沙門氏菌綴合物疫苗的制作方法

沙門氏菌綴合物疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基于片段化的Vi多糖和載體蛋白的綴合物，包含所述綴合物的組合物和用于制備所述綴合物和組合物的方法。
【專利說明】沙門氏菌綴合物疫苗
[0001]發明背景 疫苗中已經多年使用來自細菌的糖類。雖然糖類是T非依賴性抗原，然而，它們是弱免 疫原性的。此外，它們在2歲以下的嬰兒或幼兒中無效。綴合至載體可以有效地將T非依賴性 抗原轉化為T依賴性抗原，從而增強記憶應答并允許發展保護性免疫。迄今為止，最有效的 糖疫苗因此基于糖綴合物。均屬于Yeda Research and Development Co. Ltd.的W095/ 31994和W094/03208、US 5,204,098和恥2008/081022涉及弱免疫原性抗原的綴合物。
[0002] 許多綴合方法利用短寡糖，并且這主要用于改善制造工藝（更好地控制制造一致 性，更好地表征最終產品）。眾所周知的是，糖鏈長可以對綴合物疫苗的免疫原性具有影響 (P. Costantino 等人· Expert Op in. Drug Discov. , 6 (2011) 1045)〇Serum Institute of India Ltd的IN1330MUM2010涉及制造適合于綴合的多糖片段的方法。US 6,045,805還 描述用于制備寡糖的方法。
[0003] 傷寒仍然是發展中國家中的嚴重疾病，其每年影響數百萬人（Crump JA等人， Bull. Wld. Hlth. Org. 82，346-353 (2004); Ochai RL等人 and the Domi Typhoid Study Group, Bull. Wld. Hlth. Org. 86，260-268 (2008))。在過去十年中，針對該疾 病已經開發了綴合物疫苗。例如，NICHD/NIH開發了基于Vi(來自傷寒沙門氏菌腸血清變型 (Salmonella enterica serovar Typhi)的多糖)和rEPA蛋白載體的安全和高免疫原性綴 合物疫苗（Lanh等人，N. Eng. J. Med. 2003; Thiem等人，Clin Vac. Immunol. 2011; Szu, Expert Rev. Vaccines 12(11)，1273-1286 (2013))。許多論文討論Vi的免疫原性、 其綴合疫苗和被認為迄今最佳的Vi鏈長（Szu等人，Infection and Immunity, 1989， 3823; Szu 等人，Infection and Immunity, 1991, 4555; Szu 等人 Infection and Immunity, 1994, 5545; Kossaczka等人，Infection and Immunity, 1999, 5806;Cui等 人，Clin. Vaccine Immunol·, 17 (2010)，73-79; Micoli等人，Vaccine, 29 (2011)， 712-720; An等人，Vaccine, 29 (2011)，7618-23; Rondini等人，Clin.Vaccine Immunol·, 18 (2011)，460-68; An等人，Vaccine,30 (2012)，1023-1028)。
[0004] 最近，Micoli等人 Vaccine 2012和Rondini等人，J. Infect. Dev Ctries， 2012已經描述基于來自廣義地純化的弗氏梓檬酸桿菌(Citrobacter freundii )的Vi和 CRM197蛋白載體的傷寒沙門氏菌疫苗綴合物。當在人中測試時，Vi-CRM197綴合物疫苗與未綴 合的Vi相比在單次免疫之后且以較低的劑量提供更高的抗Vi抗體應答(van Damme等人， PlosOne 2011;在the 8th International Conference on Typhoid Fever and Other Invasive Salmonelloses, Bangladesh, March 2013呈現的進一步結果）。然而，再次接種 之后的抗Vi應答比初始應答更低，且抗Vi持續性比期望更短(Bhutta等人Lancet Infect Dis, 14 (2014) 119)。
[0005] 因此仍然需要提供改進的綴合物疫苗。
[0006] 發明概述 本發明涉及基于片段化的Vi多糖和載體蛋白的綴合物。具體而言，片段化的Vi多糖具 有40至55 kDa的平均分子量。本發明進一步提供包含本發明的綴合物的藥物組合物，包括 將本發明的綴合物或藥物組合物施用于哺乳動物的用于在所述哺乳動物中產生免疫應答 的方法，包括將本發明的綴合物或藥物組合物施用于哺乳動物的用于在所述哺乳動物中產 生基本上無 T非依賴性免疫應答的T依賴性免疫應答的方法，包括向有需要的受試者施用有 效量的本發明的綴合物或藥物組合物的用于在受試者中預防傷寒的方法，和用于制備所述 綴合物的方法。
[0007] 本發明的優選綴合物應當能夠誘導記憶應答，提供再次接種后的加強效應和持續 的抗體水平。理想地，所述綴合物應當在所有年齡的群體、特別是2歲以下的兒童中是有效 的。
[0008] 附圖簡述 圖1顯示用于制備本發明的綴合物的合成步驟(PS =片段化的多糖;prot.=載體蛋 白；RC=N=CR'可以是任何碳二亞胺，例如，通常為1-乙基_3_(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺）。
[0009] 圖2顯示組1至10的小鼠中的免疫應答。組1至4用包含片段化的Vi和作為載體蛋白 的CRM197的綴合物免疫，其中組1中的片段化的Vi具有9.5 kDa的平均分子量(avMW);組2中 的片段化的Vi具有22.8 kDa的avMff;組3中的片段化的Vi具有42.7 kDa的avMff;且組4中的 片段化的Vi具有82 kDa的avMW。組5用綴合至CRM197的天然Vi注射，組6至9分別用具有組1至 4的avMW的未綴合的片段化的Vi注射。組10接受天然Vi。
[0010] 圖3顯示傷寒沙門氏菌Vi多糖的重復單元，其中Ac是乙酰基。
[0011] 圖4顯示表明天然Vi和片段化的Vi(合并物1-4)中的0-乙酰化的量的4 NMR譜(在 NaOD 200 mM，在室溫，500 MHz)。
[0012] 圖5顯示天然Vi與片段化的Vi混合物相比的HPLC-SEC概況(214 nm)，且圖6顯示不 同avMW的四種片段化的Vi合并物（合并物1-4)。樣品在TSK凝膠3000 PW)(L柱上運行，用 恥出卩04 100 1111 恥(：110011115%〇13〇~(口!17.2)以0.5 1111711^11洗脫；￥〇 10.663 11^11;￥仂七 23.326 min〇
[0013]圖7顯示片段化的Vi avMW 42.7 kDa的HPLC-SEC概況（214 nm) (TSK凝膠3000 PWXL柱，NaH2P〇4 100 mM NaCl lOOmM 5% CH3CN pH 7.2，0.5 mL/min; V。10.663 min; Vtot 23.326 min;使用葡聚糖作為標準品）。峰面積的80%在70和25kDa之間。
[0014]圖8顯示當用全長未綴合的Vi、全長Vi綴合物和片段化的Vi綴合物免疫時，在野生 型小鼠相比于T細胞敲除(TCR )小鼠中觀察到的應答。
[0015] 圖9顯示在綴合至CRM197、DT和ΤΤ的全長Vi綴合物和片段化的Vi綴合物中觀察到的 應答。
[0016] 發明詳述 本發明涉及包含綴合至載體蛋白的片段化的Vi的綴合物。
[0017] 為了解釋本說明書的目的，以下定義將適用，且在任何適當的時候，以單數使用的 術語也包括復數，反之亦然。
[0018] 如本文所用，在本發明的上下文中（特別是權利要求的上下文中）使用的術語"一 (a)"和"一(an)"和"該(the)" "該"和類似術語應被解釋為包括單數和復數兩者，除非本文 另有指明或與上下文明顯矛盾。
[0019] 關于數值X的術語"約"是任選的，且意指例如x± 1〇%。
[0020] 如本文所用，術語"Vi"或"Vi多糖"是指純化自檸檬酸桿菌的傷寒沙門氏菌腸血清 變型（Salmonella enterica serovar Typhi)的莢膜多糖（Rondini等人，J. Infect. Dev. Ctries, 2012)。
[0021] 如本文所用，術語"天然的多糖"是指還沒有經過處理的多糖，所述處理的目的在 于降低所述多糖的大小。
[0022] 如本文所用，關于Vi多糖的術語"片段化的"是指已經經歷大小減小、因此降低多 糖的重復單元的數目的Vi多糖。因此，與天然的Vi相比，片段化的Vi具有較低的avMW。例如， 片段化的Vi可以包含30至300個重復單元，相比之下，天然的Vi包含超過600個重復單元。Vi 單體重復單元的結構顯示于圖3。在本發明的片段化的Vi中，優選沒有觀察到與天然Vi相比 重復單元的結構的變化。這可以通過咕匪R分析來證實（參見圖4)。此外，片段化的Vi中的 0-乙酰基的百分數優選與天然Vi相同（即，約95%0_乙酰化），但可以變化，并降低至約65% 0-乙酰化。0-乙酰化可以通過標準測量諸如1H NMR、Hestriη比色法來測定。
[0023] 如本文所用，術語"合并物(pool)"是指具有定義的平均分子量范圍且可以通過標 準方法與彼此分離的片段化的Vi的組群。合并物由如本文所定義的片段化的Vi組成。
