內就位后即可分解的材料。根據本發明的一個優選實施方案，術語“可生物降解”是指可在接觸生理條件的一個月到四年的時間段內失去其1%到100%之間的成分的纖維。根據本發明的一個完全優選的實施方案，術語“可生物降解”指從包含聚ε己內酯(PCL)，ε己內酯和乳酸(L和D)或乙醇酸的共聚物，乙醇酸和乳酸(L和D)的共聚物，聚二惡烷酮，聚羥基脂肪酸酯和這些不同分子的共聚物的組中所選擇的材料。
[0013]完全有利地，所述可生物降解的纖維是PCL纖維。PCL材料具有眾所周知的生物相容性，由PCL制成的韌帶具有極高的牽引阻力、彎曲力和扭力。
[0014]在1970年代和1980年代，聚己內酯(PCL)在可生物降解的縫合線的領域中被廣泛使用，因為可吸收更快的聚酯如P LGA的出現，其使用慢慢減少。P C L是具有高結晶度(約50%),玻璃化轉變溫度Tg為-60 0C，和熔融溫度Tm為60 °C的半結晶聚合物。因此，在37結下使用時，PCL的大分子鏈處于一個高度“柔性”的狀態，適用于軟組織的組織工程。此外，其在生物醫學領域的應用已獲證實，因為大量給藥裝置已經獲FDA和CE認證的批準。
[0015]PCL分解緩慢(按摩爾質量和材料的形態不同可長達4年)，與PLGA不同，PCL在降解過程中不產生任何極端的酸性環境。因此，PCL降解分兩步:首先，水解降解直到摩爾質量下降至3，000g.mol-l;然后，是發生在PCL小片段經吞噬作用后的細胞內降解。本發明的韌帶假體是一種可生物降解和“生物整合”的人工韌帶，消除了對不可降解的人工合成支架的擔憂和不確定性。此假體結構受天然組織啟發并與其類似，可生物降解，同時仍可被消毒。其可被任意地種植以促進具有可控細胞及組織活性的功能性組織的形成，其具有所需的機械性能。
[0016]本發明的假體可被緩慢吸收，以被一個等同于天然韌帶的功能性組織逐步取代。
[0017]根據本發明的一個優選實施方案，所述可生物降解的纖維直徑在I至400μπι之間。
[0018]根據本發明的一個優選實施方案，所述纖維摩爾質量在I至200，000g/mol之間。
[0019]根據本發明的一個優選實施方案，所述層完全由PCL纖維構成。
[0020]根據本發明的另一優選實施方案，所述可生物降解的纖維通過接枝聚合物呈現生物活性。因此，所述可生物降解的纖維包含生物活性聚合物。
[0021]再根據本發明的一個優選實施方案，所述生物活性聚合物是聚(苯乙烯磺酸鈉)。因此，本發明的韌帶假體有利于粘附，增殖，集落化和細胞分化以及胞外基質的產生，以重建功能性組織。
[0022]為了確保成纖維細胞在本發明的假體上有良好的“再增殖”，本發明提出一種賦予所述假體仿生功能化的方法，尤其是賦予其模擬活體材料的能力以改善其生物整合性。
[0023]因此，本發明還涉及一種處理由可生物降解的纖維構成的人工假體的方法，以便使假體具有模擬活體材料的能力，值得注意的是，所述的仿生功能化方法包括:至少一個向所述假體的纖維的表面接枝生物活性聚合物或共聚物的步驟;所述接枝步驟包括通過臭氧化進行表面的過氧化，之后用至少一種單體的溶液中進行自由基聚合。
[0024]根據本發明的一個優選實施方案，臭氧含量約50g/cm3的臭氧化持續時間在5至90分鐘之間。
[0025]根據本發明的另一個優選實施方案，單體是苯乙烯磺酸鈉。
[0026]再根據本發明的一個優選實施方案，單體溶液中單體的濃度在5%和1^%之間，其中k是接近單體溶液中單體的溶解度極限的濃度。
[0027]根據本發明的另一個優選實施方案，接枝步驟之前，還有額外步驟，是僅在能夠通過膨脹修飾表面的溶劑介質中制備纖維的表面，或先在溶劑介質中然后在水介質中制備。
[0028]根據本發明的另一個優選實施方案，溶劑介質包括乙醚、DMS0、己烷和/或乙醚。
[0029]對于PCL纖維，該溶劑介質優選為由乙醚組成。
[0030]根據本發明的另一個優選實施方案，溶劑介質由至少一種可通過膨脹修飾表面的溶劑組成。
[0031]根據本發明的另一個優選實施方案，可通過膨脹修飾表面的溶劑是具有低或零毒性的環醚或脂肪族型。