[0024] 在其天然大小中，Vi多糖具有約165kDa的通過HPLC大小排阻色譜法(HPLC-SEC)測 量的平均分子量。本發明中使用的片段化的Vi具有40至55 kDa之間的avMW。該值通過HPLC- SEC測量。通常，通過具有TSK凝膠PW)(L保護柱（4.0 cm X 6.0 mm;粒徑12 μπι;編號 808033)的 TSK 凝膠 3000 PWXL 柱（30 cm X 7.8 mm;粒徑 7 μπι;編號 808021)(Tosoh Bioscience)上使用葡聚糖作為標準品（5、25、50、80、150 kDa)運行樣品而計算平均分子 量。流動相是0.1 M NaCl, 0.1 M NaH2P〇4, 5% CH3CN, pH 7.2,流速為0.5 mL/min(等度方 法，持續30分鐘）。分別用λ-DNA (λ-DNA分子量標記III 0.12-21.2 kb; Roche)和疊氮化鈉 (NaN3; Merck)進行空隙和床體積校準。
[0025]本發明的片段化的Vi可以進一步分離成不同的平均分子量范圍的合并物。這可以 通過本領域中已知的方法諸如陰離子交換色譜、大小排阻色譜、切向流過濾來實現。
[0026] 在本發明的一個實施方案中，片段化的Vi具有約40至55 kDa、更優選42至53 kDa、 甚至更優選45至50 kDa的avMW。在另一個實施方案中，片段化的Vi具有約41至49 kDa、優選 41至48 kDa、更優選42至46 kDa的avMW。在進一步實施方案中，片段化的Vi具有約43 kDa的 avMW。在進一步實施方案中，片段化的Vi具有51至55 kDa、優選52至54 kDa的avMW。在進一 步實施方案中，片段化的Vi具有約53 kDa的avMW。
[0027] 對于本領域技術人員將明顯的是，Vi或其片段的平均分子量可以根據測量的方法 而變化。如本文所述，對于平均分子量給出的值通過HPLC大小排阻色譜、通常使用本文所述 的柱、緩沖液和標準品來測量。然而，技術人員將理解，所使用的柱、緩沖液和/或標準品的 變化將影響計算的平均分子量。例如，當使用具有AcquityUPLCBEH200 1.7 mm柱(4.6x 150 mm)的UPLC-SEC系統以0.45 mL/min測量時，天然Vi具有148 kDa的計算的avMff，相比之 下，當使用本文描述的方法測量時，具有165 kDa的計算的avMW。因此，約+/- 10%的測量的 avMW的變化可以發生，并且本領域技術人員將理解的是，本發明不受絕對值限制，但可以在 測量變化的范圍內變化。
[0028] 本發明中使用的片段化的Vi的合并物具有特定平均分子量范圍分布，其可以在多 分散指數(PDI)方面進一步表征。如下面方程中所示計算多分散指數： PDI = Mw / Μη 其中Mw是重均分子量且Μη是數均分子量。
[0029] 分子量分布越窄，PDI值越接近于1。
[0030]片段化的Vi的合并物可以具有特征在于合并物中的至少80%具有25 kDa和70 1^3之間的3￥]\^的3￥]\^分布。其可以具有特征在于合并物中的至少50%具有35 1^3和60 kDa之間的a vMW的a vMW分布。
[0031] 其可以具有特征在于合并物中的至少30 %具有41 kDa和55 kDa之間的avMW的 avMW分布。
[0032]片段化可以通過本領域中已知的許多方法實施，所述方法諸如天然多糖的化學水 解、天然多糖的酶促片段化、天然多糖的γ照射，或機械方法諸如天然多糖的超聲處理、高 壓均化器/微流化器/HP⑶s(高壓細胞破碎系統）。
[0033]選擇本發明中使用的片段化方法，使得其可以得到片段化的Vi，其具有小于80 kDa、優選小于60 kDa、更優選40和55 kDa之間的avMff。
[0034] 還優選選擇方法，使得重復單元的結構沒有變化。
[0035] 優選地，片段化不通過機械方法。優選地，片段化不通過堿水解。
[0036] 本發明的片段化的Vi優選通過用過氧化氫化學水解來獲得。使用該方法，據發現， Vi多糖大小可以減小，而不改變重復單元的結構。此外，用過氧化氫水解可以使得形成片段 化的Vi，其具有比使用機械方法時更低的平均分子量。
[0037] 如果本發明的片段化的Vi通過用過氧化氫的化學水解而獲得，則發現添加催化量 的氯化鐵(FeCl3)使得反應能夠在較溫和條件(較低的溫度和較短的反應時間）下工作。因 此，在本發明的一個方面，提供用于將多糖片段化的方法，其包括在氯化鐵存在的情況下使 天然多糖與過氧化氫反應的步驟。更具體地，本發明的一個方面涉及用于將Vi片段化的方 法，其包括在氯化鐵存在的情況下使天然Vi與過氧化氫反應的步驟。甚至更具體地，該方法 包括使Vi與約3 %過氧化氫在水和0.1 mM氯化鐵中反應。優選地，反應的溫度為約20-40 °C。
[0038] 在本發明的另一個方面，提供用于將多糖片段化的方法，其包括在硫酸亞鐵存在 的情況下使天然多糖與過氧化氫反應的步驟。使用比FeCl3更可溶的硫酸亞鐵導致更可重 復的過程。在一個實施方案中，本發明涉及用于將Vi片段化的方法，其包括在作為催化劑的 硫酸亞鐵存在的情況下使天然Vi與過氧化氫反應的步驟。具體而言，該方法包括在0.1 mM 硫酸亞鐵存在的情況下使天然Vi與約0.5%過氧化氫在水中反應。優選地，反應的溫度為約 20-40°C。通過該方法獲得的片段化的Vi優選在用于本發明的綴合方法中前經受加熱步驟 (約 80°C)。
[0039] 片段化通常隨后為純化。
[0040] 純化可以通過本領域中已知的方法來實施。通常，純化通過陰離子交換色譜進行。
[0041] 純化通常得到不同的長度和不同的平均分子量范圍的片段化的Vi的"合并物"。
[0042] 本綴合物的載體蛋白可以選自CRM197或白喉類毒素。最優選地，載體蛋白是CRM197。 圖9顯示綴合至CRM197、白喉類毒素(DT)和破傷風類毒素(TT)的片段化的Vi的免疫應答的差 異。對于片段化的Vi與CRM197和白喉類毒素(DT)的綴合物看到的應答是T依賴性免疫應答典 型的（第一次注射之后（第14和35天）的較低的免疫應答，隨后為第二次注射之后（第49天） 的加強應答）。相比之下，片段化的Vi與破傷風類毒素(TT)的綴合物顯示對一個劑量的疫苗 的高抗體應答，而無對第二劑量的明顯回憶應答，這是當顯著的T非依賴性應答存在時觀察 到的發現。
[0043] 本發明進一步涉及用于制備包含片段化的Vi和選自CRM197或白喉類毒素的載體蛋 白的綴合物的方法，其包括以下步驟： a) 將Vi多糖片段化，以獲得具有40至55 kDa的avMW的片段化的Vi多糖； b) 使步驟a)中獲得的片段化的Vi多糖與碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺在5至6的pH反 應，以形成N-羥基琥珀酰亞胺酯 c) 使步驟b)中獲得的N-羥基琥珀酰亞胺酯與載體蛋白，以產生所述綴合物。
[0044] 本方法的一個實施方案描繪于圖1中。
[0045] 在本方法中，步驟a)任選隨后為純化步驟。純化步驟得到不同平均分子量范圍的 片段化的Vi合并物。具有40和55 kDa之間的平均分子量范圍的片段化的Vi合并物用于本方 法的步驟b)和c)中。
[0046]本方法的步驟b)中使用的碳二亞胺可以是任何合適的碳二亞胺，其能夠在水性介 質中綴合糖和蛋白。通常，所使用的碳二亞胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺） (EDAC)。或者，可以使用1-環己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺甲基-對-甲苯磺酸酯(CMC)。
[0047]在該方法的步驟b)中，片段化的Vi多糖優選在C00H基團方面以50 ymol/mL至200 ymol/mL的濃度存在。
[0048] 在該方法的步驟b)中，片段化的Vi的濃度可以是約15 mg/mL至約50mg/mL。片段化 的Vi的avMW越低，本方法的步驟b)中的Vi的濃度可以越高。
[0049] 反應介質中的碳二亞胺與片段化的Vi的⑶0H基團的摩爾比可以在1:1至10:1之間 變化。其可以為5:1。片段化的Vi的C00H基團的數目通常對應于Vi重復單元的數目。
[0050] 在步驟b)中，片段化的Vi的羧酸基團與碳二亞胺的反應得到0-酰基脲中間體，其 進而與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應以形成N-羥基琥珀酰亞胺酯。
[0051 ] 步驟b)中使用的NHS的濃度優選為約0.1M至0.4M。
[0052]用于本發明的方法的反應介質通常是2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液。
[0053]用于步驟b)的反應時間通常為約1小時。反應溫度通常為約20_30°C。
[0054] 步驟b)中獲得的所得中間體（用酯基團衍生的片段化的Vi)可以通過針對總糖含 量的HPAEC-PAD(具有脈沖安培檢測法的高效陰離子交換色譜）和針對NHS定量的離子對 HPLC-RP(反相HPLC)進行分析。這允許測定活化的片段化的Vi重復單元（即，已經與NHS反應 的片段化的Vi)的％。優選地，活化的片段化的Vi的％為10-50%，更優選約20-30%。
[0055] 本方法的步驟b)中獲得的中間體可以任選通過在低pH脫鹽或乙醇沉淀進行純化。
[0056] 在本方法的步驟c)中，本方法的步驟b)中獲得的N-羥基琥珀酰亞胺酯然后與載體 蛋白反應以產生包含片段化的Vi和所述載體蛋白的綴合物。
[0057] 載體蛋白是在制備用于疫苗中的綴合物中通常使用的蛋白。例如，載體蛋白可以 是CRM197或白喉類毒素。最優選地，載體蛋白是CRM197。
[0058] 載體蛋白可以在與本方法的步驟b)中獲得的NHS酯反應前進行衍生化。蛋白載體 可以通常用酰肼衍生化。通常，載體蛋白用己二酸二酰肼(ADH)衍生化(如顯示于圖1)。
[0059] 如果CRM197用作本方法的步驟c)中的載體蛋白，Vi與CRM197的w/w比優選為2:1至1: 2。例如，其可以是2:1、1:1或1:2。
[0060] 在本發明的方法的步驟c)中，反應介質中的衍生化的片段化的Vi(即，N-羥基琥珀 酰亞胺(NHS)酯）的濃度可以是約5 mg/mL至約10 mg/mL。片段化的Vi的平均分子量越低，本 方法的步驟c)中的NHS-酯的濃度可以越高。
[0061] 用于本發明的方法的步驟c)的反應時間通常為約2小時。用于本發明的方法的步 驟c)的反應溫度通常為約20-30°C。已知方法可以用于評價反應的完成。
[0062] 綴合步驟c)優選在MES緩沖液(pH 6)中、通常以約20mM的濃度進行。
[0063]在本方法的步驟c)中，pH優選為約6。該pH值低于當在綴合化學法中使用NHS時報 道的pH值。不希望受理論束縛，據信，在該pH范圍中，NHS水解比在較高pH時更慢，導致更有 效的綴合過程。
[0064] 通過本方法獲得的綴合物可以經受進一步純化過程。例如，所述綴合物可以通過 大小排阻色譜或切向流過濾、疏水色譜或離子交換色譜進行純化。
[0065] 在本方法中，步驟b)中使用的碳二亞胺和NHS的存在允許具有高綴合效率，而不改 變片段化的Vi重復單元的結構。如果僅使用碳二亞胺諸如EDAC(即，不存在NHS)，則需要高 濃度的所述碳二亞胺以使得該方法有效。此外，產生片段化的Vi的C00H基團上的N-酰基脲 基團，修飾多糖結構且改變其表位。NHS的使用避免這些衍生物的形成。用本方法，片段化的 Vi綴合物中的這些衍生物的百分數以摩爾計小于2% (Vi的碳二亞胺/C00H)，并且殘留的酯 基以摩爾計也小于1 %。
[0066] 由本方法獲得的綴合物的特征還在于游離的、即未綴合的片段化的Vi的量，其為 小于20%，優選小于15%，更優選小于5%。優選地，沒有檢測到游離的片段化的Vi。此外，優 選沒有檢測到游離的蛋白。本發明的綴合物可以進一步特征在于它們片段化的Vi與載體蛋 白比。例如，片段化的Vi:蛋白載體的w/w比可以是約1.5:1至約1:3。這些比率可以根據所使 用的片段化的Vi的平均分子量范圍而變化。它們也可以根據所使用的載體蛋白而變化。當 CRM197用作蛋白載體時，Vi與CRM197的w/w比可為約0.33至約1.33。在本發明的一個實施方案 中，其為約0.33。在本發明的一個實施方案中，其為約0.52。在本發明的一個實施方案中，其 為約0.64。在本發明的一個實施方案中，其為約1.33。
[0067]當白喉類毒素(DT)用作蛋白載體時，Vi與DT的w/w比可為約0.85。
[0068] 本發明的綴合物優選具有至少60%、更優選至少80%、甚至更優選至少90%0_乙 酰化。在一個最優選的實施方案中，本發明的綴合物具有約95% 0-乙酰化。這與天然Vi的 0-乙酰化相當，并且證實片段化不改變片段化的Vi單體重復單元的結構。
[0069] 0-乙酰化的百分數可以通過本領域中已知的方法諸如1Η匪R、Hestriη比色法來 測量。
[0070]在本發明的一個實施方案中，所述綴合物包含5至25 yg片段化的Vi。在本發明的 一個實施方案中，所述綴合物包含8 yg片段化的Vi。
[0071 ]在本發明的一個實施方案中，所述綴合物中的載體蛋白是CRM197。在本發明的一個 實施方案中，所述綴合物包含5至25 yg CRM197。在一個實施方案中，所述綴合物包含10至15 yg CRMi97〇
[0072] 在本發明的一種綴合物中，片段化的Vi的量為8 yg，且CRM197的量為12.5 yg。
[0073] 本發明的綴合物可以通過本文所述的方法進一步獲得。因此，可通過本發明的方 法獲得的綴合物也是本發明的一部分。
[0074] 本發明的綴合物可以進一步加工成藥物組合物。因此，本發明還提供包含本發明 的綴合物組合藥學上可接受的載體的藥物組合物。如本文所用，術語"藥學上可接受的載 體"包括任何和所有溶劑、分散介質、包衣劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌 劑、抗真菌劑）、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物穩定劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑 劑、甜味劑、調味劑、染料等及其組合，如本領域技術人員已知（參見，例如，G e η n a r 〇 (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy.第20版，ISBN: 0683306472)。除了任何常規載體與活性成分不相容的范圍以外，考慮其在治療或藥物組合 物中的用途。
[0075] 術語"治療有效量"的本發明的化合物是指本發明的綴合物將引起受試者的生物 學或醫學應答或預防疾病等的量。在一個非限制性實施方案中，術語"治療有效量"是指本 發明的化合物當施用于受試者時有效預防由傷寒沙門氏菌介導的病況或病癥或疾病的量。
[0076] 如本文所用，術語"受試者"是指動物。通常，所述動物是哺乳動物。受試者還是指 例如靈長類(例如，人，男性或女性）、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠、魚、禽類等。 在某些實施方案中，所述受試者是靈長類。在還有其它實施方案中，所述受試者是人。
[0077] 微生物感染影響身體的各個區域，所以可將本發明的組合物以各種形式制備。例 如，可將所述組合物制備為可注射劑，作為液體溶液或懸浮液。也可制備適合在注射前溶解 或懸浮于液體媒介物中的固體形式。所述組合物可以制備用于局部施用，例如作為軟膏劑、 乳膏劑或粉末劑。所述組合物可制備用于口服施用，例如作為片劑或膠囊，或作為糖漿劑 (任選地調味）。可將所述組合物制備為使用細粉或噴霧進行肺部施用，例如作為吸入劑。可 將所述組合物制備為栓劑或陰道栓。可將所述組合物制備用于鼻腔、耳部或眼部施用，例如 作為滴劑，作為噴霧劑，或作為粉劑。可將所述組合物包括于漱口水中。可將所述組合物凍 干。
[0078]所述藥物組合物優選是無菌的。其優選無熱原。優選將其緩沖在例如pH6至pH8、通 常約PH7。
[0079] 本發明的組合物可以包含本發明的綴合物和鹽水。
[0080] 本發明還提供含有本發明的藥物組合物的遞送裝置。所述裝置可以是例如，注射 器或吸入器。
[0081] 本發明的藥物組合物優選為免疫原性組合物，因為它們包含免疫有效量的多糖免 疫原。"免疫有效量"意指以單一劑量或作為一系列劑量的部分向個體施用該量對于預防是 有效的。該量取決于待治療個體的健康和身體狀況、待治療個體的年齡、分類組(例如非人 靈長類動物、靈長類動物等）、個體的免疫系統合成抗體的能力、期望的保護程度、疫苗制 劑、治療醫生對醫學情況的評估和其他相關因素而不同。預期所述量將落入可通過常規試 驗確定的相對寬范圍內。預期1 μ g至2 0μ g的劑量的糖，例如約5μ g /劑量。劑量處理可以是單 劑量時間表或多劑量時間表(例如包括加強劑量）。所述組合物可以與其它免疫調節劑結合 施用。
[0082] -旦配制，可以將本發明的組合物直接施用于受試者。待治療的受試者可以是動 物;具體而言，可以治療人受試者。
[0083] 通常預防性使用本發明的免疫原性組合物(即預防未來的感染）。
[0084] 在一個實施方案中，藥物組合物可以未佐劑化。
[0085] 在另一個實施方案中，免疫原性組合物可以包括佐劑。所述佐劑可以用于增強在 接受所述組合物的患者中引起的免疫應答(體液和/或細胞）。可以與本發明使用的佐劑包 括，但不限于： ?含有礦物質（包括鈣鹽和鋁鹽（或其混合物））的組合物。鈣鹽包括磷酸鈣（例如US 6355271中公開的"CAP"顆粒）。鋁鹽包括氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等，其中所述鹽采用任何 合適形式(例如凝膠、結晶、無定形等）。優選吸附至這些鹽。也可將含有礦物質的組合物配 制為金屬鹽的顆粒W02000/0023105。可使用已知為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是 常規的，但僅出于方便使用，因為其均不是存在的實際化合物的準確描述（例如參見 Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995,第9章）。本發明可使用通常用作佐劑的任何〃氫氧化物〃或〃磷酸鹽〃 佐劑。稱為〃氫氧化錯〃的佐劑通常是羥基氧化錯鹽(aluminum oxyhydroxide salts)(通常 至少部分為晶體）。已知為"磷酸鋁"的佐劑通常是羥基磷酸鋁，經常還含有少量硫酸（即硫 酸羥基磷酸鋁）。它們可通過沉淀獲得，沉淀期間的反應條件和濃度影響磷酸根取代所述鹽 中的羥基的程度。本發明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁兩者的混合物。在這種情況下，可以存在 比氫氧化鋁更多的磷酸鋁，例如重量比為至少2:1，例如，2 5:1、26:1、27:1、28:1、>9: 1等。施用于患者的組合物中A1+3的濃度優選小于10mg/ml，例如< 5mg/ml、< 4mg/ml、< 3mg/ ml、< 2mg/ml、< lmg/ml等。優選的范圍是0.3-lmg/ml。優選0.85mg/劑量的最大值。