[0032]根據本發明的另一個優選實施方案，可通過膨脹修飾表面的溶劑選自以下溶劑的組:四氫呋喃(THF)，二甲基亞砜(DMSO)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，N，N-二甲基乙酰胺(DMA)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)。
[0033]根據本發明的另一個優選實施方案，在水介質中制備表面的步驟包括用堿金屬碳酸鹽水溶液或堿土金屬碳酸鹽如Na2CO3或CaCO3的水溶液熱處理聚酯表面，以去除表面上存在的聚酯的制備殘留。
[0034]根據本發明的另一個優選實施方案，所述方法包括在接枝步驟之后的額外步驟，用一種或多種有利于成纖維細胞集落的生化試劑浸漬假體。
[0035]最后，根據本發明的另一個優選實施方案，生化試劑是纖維粘連蛋白和/或I型和/或III型膠原蛋白家族中的蛋白質。
[0036]本發明的方法在此應用于已制成的韌帶假體上，或用于包含生物可降解纖維的層，其為制備所述假體的一部分。
[0037]通過非限制性的實施例給出的，根據本發明的韌帶和方法的完整的可替代實施方式的描述，其它的優點和特點將更加清楚。
【具體實施方式】
[0038]由PCL制成的可生物降解層的詳盡說明
[0039]PCL纖維制法優選為通過擠壓獲得，尤其是通過吹塑擠出、擠壓鑄造和/或擠壓紡絲。
[0040]另外，可生物降解的PCL纖維可由被稱為“電紡絲”的技術獲得，該技術允許由聚合物溶液獲得纖維并最終獲得聚己內酯(PCL)層。這種技術的原理在于向聚合物溶液施加高電壓，然后產生流的形成，一旦沉積在收集器上，便會形成纖維墊。此技術的靈活性使得可以制備纖維的直徑可通過影響溶液的濃度、組成和流速進行調節的纖維結構。
[0041 ] 步驟一:制備PCL的表面
[0042]1A)在溶劑介質中:
[0043]這個被稱為煮練的步驟是必要的，以除去在制備用作韌帶結構的PCL織物的過程中引入的油脂和雜質。這能使韌帶在植入患者的過程中，避免急性滑膜炎型的病理反應。此夕卜，該步驟使得可以保證成纖維細胞在如此清潔的PCL表面上生長，未清潔的表面上則觀察不到這種生長。
[0044]在溶劑介質中進行的該制備的三種可選方案可以根據所選溶劑性質和/或表面活性劑的不同而區分開。
[0045]-選擇1:利用能引起由PCL制得的表面膨脹的溶劑進行煮練:
[0046]使用能引起PCL表面膨脹的溶劑可通過提高臭氧作用步驟中被處理表面的過氧化物數量，提供增強接枝的優點。
[0047]此外，這種溶劑可選自下述溶劑的組:四氫呋喃(THF)，氯仿和二氯甲烷。這些溶劑的優點是無毒或低毒，因而易于用在工業環境中。
[0048]該處理通過將PCL浸沒于溶劑中約5分鐘至約I小時而實施，優選在10至25分鐘之間。如此，舉例來說，可選擇在室溫下浸沒于四氫呋喃(THF)中15分鐘。
[0049]-選擇2:利用溶劑和表面活性劑進行煮練，優選低于60°C在己烷存在下進行。
[0050]-選擇3:不經任何表面膨脹的煮練:
[0051]在S0HXLET裝置中進行最少12個萃取循環，在用己烷進行的第12個清洗循環后控制脂肪殘留。這些已烷清洗循環后是使用乙醚(RPE)的洗滌循環，洗滌最少3次，在第三次洗滌后控制殘留。
[0052]1B)在水介質中:
[0053]這個在水介質中制備表面的可選步驟目的在于除去表面上存在的PCL的制備殘留。在臭氧化之前完全準備好的表面就是這樣獲得的。
[0054]處理包括，在蒸餾水中含5%重量百分比碳酸鈉(Na2CO3)的溶液中洗滌PCL。該洗滌是在加熱條件下進行的，即，在60洗以上120滌以下的溫度條件下，更優選地是在微沸騰即100騰即下，條件下洗滌約十分鐘。當然，可以使用任何其它的堿金屬碳酸鹽或堿土金屬碳酸鹽，例如K2CO3或CaC03。洗滌后再用蒸餾水連續沖洗直至沖洗水的pH值回復到7。
[0055]1C)清洗:
[0056]無論先前步驟(采用步驟IA中的選擇I或選擇2，然后是步驟1B，或僅采用步驟1A)，由PCL制得的產品然后被清洗，例如用無水乙醇或四氫呋喃(THF)沖洗，接著在烘箱中烘干，例如烘30分鐘。
_7] 步驟2:在由PCL制得的表面接枝生物活性聚合物或共聚物:
[0058]2A)單體的選擇和制備:
[0059]本發明所用的單體是能進行聚合和自由基共聚的單體，能產生刺激細胞尤其是成纖維細胞的增生和細胞分化的生物相容性聚合物。這些包含羥基(hydroxyl)、羧酸鹽/酯(carboxylate)、磷酸鹽/酯(phosphate)、磺酸鹽/酯(sulfonate)和硫酸鹽/酯(sulfate)的單體，例如美國專利6，365，692中所記載的單體，在本發明中可單獨使用或混合使用。例如，可使用甲基丙烯酸和苯乙烯磺酸鹽/酯和它們的混合物。在使用這些單體聚合之前，首先要將單體純化。例如，對于苯乙烯磺酸鈉來說，是通過將它在雙蒸餾水/乙醇(10/90，vl0/混合物中進行重結晶，然后在70后溶于該溶液中來純化。接著用孔隙度指數為3的燒結玻璃盤進行真空過濾，然后置于4燒。形成的磺酸鈉晶體經過濾收集，所得的固體在50°C真空干燥直至恒重。
[0060]2B)臭氧化:
[0061]在如常規使用的臭氧化裝置中引入假體或步驟I制得的這些預處理的構成假體的PCL織物。
[0062]例如，可以使用含10cm3雙蒸餾水的500cm3管狀反應器，所述反應器具有提供臭氧的汲取管。例如，可采用相當于50g/m3氧氣的臭氧氣體流量。對于這種用量的臭氧，臭氧化PCL的最佳持續時間是5到90分鐘。過氧化物含量的測定顯示，在該臭氧流量下，在臭氧化10到30分鐘間獲得最佳速率。還需要注意的是，臭氧化時間超過90分鐘會大幅地降解PCL制得的表面。
[0063]此外要注意步驟IA的選擇2的加入。事實上，與采用不會引起膨脹的溶劑相比，使用能夠引起表面膨脹的溶劑會提高5倍過氧化物含量。一旦臭氧化完成，洗滌并清潔被引入臭氧化裝置中的假體或由PCL制得的織物，例如根據下述流程:用雙蒸餾水沖洗3次，然后用無水乙醇沖洗3次。接著，在真空烘箱中于25°C干燥30分鐘。
[0064]2C)聚合:
[0065]根據步驟2A所選擇和制備的單體置于水溶液中，優選為雙蒸餾水。可采用與最低重量百分比為2%的自由基聚合反應相容的任何組合。優選采用溶液中單體或多個單體濃度接近于溶解度極限的濃度，如此粘稠的介質相對于終止反應有利于自由基聚合的擴增反應。這回歸到選擇重量濃度k = s_e，其中s是溶解度極限，ε是1-7%重量百分比。因此例如在聚苯乙烯磺酸鹽的情況下，溶解度極限是20%重量百分比，可選擇15%的濃度。
[0066]聚合步驟的持續時間依賴于單體的性質。估計為介質在反應溫度下凝膠化所需的時間。因而，例如聚苯乙烯磺酸鹽在50在時的聚合將持續I小時，在30，時將持續15小時。
[0067]聚合反應在無氧的密封小室中進行，例如在吹氬氣下進行。將用于反應的單體或共聚用單體的溶液、預先臭氧化的假體或PCL組織條引入到小室中。在上述溫度下及上述時間內水浴加熱該密閉容器。
[0068]反應結束后，將經接枝的由PCL制得的部分從反應器中取出。為了去除尤其是未反應的單體(多個單體)殘留物，對這些接枝的材料進行清洗。例如，可用適當的單體的溶劑如雙蒸餾水清洗功能化的表面幾次，為了去除微量的未被接枝的單體和聚合物，可任選地再采用任何適當的溶劑例如無水乙醇完成清洗。
[0069]步驟3:用生化試劑浸漬:
[0070]該步驟是可選的。其目的在于加強韌帶的生物整合性能力，韌帶如步驟I和2所述的，已經接枝上了仿生聚合物。因而，用一種或多種生化試劑浸漬假體旨在提高其附著性能及細胞增殖性能。這些有利于成纖維細胞集落化的生化試劑是纖維粘連蛋白和/或I型和/或III型膠原蛋白家族中的蛋白質。優選使用前述蛋白的混合物，即，纖維粘連蛋白和I型和/或III型膠原蛋白的混合物:觀察到了對成纖維細胞粘附的協同效果。用這些試劑浸漬假體可以采用例如將韌帶浸入含膠原蛋白的溶液中的方式來進行。
[0071]顯然，浸漬步驟并不是一定要在接枝步驟之后，根據韌帶的制備階段，浸漬步驟也可在制備韌帶的其它步驟中或介于其它步驟間進行。另外，該浸漬步驟優選為在韌帶的滅菌步驟后進行。
[0072]PCL韌帶和層的滅菌
[0073]在開發含可水解的聚酯基的生物材料時，滅菌方法的選擇至關重要，必須對此特別注意。脂族聚酯是對濕度和對熱敏感，不能考慮通過高壓滅菌器或干熱的滅菌方法。此夕卜，在該殺菌方式中，增加了與難以從可生物降解的支架完全消除環氧乙烷殘留相關的毒性問題。