[0086] .阜苷（Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995，第22章），其為在許多種類植物的樹皮、葉、莖干、根和甚 至花中發現的留醇糖苷和三萜糖苷的異質群體。已廣泛研究了作為佐劑的來自皂樹 (Quillaia saponaria Molina)樹皮的阜苷。阜苷也可商業獲得自麗花菝葜（Smilax ornata)(墨西哥菝葜）、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花）和肥阜草（Saponaria officianalis)(皂根）。皂苷佐劑制劑包括純化制劑諸如QS21，以及脂質制劑諸如ISC0M。 QS21作為Stimulon TM銷售。已使用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術的 特定純化級分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。優選地，所述皂苷為QS21。產 生QS21的方法公開于US 5,057,540。皂苷制劑也可包含甾醇，諸如膽固醇(W096/33739)。皂 苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復合物（ISC0M)的獨特顆粒(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995,第 23章 hISCOM通常還包括磷脂，諸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷均可用于 ISC0M中。優選地，ISC0M包括QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。TO96/33739和EP 0109942中 進一步描述了 ISC0M。任選地，ISC0M可不含額外去污劑W000/07621。開發基于皂苷的佐劑的 綜述可參見參考文獻Barr等人·（1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271 & Sjolanderet等人·（1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338。
[0087] ?細菌ADP-核糖基化毒素(例如大腸桿菌不耐熱腸毒素"LT"、霍亂毒素"CT"或百 日咳毒素"PT"）及其脫毒的衍生物，諸如稱為LT-K63和LT-R72的突變體毒素(Pizza等人 (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461)。脫毒的ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的 用途描述于W095/17211，且作為胃腸外佐劑的用途描述于W098/42375。
[0088] ?生物粘附劑和粘膜粘附劑，諸如酯化的透明質酸微球(Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276)或殼聚糖及其衍生物(W099/27960)。
[0089] ?優選由生物可降解且無毒的材料(例如，聚(α-羥酸）、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚 酐、聚己內酯等）與丙交酯乙交酯共聚物形成的微粒（即直徑為~lOOnm至~150μπι，更優選 直徑~200nm至~30μηι，直徑~500nm至~ΙΟμπι的顆粒），其任選經處理以具有帶負電表面 (例如用SDS處理)或帶正電表面（例如用陽離子去污劑諸如CTAB處理）。
[0090].脂質體（Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯 Powell & Newman) Plenum Press 1995，第13 & 14章）。適合用作佐劑的脂質體制劑的實 例描述于US 6,090,406和US 5,916,588。
[0091] ?胞壁酰肽，諸如N-乙酰基胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺（"thr-MDP"）、N-乙酰 基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰- L-A1-D-異谷氨酸-L-Ala-二棕櫚酰氧基丙基酰胺（"DTP-DPP"或"Theramide TM "）、N-乙酰基 胞壁酰-L-丙酰胺-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(^ -2'二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰基 氧基)-乙胺（"MTP-PE"）。
[0092] . Polyoxidonium聚合物（Dyakonova等人（2004) Int Immunopharmacol 4(13): 1615-23)或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。
[0093] . CD 1 d配體，諸如α-糖基神經酰胺（De Li ber〇 等人，Natur e Re v i ews Immunology, 2005，5: 485-496和US 5,936,076)(例如a-半乳糖基神經酰胺）、含有植物 鞘氨醇的a-糖基神經酰胺、0CH、KRN7000 [(25,35,410-1-0-(€[-0-半乳吡喃糖基)-2-0-二 十六烷基(hexacosanoyl)氨基)-1，3,4_十八烷三醇]、CR0NY-101、3''_0-硫代-半乳糖基神 經酰胺等。
[0094] . γ 菊粉（Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6 : 559-80)或其衍生物，諸如 algammulin〇
[0095] ?水包油乳液。各種此類乳液是已知的，并且它們通常包括至少一種油和至少一 種表面活性劑，其中所述油和表面活性劑是可生物降解的（可代謝的）和生物相容的。乳液 中的油滴直徑通常小于5μπι，并且可以甚至具有亞微米直徑，用微流化床實現這些小尺寸以 提供穩定乳液。優選尺寸小于220nm的液滴，因為這些液滴可以進行過濾除菌。
[0096] ?免疫刺激寡核苷酸，諸如含有CpG基序的(含有通過磷酸鍵連接至鳥苷殘基的未 甲基化的胞嘧啶殘基的二核苷酸序列)或含有CpI基序的(含有連接至肌苷的胞嘧啶的二核 苷酸序列）的免疫刺激寡核苷酸、或雙鏈RNA或含有回文序列的寡核苷酸或含有聚(dG)序列 的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可以包括核苷酸修飾/類似物諸如硫代磷酸酯修飾，且可 以是雙鏈或（除了RNA)單鏈的。參考文獻Kandimalla等人·（2003) Nucleic Acids Research 31: 2393-2400和W099/62923公開了可能的類似物取代，例如用2 脫氧-7-脫氮 鳥苷取代鳥苷。參考文獻諸如Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835、McCluskie等人 (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185、W098/40100、US 6， 207，646、US 6,239,116,、US 6,429,199中進一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列 可針對TLR9,諸如基序GTCGTT或TTCGTT (Kandimalla等人（2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3) :654-658) <XpG序列可特異性誘導Thl免疫應答，諸如CpG_A 〇DN(寡脫氧核苷酸），或其可更特異地誘導B細胞應答，諸如CpG-B 0DN。參考文獻Blackwell 等人（2003) J Immunol 170:4061-4068、Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65、 TOO 1 /95935中討論了 CpG-Α和CpG-B 0DN。優選地，CpG為CpG-Α 0DN。優選地，構建CpG寡核苷 酸，使得5 '末端可被受體識別。任選地，將兩個CpG寡核苷酸序列在其3 '末端連接以形成"免 疫聚體（immunomers)"。參見例如參考文獻Kandimalla等人（2003) BBRC 306:948-953、 Bhagat等人（2003) BBRC 300:853-861 和W003/035836。一種有用的 CpG佐劑是CPG7909,也 稱為ProMune ? (Coley Pharmaceutical Group，Inc ·)。另一種是CpG1826。作為使用CpG 序列的替代方案，或除了使用CpG序列以外，可以使用TpG序列(W001/22972)，且這些寡核苷 酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可富含嘧啶。例如，其可包含多于一 個連續的胸腺嘧啶核苷酸(例如TTTT，如參考文獻W001/22972中所公開），和/或其可具有含 有>25% (例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)胸苷的核苷酸組成。例如，其可 包含多于一個連續的胞嘧啶核苷酸(例如CCCC，如參考文獻W001/22972中所公開），和/或其 可具有含有>25% (例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等）胞嘧啶的核苷酸組 成。這些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸將通常包含至少20個 核苷酸。它們可包含少于100個核苷酸。
[0097]基于免疫刺激性寡核苷酸的特別有用的佐劑已知為IC-31 TM (Schellack等人 (2006) Vaccine 24:5461-72)。因此，與本發明使用的佐劑可包含以下的混合物：（i)包括 至少一個(且優選多個)CpI基序的寡核苷酸（例如15-40個核苷酸），和（ii)聚陽離子聚合 物，諸如包括至少一個(且優選多個)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(例如5-20個氨基酸）。所 述寡核苷酸可以是包含26聚體序列5'-(IC)13-3'的脫氧核苷酸。所述聚陽離子聚合物可以 是包含11聚體氨基酸序列Lys-Leu-Lys-Leu5_Lys-Leu-Lys的肽。
[0098] . 3-0-脫酰基化的單磷酰脂質A('3dMPL'，也稱為'MPL? '）（Myers等人（1990) Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions的第145-156頁，Ulrich (2000) Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Methods in Molecular Medicine系列的第42卷）的第16章（第273-282頁），Johnson等人（1999) J Med Chem 42:4640-9和Baldrick等人（2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398- 413)。在水性條件下，3dMPL可以形成具有不同大小的膠束聚集體或顆粒，例如具有<150nm 或>500nm的直徑。這些中的任一者或兩者均可以用于本發明，且可以通過常規測定選擇更 好的顆粒。根據本發明優選使用較小的顆粒（例如足夠小以提供澄清的3dMPL的水性懸浮 液），這是因為它們優異的活性(W0 94/21292)。優選的顆粒具有小于220nm、更優選小于 200nm或小于150nm或小于120nm的平均直徑，且甚至可以具有小于100nm的平均直徑。然而， 在大多數情況下，平均直徑將不小于50nm。
[0099] .甲基肌苷 5'-單磷酸酯（"MIMP"）（Signorelli & Hadden (2003) Int Immunopharmaco1 3(8):1177-86)〇
[0100] ?多聚羥化吡咯雙烷化合物(W02004/064715)，諸如具有下式的化合物： ，戶、η .… 較 ^ 0Η V抵w 0：HgOH! 其中R選自氫、直鏈或支鏈的、未取代的或取代的、飽和的或不飽和的酰基、烷基(例如 環烷基）、烯基、炔基和芳基或其藥學上可接受的鹽或衍生物。實例包括，但不限于:木麻黃 素(casuarine)、木麻黃素-6-a-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黃素、7-表-木麻黃素、3，7-二表- 木麻黃素等。
[0101] .咪唑并喹啉化合物，諸如咪喹莫特（"R-837"）（US 4,680,338、US 4,988,815)、 瑞喹莫德（"R-848"）(W092/15582)和它們的類似物;及其鹽(例如鹽酸鹽）。關于免疫刺激性 咪唑并喹啉類的進一步細節可見參考文獻Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571- 577、Wu等人（2004) Antiviral Res· 64(2):79_83、Vasilakos等人（2000) Cell Immunol. 204(1):64-74、美國專利4689338、4929624、5238944、5266575、5268376、5346905、5352784、 5389640、5395937、5482936、5494916、5525612、6083505、6440992、6627640、6656938、 6660735、6660747、6664260、6664264、6664265、6667312、6670372、6677347、6677348、 6677349、6683088、6703402、6743920、6800624、6809203、688800(^P6924293W&Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218。
[0102] ?縮氨基硫脲化合物，諸如參考文獻W02004/060308中公開的那些。活性化合物的 配制、制備和篩選的方法也描述于其中。縮氨基硫脲類在刺激人外周血單核細胞產生細胞 因子諸如TNF-α中特別有效。
[0103] ?色胺酮化合物，諸如參考文獻W02004/064759中公開的那些。活性化合物的配 制、制備和篩選的方法也描述于其中。縮氨基硫脲類在刺激人外周血單核細胞產生細胞因 子諸如TNF-a中特別有效 ?核苷類似物，諸如：（a)艾沙托立賓（Isatorabine) (ANA-245;7-硫雜-8-氧代鳥苷）：
[0104] .及其前藥；（b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)參考文獻US 6,924,271、 US2005/0070556、US 5,658,731中公開的化合物。洛索立賓(7-烯丙基-8-氧代鳥苷）（美國 專利5,011,828)。
[0105] ?參考文獻W02004/87153中公開的化合物，包括:酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合 物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環二酮化合物、氨基氮雜乙烯基化合物、氨基苯并咪唑 喹啉酮(ABIQ)化合物（US 6,605,617、1002/18383)、水合酞酰胺(取(1抑？丨1^13111丨(16)化合 物、二苯甲酮化合物、異噁唑化合物、留醇化合物、喹唑啉酮(Quinazi 1 inone)化合物、P比略 化合物(W02004/018455)、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑并嘧啶化合物和吲 哚(Benzazole)化合物(W003/082272)。
[0106].氨基烷基葡糖苷磷酸酯衍生物，諸如RC-529[Johnson等人（1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278，Evans等人（2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229)。
[0107] ?磷腈，諸如聚[二（羧基合苯氧基）磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy) phosphazene])( "PCPP"），如例如描述于參考文獻Andrianov等人（1998) Biomaterials 19:109-115 and Payne等人（1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.
如定義于W003/011223,諸如'ER 803058'、'ER 803732'、'ER 804053'、ER 804058'、 'ER 804059，、'ER 804442，、'ER 804680，、'ER
804764'、ER 803022或'ER 804057'，例如：
來自大腸桿菌的脂質A的衍生物，諸如OM-174 (描述于參考文獻Meraldi等人（2003) Vaccine 21:2485-2491 & Pajak等人（2003) Vaccine 21:836-842)。
[0108] ?含有連接至含有磷酸酯的非環骨架的脂質的化合物，諸如TLR4拮抗劑E5564 (Wong等人（2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42, US2005/0215517):
這些和其它佐劑-活性物質在參考文獻Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995 & Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols中更詳細討論。
[0109] 組合物中的抗原和佐劑通常處于混合物中。
[0110] 組合物可包括所述佐劑中的兩種或更多種。例如，它們可有利地包括水包油乳液 和3dMPL兩者，等。
[0111] 可與本發明使用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于： ?角藍稀、Tween80和Span 85的亞微米(submicron)乳液。所述乳液的體積組成可以是 約5 %角鯊烯、約0.5 %聚山梨醇酯80和約0.5 % Span 85。在重量方面，這些比率變為4.3 % 角鯊烯、0.5%聚山梨醇酯80和0.48%Span 85。這種佐劑已知為'MF59'（W090/14837, Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203, Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680)，如Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995的第10章和Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series)的第12章中更詳細描述。MF59乳液有利地包括梓檬酸根離子，例如lOmM 檸檬酸鈉緩沖液。