[0074]三種優選的滅菌方法是:用乙醇、紫外線輻射和輻射滅菌。
【主權項】
1.一種人工韌帶假體，其特征在于，所述假體包括全部或部分地由可生物降解的纖維組成的層。2.根據前一權利要求所述的人工韌帶假體，其特征在于，所述可生物降解的纖維包括選自以下組的材料，所述組包括:PCL、PCL和乳酸(L和D)或乙醇酸的共聚物、乳酸和乙醇酸(L和D)的共聚物、聚二惡烷酮、聚羥基脂肪酸酯和這些不同分子的共聚物。3.根據前一權利要求所述的人工韌帶假體，其特征在于，所述可生物降解的纖維包括PCL04.根據前一權利要求所述的人工韌帶假體，其特征在于，所述層完全由PCL纖維構成。5.根據前述任一權利要求所述的人工韌帶假體，其特征在于，所述可生物降解的纖維包括生物活性聚合物。6.根據前一權利要求所述的人工韌帶假體，其特征在于，所述生物活性單體是苯乙烯磺酸鈉。7.根據前述任一權利要求所述的人工韌帶假體，其特征在于，所述人工韌帶為關節的或關節周圍的韌帶。8.根據前述任一權利要求所述的人工韌帶假體，其特征在于，所述人工韌帶為前或后交叉韌帶。9.一種處理由可生物降解的纖維制成的人工假體的方法，以便使假體具有模擬活體材料的能力，其特征在于，仿生功能化的所述方法包括:生物活性聚合物或共聚物向所述假體表面的至少一個接枝步驟;所述接枝步驟包括通過臭氧化進行表面的過氧化，之后用至少一種單體的溶液進行自由基聚合。10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，對于50g/cm3的臭氧含量，臭氧化時間在5至90分鐘之間。11.根據權利要求9或10中任一項所述的方法，其特征在于，所述單體是苯乙烯磺酸鈉。12.根據權利要求9至10中任一項所述的方法，其特征在于，單體的溶液中單體的濃度在5%至1^%之間，其中k是接近所述溶液中所述單體的溶解度極限的濃度。13.根據權利要求9至11中任一項所述的方法，其特征在于，在所述接枝步驟之前，有僅在溶劑介質中或先在溶劑介質中然后在水介質中制備所述表面的額外步驟。14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述溶劑介質包括己烷或乙醚。15.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述溶劑介質由至少一種能通過膨脹而修飾所述表面的溶劑構成。16.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述能通過膨脹而修飾所述表面的溶劑是釀。17.根據權利要求15或16中任一項所述的方法，其特征在于，所述能通過膨脹而修飾所述表面的溶劑選自下述溶劑的組:四氫呋喃(THF)、二甲亞砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N_甲基吡咯烷酮(NMP)。18.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，在水介質中制備所述表面的步驟包括:用堿金屬碳酸鹽水溶液或堿土金屬碳酸鹽水溶液，例如Na2CO3或CaCO3，熱處理聚酯表面，以去除其表面上存在的聚酯的制備殘留。19.根據權利要求9至18中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法在所述接枝步驟之后還包括用一種或多種有利于成纖維細胞集落的生化試劑浸漬所述假體的額外步驟。20.根據權利要求19所述的方法，其特征在于，所述生化試劑是纖維粘連蛋白和/或I型和/或III型膠原蛋白家族中的蛋白質。
【文檔編號】C08L67/04GK105828846SQ201480063973
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年11月21日
【發明人】伯納德·布魯萊斯, 維羅妮卡·米貢奈伊, 羅杰·谷伊拉德
【申請人】拉思公司-科學研究與應用實驗室