[0112] ?角鯊烯、生育酚和TweenSO的乳液。所述乳液可包括磷酸鹽緩沖鹽水。它也可包 括Span 85 (例如1%)和/或卵磷脂。這些乳液可具有2-10%角鯊烯、2-10%生育酚和0.3- 3%TWeen80,且角鯊烯：生育酚的重量比優選< 1，因為這提供更穩定的乳液。角鯊烯和 TWeen80可以約5:2的體積比存在。可通過以下制備一種此類乳液:將1'冊的80溶解于?85以 產生2 %溶液，然后混合90ml該溶液與（5g DL-α-生育酚和5ml鯊烯）的混合物，然后微流化 該混合物。所得乳液可具有亞微米油滴，例如平均直徑為100_250nm，優選約180nm〇
[0113] .角鯊烯、生育酚和Triton去污劑(例如Triton X-100)的乳液。所述乳液也可包 括3d-MPL(參見下文）。所述乳液可含有磷酸鹽緩沖液。
[0114] .包含聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯80)、1^如11去污劑(例如1^如11乂-100)和 生育酚(例如生育酚琥珀酸酯）的乳液。所述乳液可包括質量比約75:11:10的這三種組分 (例如75(^8/!111聚山梨醇酯80、11(^8/11111^切11乂-100和10(^8/1111€[-生育酚琥珀酸酯），并 且這些濃度應當包括來自抗原的這些組分的任何貢獻。所述乳液也可包括角鯊烯。所述乳 液還可包括3d-MPL(參見下文）。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液。
[0115] ?角鯊烯、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401("普朗尼克? L121"）的乳液。所述乳液 可在pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水中配制。該乳液是胞壁酰二肽的有用遞送媒介物，且已在 "SAF-Γ佐劑(Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25)中與蘇氨酰-MDP-起 使用（0.05-1 % Thr-MDP，5%角鯊烯，2.5%普朗尼克L121和0.2%聚山梨醇酯80)。它也可 以不與Thr-MDP使用，如"AF"佐劑(Hariharan等人（1995) Cancer Res 55:3486-9)(5%角 鯊烯，1.25%普朗尼克L121和0.2%聚山梨醇酯80)中。優選微流化。
[0116] .具有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非離子型表面活性劑的乳液。如 TO95/11700中所述，優選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰 肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心、磷脂。亞微米液滴尺寸是有利的。
[0117] ?不可代謝油（諸如輕礦物油）和至少一種表面活性劑（諸如卵磷脂，TweenSO或 Span 80)的亞微米水包油乳液。可包括添加劑，諸如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂綴合物 (諸如US 6,080,725中所述通過經由葡萄糖醛酸的羧基將脂族胺添加至脫酰基皂苷而產生 的GPI-0100)、二甲基雙十八烷基溴化銨和/或N，N-雙十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。
[0118] ?其中皂苷（例如Qu i 1A或QS21)和甾醇（例如膽固醇）結合為螺旋膠束的乳液 (W02005/097181)。
[0119] 本發明還提供本發明的綴合物，其用于醫藥中。例如，在一個實施方案中，本發明 的綴合物用于在哺乳動物中產生抗體應答。
[0120] 本發明還提供用于在哺乳動物中產生免疫應答的方法，其包括將本發明的綴合物 或藥物組合物施用于所述哺乳動物。本發明還提供用于在哺乳動物中產生基本上無 T非依 賴性免疫應答的T依賴性免疫應答的方法，其包括將本發明的綴合物或藥物組合物施用于 所述哺乳動物。
[0121] 本發明還提供本發明的綴合物或藥物組合物在制備用于預防疾病的疫苗中的用 途。
[0122] 在一個實施方案中，本發明還提供本發明的綴合物在制備用于預防哺乳動物中的 傷寒的藥物中的用途。
[0123] 通過這些方法和用途產生的免疫應答將通常包括抗體應答，優選保護性抗體應 答。用于評價糖免疫之后的抗體應答的方法是本領域中眾所周知的。例如，ELISA測定(酶聯 免疫吸附測定)通常用于測量抗Vi IgG應答。抗體應答優選是IgG應答，具有糖綴合物疫苗 特有的從IgM轉換至IgG的典型同種型。免疫應答通常是預防性的。哺乳動物優選是人。
[0124] 本發明的綴合物被認為與其中Vi多糖還沒有片段化的綴合物相比在生成T依賴性 應答中是更有效的。"T依賴性"應答意指能夠誘導再次注射之后的抗Vi應答(典型的回憶應 答)的增加的綴合物。"基本上無 T非依賴性應答的T依賴性應答"意指綴合物不能在T細胞敲 除小鼠中誘導抗V i應答。
[0125] 生成T依賴性應答的綴合物被認為相比于生成T非依賴性應答的綴合物是有利的， 因為已經發現T非依賴性應答不誘導記憶，被認為在2歲以下的兒童中是次優的，不會導致 二級淋巴組織的生發中心中的體細胞高變和因此抗體應答的親和力成熟（參見例如 Pollard A.J.等人，Nat. Rev. Immunol·, 2009; 9: 213)。此外，T非依賴性應答可以誘 導對后續接種的低應答的狀態（參見例如Poolman J.等人，Expert Rev. Vaccines, 2011; 10: 307)。
[0126] 本發明的綴合物似乎生成T依賴性應答，如圖2和圖8中所示。圖2顯示本發明的片 段化的Vi綴合物與天然Vi綴合物相比和與未綴合的天然和片段化的Vi相比在小鼠中的抗 Vi抗體應答。所使用的材料的描述在實施例5的表中給出。可以看到，對于組1至4(對應于綴 合至CRM197的片段化的Vi合并物1至4)，盡管在第14天(T14)與天然Vi綴合物(組5)相比抗Vi IgG應答更低(與天然Vi相比對于合并物1-3顯著，分別p = 0.0418，〈0.0001，0.0297)，但在 第35天(T49)在第二次注射后兩周觀察到可注意到的加強作用(p = 0.004-0.008)。如圖2 中所示，增加的抗Vi在第一次注射之后被天然Vi-CRM197 (組5)誘導，且在第二次注射之后 沒有增加。當使用較低劑量的天然Vi_CRM197綴合物(0.044狀、0.35 yg和2.8 yg -數據未 顯示)時，還觀察到這種第二次注射之后的增加的缺乏，表明抗體水平的增加的缺乏不是由 于一個劑量之后誘導最大應答。可以推測，對天然Vi綴合物的應答是由于長天然Vi鏈充當T 非依賴性抗原的能力。這得到以下事實支持:未綴合的天然Vi (組10)能夠誘導比較短Vi鏈 (組6至9)更高的應答，即使比天然Vi綴合物(組5)更低。相反，片段化的Vi綴合物(組1至4) 在第14天誘導較低響應，其通過第二次注射進一步增加，在兩個劑量之后達到與天然Vi綴 合物相當的抗Vi IgG抗體滴度。當與具有較低平均分子量的片段化的Vi綴合物(組1至3)和 天然Vi綴合物(組5)相比時，特征在于82 kDa的Vi鏈長的組4綴合物顯示中間行為。事實上， 在第14天的應答比用更短的片段化的Vi綴合物更高，且比用天然Vi綴合物沒有顯著不同。
[0127] 如圖2中所示，與天然Vi(組10)相比，未綴合的片段化的Vi誘導減弱的Vi IgG抗體 應答(組6至9)。對天然Vi(165kDa)的應答高于對片段化的Vi(82kDa -組9)的應答，其進而 高于對片段化的￥丨（分別9.5 1^)&，22.8 1^)&，42.7 1^^-組6至8)的應答(在第14天，未綴 合的片段化的Vi合并物1至3誘導的應答相對于天然Vi顯著更低，其中分別p = 0.0004， 0.0056,0.0403)。因此，本發明人已經鑒定了臨界鏈長（約82 kDa)，低于該鏈長，Vi多糖不 再能夠充當T非依賴性抗原。優選從不能誘導T非依賴性抗原特征的應答的多糖制備的Vi- 綴合物。
[0128] 為了驗證對于未綴合的片段化的Vi引發T非依賴性抗體應答的能力受損害且片段 化的Vi綴合物能夠誘導基本上無 T非依賴性應答的T依賴性應答的假設，在T細胞敲除小鼠 (TCR βδ-小鼠）中測試片段化的Vi-CRM197和天然Vi-CRM197綴合物。如圖8中可見，T細胞敲 除小鼠僅對未綴合和綴合的全長Vi應答，但沒有對片段化的Vi綴合物應答。此外，與T細胞 敲除小鼠中相比，綴合、但非未綴合的天然Vi能夠在野生型中誘導更高的應答(p=0.028,第 14天;p=0.002，第42天），表明野生型小鼠中的高應答源自混合的T依賴性/T非依賴性活性。
[0129] 因此，本發明的一個方面涉及用于在哺乳動物中產生基本上無 T非依賴性免疫應 答的T依賴性免疫應答的方法，其包括將本發明的綴合物或藥物組合物施用于所述哺乳動 物。
[0130] 在本發明的一個方面，提供用于在哺乳動物中增強多糖綴合物產生的免疫應答的 方法。所述方法包括： a) 鑒定未綴合的多糖停止誘導顯著的抗Vi IgG抗體應答的平均分子量值； b) 產生平均分子量低于步驟a)中確定的值的多糖的綴合物，和 c) 將步驟b)中獲得的綴合物施用于哺乳動物。
[0131] 本發明的綴合物（即含有綴合至如本文所定義的載體蛋白的片段化的Vi)，在誘導 適當的抗體應答中，比未綴合的片段化的Vi更有效(參見圖2)。
[0132] 本發明的組合物將通常直接施用于受試者。直接遞送可通過腸胃外注射(例如皮 下、腹膜內、靜脈內、肌內或至組織間隙），或通過直腸、經口、陰道、局部、透真皮、真皮內、經 目艮、經鼻、經耳或經肺施用完成。優選注射或鼻內施用。
[0133] 本發明可用于引發全身和/或粘膜免疫。
[0134] 根據本發明制備的疫苗可用于治療兒童(包括嬰兒）和成人兩者。因此，受試者可 以為小于1歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受疫苗的優選受試者為年輕人(例如 <5歲）。然而，所述疫苗不僅適用于這些組，還可更廣泛地用于人群中。
[0135] 治療可通過單劑量時間表或多劑量時間表。多劑量可用于初次免疫時間表和/或 加強免疫時間表。在多劑量時間表中，各個劑量可通過相同或不同的途徑(例如腸胃外引發 和粘膜加強，粘膜引發和腸胃外加強等)給予。多于一個劑量(通常兩個劑量或三個劑量)的 施用尤其可用于免疫幼稚的患者。多個劑量將通常間隔至少1周（例如約2周、約3周、約4 周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等)進行施用。一個實例時間表在6周齡時提供第 一劑量，且在10周齡時提供第二次劑量，以便與現有嬰兒免疫一致(與EPI疫苗共施用）。該 初始時間表可以隨后為兒童的第一個生日之后的加強劑量。
[0136] 可將本發明的綴合物與其它抗原組合成用于針對多種病原體同時免疫的單一組 合物。作為制備組合疫苗的替代方案，可將綴合物與其他疫苗基本上同時(例如在到醫療保 健專業或接種中心的同一醫學會診或診視期間）施用于受試者。用于這些組合疫苗中或用 于伴隨施用的抗原包括，例如，來自無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、金黃色葡萄 糖球菌（Staphylococcus aureus)和/或銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeuruginosa)、甲型 肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腦膜炎奈瑟氏菌(諸如糖類或綴合的糖類，對于血清群A、C、W135 和/或Y)、肺炎鏈球菌(諸如糖類或綴合的糖類)等的免疫原。
[0137] 在一個實施方案中，組合物可包含本發明的綴合物組合綴合至載體蛋白的甲型副 傷寒沙門氏菌抗原，諸如Η或0抗原(例如，0:2糖抗原），以提供二價傷寒疫苗。在另一個實施 方案中，組合物可包含本發明的綴合物組合綴合至載體蛋白的鼠傷寒沙門氏菌抗原，諸如Η 或〇抗原(例如，0:9糖抗原）。在另一個實施方案中，組合物可包含本發明的綴合物組合綴合 至載體蛋白的腸炎沙門氏菌抗原，諸如Η或0抗原（例如，0:4,5糖抗原）。在另一個實施方案 中，本發明的綴合物可以與抗原組合，所述抗原以被稱為膜抗原的廣義模塊(GMMA)或天然 外膜囊泡(N0MV)的外膜顆粒的形式呈現。此類膜顆粒的實例公開于例如W02012/049662和 W02011/036564 中。
[0138] 以下實施例意欲說明本發明，并且不應當被解釋為對其進行限制。溫度以攝氏度 給出。最終產物、中間體和原料的結構通過標準分析方法(例如微量分析和光譜特征)進行 證實。所使用的縮寫是本領域中常規的那些。
[0139] ADH 己二酸二酰肼 avMff 平均分子量 BCA 二喹啉甲酸測定法 EDAC 1_乙基_3_(3_二甲基氛基丙基)碳二亞胺 h 小時 HPAEC-PAD 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測 HPLC 高壓液相色譜 HR 高分辨率 IR 紅外光譜儀 kDa 千道爾頓 LCMS 液相色譜和質譜 Μ 摩爾濃度 MS 質譜 min 分鐘 mL 毫升 mM 毫摩爾濃度 NHS N-羥基琥珀酰亞胺 NMR 核磁共振 PS 多糖 rpm 每分鐘轉數 RT 室溫 SEC 大小排阻色譜 TFF 切向流過濾。
[0140] 實施例1 制備片段化的Vi合并物和分離的方法。
[0141] 將Vi溶解于水中，并添加 H2〇2 30% wt，用于具有2.5 mg/mL Vi和5% (wt/v) H2〇2 的最終濃度。將混合物在80±0.5°C加熱2小時。此時之后，將混合物注射于Hiscreen Capto Q柱(4.7 mL/直至100 mg片段化的Vi混合物的樹脂負載率），且使用梯度步驟方法分離不同 平均分子量(avMW)的四種群體。NaH2P〇4 20 mM pH 7.2和NaH2P〇4 20 mM NaCl 1M pH 7.2 分別用作緩沖液A和B。將片段化的Vi混合物負載于水中，且漸增avMW的合并物分別在25、 30、37和45%緩沖液B洗脫。將各收集的合并物在SEC S印hadex G-15柱上針對水脫鹽。
[0142] 獲得片段化的Vi合并物通過用于avMW計算的HPLC-SEC(參見圖6)、用于Vi含量的 HPAEC-PAD(Micoli等人，Vaccine 2011)、用于CH0基團測定的微BCA(使用NAcGlcN作為標 準品）（Meeuwsen等人.Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000 89(1):107- 109)進行表征。1H NMR用于驗證Vi身份并計算0-乙酰化水平（參見圖4)(Micoli等人 .Vaccine 2011)。圖7顯示片段化的Vi合并物3的HPLC-SEC概況，其具有42.7 kDa的avMW和 25和70 kDa之間的面積（214 nm)的80%。
[0143] 實施例2 通過使用H2〇2和FeCl3制備片段化的Vi和分離的方法。
[0144] 將1〇〇呢￥丨？5溶解于水中；并添加？6(：13 1〇111]\1和!12〇2 30%￥扒用于具有2.5 mg/mL Vi、0.1禮FeCl3和3% (wt/v) H2〇2的最終濃度。將混合物在30±0·1Γ加熱1小時。此時之后，將混合物以5 mg片段化的Vi混合物/mL樹脂的負載率注射至Capto Q柱上。 NaH2P〇4 20 mM pH 7.2和NaH2P〇4 20 mM NaCl 1M pH 7.2分別用作緩沖液八和8。將片段化 的Vi混合物負載于350 mM NaCl中，且目的群體在40%的緩沖液B洗脫。將片段化的Vi合并物 通過TFF 30-kDa針對10個體積的水進行滲濾。將片段化的Vi合并物通過針對avMW計算的 HPLC-SEC、針對Vi含量的HPAEC-PAD、針對驗證Vi身份和計算0-乙酰化水平的咕NMR進行表 征。具體而言，對于一種制備物，獲得avMW 53.8 kDa的片段化的Vi(少于17%面積〈30 kDa且 少于16%面積> 80 kDa)。。-乙酰化水平仍高(88%)。
[0145] 實施例3 通過使用H2〇2和FeS〇4制備片段化的Vi和分離的方法。
[0146] 將1〇〇呢￥丨？5溶解于水中；并添加？65〇4 1〇111]\1和!12〇2 30%￥扒用于具有2.5 mg/mL Vi、0.1 mM FeS〇4和0.5% (wt/v) H2〇2的最終濃度。將混合物在30±0.1°C加熱2小 時。此時之后，將EDTA添加至10 mM的最終濃度以猝滅催化劑。通過切向流過濾(30-kDa膜） 除去過氧化氫，并用NaH2P〇4 10 mM pH 7緩沖液交換。將混合物在80°C加熱2小時，然后以5 11^片段化的￥丨混合物/11^樹脂的負載率注射至0&?如〇柱上。似!^〇4 2〇1^?!17.2和 NaH2P〇4 20 mM NaCl 1M pH 7.2分別用作緩沖液4和8。將片段化的￥丨混合物負載于緩沖液八 中，且期望麗的群體在線性梯度中（50個柱體積中從100%緩沖液A至100%緩沖液B)分離。 將選擇的片段化的Vi合并物通過TFF 30-kDa針對10個體積的水進行滲濾。將片段化的Vi合 并物通過針對avMW計算的HPLC-SEC、針對Vi含量的HPAEC-PAD、針對驗證Vi身份和計算0-乙 酰化水平的1H NMR進行表征。具體而言，對于一種制備物，獲得avMW 43.4 kDa的片段化的 Vi(少于20%面積〈25 kDa且少于20%面積> 70 kDa)。。-乙酰化水平仍高(85%)。
[0147] 實施例4 制備片段化的V i綴合物的方法 對于片段化的Vi合并物1_3(實施例1中獲得）的綴合，以下程序用于綴合物制備。將片 段化的Vi以50 mg/mL的濃度溶解于MES 100 mM (pH 6)中。添加 NHS，然后添加 EDAC，以具有 5的EDAC/Vi重復單元摩爾比和NHS濃度0.33 M。將反應在室溫混合1小時。此時之后，添加如 Micoli等人.Vaccine 2011中先前描述制備的CRM197-ADH，以具有MES 20 mM (pH 6)中的 7.8 mg/mL的Vi和蛋白濃度（1的Vi與蛋白w/w比）。將混合物在室溫混合2小時。通過HPLC- SEC (TSK凝膠3000 PWXL柱)驗證綴合物形成，且在反應混合物中沒有觀察到殘余蛋白。在 1.6 cmx60 cm Sephacryl 100 HR柱上通過大小排阻色譜通過未反應的PS分離綴合物。將 不含未綴合的片段化的Vi的級分合并在一起并表征。
[0148] 將純化的綴合物通過用于總Vi含量的HPAEC-PAD(Micoli等人.Vaccine 2011)、用 于總蛋白含量的微BCA、用于測定綴合物的avMW分布和評價游離蛋白和游離糖的量的HPLC- SEC進行表征。對于合并物3和合并物4綴合物，通過Capto Adhere/HPAEC-PAD方法估計游離 糖。下表報道實施例5中測試的綴合物的主要特征。
[0149] 對于實施例1中獲得的片段化的Vi合并物4,上述反應條件導致凝膠形成，這可能 是因為該群體的較高avMW。對于該特定合并物，用15 mg/mL的Vi濃度、0.1 Μ的NHS濃度和5 的EDAC/Vi重復單元摩爾比進行用EDAC/NHS的活化步驟。相同條件用于與CRM197-ADH的綴合 步驟。
[0150] 通過Capto Adhere/HPAEC-PAD方法測定綴合物中的游離Vi的量 源自500 yL Capto Adhere樹脂懸浮液且用20 mM AcONa 30% CH3CN (pH 5)洗滌的沉 淀用于樣品的處理。向1.3!1^2〇11^似!12?〇4化117.2)中的綴合物（范圍6〇-150此/1^中 的總Vi濃度）中添加390 uL CH3CN(所得溶液在此處表示為負載樣品）。將一毫升負載樣品 添加至樹脂上，并在旋轉輪上在室溫孵育30分鐘。此時之后，將樣品離心（5分鐘，在4°C， 14000 rpm)，并洗出上清液(表示為流通物）。用1 mL 20 mM AcONa 30% CH3CN (pH 5)洗滌 沉淀（溶劑添加至樹脂，通過手工混合）（兩次）。通過離心回收沉淀（5分鐘，在4°C，14000 rpm)。收集的上清液（2 mL總體積）表示為洗滌溶液。向沉淀添加500 uL 1 M AcONa 30% CH3CN (pH 5)，通過手工混合，并通過離心分離（5分鐘，在4°C，14000 rpm)。將該操作重復 六次，合并上清液，表示為剝離溶液(3 mL總體積）。將剝離溶液、洗滌溶液、流通物和0.5 mL 負載樣品在SpeedVac中干燥，并重構于相同體積的水中。所有樣品都通過HPLC-SEC(熒光發 射)分析以驗證流通物、洗滌和剝離溶液中不存在綴合物。通過HPAEC-PAD測定負載樣品和 剝離溶液的Vi含量。
[0151 ]剝離溶液(未綴合的Vi)和負載溶液(總Vi)中的針對稀釋度校正的Vi含量的比率 代表樣品中的游離乂1的％。
[0152] 通過HPLC-SEC表征綴合物 HPLC-SEC用于在游離蛋白和游離糖方面表征綴合物。在具有TSK凝膠PWXL保護柱(4.0 cmx6.0 mm;粒徑 12 μπι;編號808033) (Tosoh Bioscience)的TSK凝膠G3000 PWxl柱（30 cmx7.8 mm;粒徑7 編號808021)上洗脫所有樣品。流動相是0.1 M NaCl，0.1 Μ NaH2P04，5%CH3CN，pH7·2，流速為0·5mL/min(等度方法，持續30分鐘）。HPLC-SEC還用于 估計綴合物樣品中的未綴合蛋白（熒光發射檢測)和片段化的Vi(對于合并物1和2)(折射率 檢測）的量。關于用范圍5-50 yg/mL中的蛋白樣品構建的校準曲線定量未反應的蛋白的面 積。通過將通過HPLC-SEC檢測的游離蛋白的量除以通過微BCA在樣品中定量的蛋白的總量 而計算未綴合的蛋白的百分數。類似地，關于范圍20-50 μg/mL中的（相同avMW的）片段化的 Vi的校準曲線定量未綴合的片段化的Vi的量。通過將通過HPLC-SEC檢測的游離Vi的量除以 通過HPAEC-PAD在樣品中定量的糖的總量而計算未綴合的糖的百分數。
[0153] 實施例5 片段化的Vi綴合物(DT和TT作為載體） 使用DT(白喉類毒素)和TT(破傷風類毒素)作為載體蛋白進行Vi合并物3(實施例1中獲 得)的綴合。如實施例3中所述活化片段化的Vi，并使用實施例3中描述的相同反應條件（1的 Vi與蛋白w/w比），在綴合的步驟中添加 DT-ADH或TT-ADH(如CRM197_ADH制備）。通過每蛋白引 入的較高數目的ADH接頭(針對6個CRM197，分別為12和23.5)表征DT-ADH和TT-ADH。所得綴合 物的主要特征報道于下表中。_^^_____
[0154] 實施例6 小鼠中的體內測試 用具有不同鏈長的Vi的Vi-CRM197綴合物(如實施例3中獲得，下表中的組1至4)，用天然 的Vi-CRM197綴合物(下表中的組5)，和用相應的未綴合的Vi多糖(組6至10)免疫十組10周齡 的CD1雌性小鼠。下表概述研究設計。在第0和35天給予兩次200 uL的皮下注射(各自含有8 yg Vi抗原），在第14、35和49天采血。注射鹽水溶液中的無佐劑的抗原。通過ELISA評估抗- Vi和抗-CRM197應答(如圖2中顯示）。
[0155] 如圖2中可見，在未綴合的Vi (組6-10)間，全長Vi (組10)是唯一能夠在第一次注射 之后誘導明確的應答的。相應的綴合物(組5)同樣如此。天然Vi-CRM197是唯一能夠在第一次 注射之后已經引起高應答的，第二次注射之后無加強。不同地，對于所有片段化的Vi綴合物 (組1-4)，該應答在第一次注射之后低，且在再次注射之后顯著更高。
[0156] 進行隨后研究以比較野生型和TCR 小鼠中的天然和片段化的Vi-CRM197綴合 物（圖8)。用具有不同鏈長的Vi的Vi -CRM197綴合物，用天然的Vi -CRM197綴合物，和用天然的 未綴合的Vi多糖免疫十組10周齡的雌性CD1野生型（下表中的組1-5)和T細胞敲除小鼠（下 表中的組6-10)。在第0和28天給予兩次200 uL的皮下注射(各自含有8 yg Vi抗原），在第 14、28和42天采血。注射鹽水溶液中的無佐劑的抗原。通過ELI SA評估抗-Vi和抗-CRM197應答 (如圖8中顯示）。
[0157] 獲得的數據證實，在小鼠中，片段化的Vi不能誘導T非依賴性應答，且相應的Vi- CRM197綴合物能夠誘導基本上無 T非依賴性應答的T依賴性應答。
[0158] 實施例7 -綴合至不同的載體蛋白的全長和片段化的Vi (fVi)(實施例1中描述的 合并物3)在小鼠中的體內測試 用下表中報道的綴合物免疫六組8個10周齡的CD1雌性小鼠。
nd:未檢測到。
[0159] 在第0和35天給予兩次200 uL的皮下注射(各自含有1 yg Vi抗原），在第14、35和 49天采血。注射鹽水溶液中的無佐劑的抗原。通過ELISA評估抗-Vi應答(如圖9中顯示）。
[0160]如圖9中可見，對于所天然的Vi綴合物，在第14天觀察到高應答，在第二次注射之 后無加強。獨立于所使用的載體，抗Vi IgG應答在所有全長天然Vi綴合物中是類似的。對于 片段化的Vi綴合物，對于CRM197和DT觀察到在第二次注射之后抗Vi IgG應答的增加(加強效 應），但對于TT沒有觀察到，表明綴合至CRM197或DT的片段化的Vi能夠誘導基本上無 T非依 賴性應答的T依賴性免疫應答。在第二次注射之后，不依賴于所使用的載體，抗Vi IgG應答 是類似的。
【主權項】
1. 適合于疫苗中使用的綴合物，其包含片段化的Vi多糖和選自CRM197或白喉類毒素的 載體蛋白，其中所述片段化的多糖具有40和55 kDa之間的平均分子量。2. 根據權利要求1的綴合物，其中所述片段化的多糖具有41和49 kDa之間的平均分子 量。3. 根據權利要求1的綴合物，其中所述片段化的多糖具有51至55 kDa的平均分子量。4. 根據前述權利要求中任一項的綴合物，其中所述載體蛋白是CRMm。5. 藥物組合物，其包含權利要求1或2中任一項的綴合物和藥學上可接受的載體的組 合。6. 根據權利要求3的藥物組合物，其中所述組合物是未佐劑化的。7. 根據權利要求3的藥物組合物，其中所述組合物包含佐劑。8. 用于在哺乳動物中產生免疫應答的方法，其包括將權利要求1至7中任一項的綴合物 或藥物組合物施用于所述哺乳動物。9. 用于在哺乳動物中產生基本上無 T非依賴性應答的T依賴性免疫應答的方法，其包括 將權利要求1至7中任一項的綴合物或藥物組合物施用于所述哺乳動物。10. 根據權利要求1至7中任一項的綴合物或藥物組合物在制備用于預防疾病的疫苗中 的用途。11. 用于在受試者中預防傷寒的方法，其包括將根據權利要求1至7中任一項的綴合物 或藥物組合物施用于有需要的受試者。12. 用于制備包含片段化的V i多糖和選自C RM i 9 7或白喉毒素的載體蛋白的綴合物的方 法，其包括以下步驟： a. 將Vi多糖片段化，以獲得具有40至55 kDa的平均分子量的片段化的Vi多糖； b. 使步驟a)中獲得的片段化的Vi多糖與碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺在5至6的pH反 應，以形成N-羥基琥珀酰亞胺酯 c. 使步驟b)中獲得的N-羥基琥珀酰亞胺酯Vi衍生物與所述載體蛋白，以產生綴合物。13. 根據權利要求12的方法，其中所述載體蛋白是CRMm。14. 根據權利要求10或11中任一項的方法可獲得的適合于疫苗中使用的綴合物。15. 具有40至55kDa的平均分子量的片段化的Vi多糖和選自CRM197或白喉類毒素的載體 蛋白在制備綴合物疫苗中的用途。
【文檔編號】A61K47/48GK105828839SQ201480061264
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年11月7日
【發明人】C.A.麥克倫南, L.B.馬丁, F.米科利, A.J.紹爾
【申請人】葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司