新型肽組合物的制作方法

新型肽組合物的制作方法
【專利摘要】除了其他以外，本申請提供了包含所提供的肽的新型肽組合物，以及使用所提供的肽和組合物的方法。在一些實施方式中，所述環肽在氨基酸之間(例如在任意兩個氨基酸之間)包含接頭。在一些實施方式中，本發明提供了包含一種或多種如式I所示的肽的組合物。在一些實施方式中，所提供的組合物包含如式I所示的肽和藥學上可接受的運載體。在一些實施方式中，所述藥物組合物還包含一種或多種選自下述的藥學上可接受的賦形劑：聚合物載體、崩解劑、潤滑劑、溶劑或膨化劑。
【專利說明】新型肽組合物
【背景技術】
[0001] 生物醫藥產品是疾病治療市場越來越普遍的部分。生物制品包括特別是疫苗、基 因療法以及天然或重組蛋白和/或肽。生物制劑可以包括糖、蛋白、核酸或這些物質的復雜 組合，并且已作為多種疾病、病癥和狀況的潛在治療劑。
[0002] 發明概述
[0003] 除了其他以外，本發明提供了包含所提供的肽的新型肽組合物，和使用所提供的 肽和組合物的方法。
[0004] 在一些實施方式中，本發明提供了包含根據式I的氨基酸序列六1&14&& 2-乂&&3- Ser4-Xaa5-Xaa6_Cys7(SEQ ID NO: 1)的肽。在一些實施方式中，Xaa2_Xaa6均可以是任意氨基 酸或肽鍵。在一些實施方式中，乂332選自4找、1^8、4]^、(^1：(瓜氨酸）、〇1'11(鳥氨酸）、乙酰化 的Ser、Sar、D_Arg 和 D_Lys。在一些實施方式中，Xaa3 選自 Val、Ala、Leu、Nle、Ile、Gly、Lys、 Pro、Aib(2-氨基異丁酸）、Acpc(l-氨基環戊烷基羧酸)和Tyr。在一些實施方式中，Xaa5選自 116、41&、1^11、11〇1'1^11、\^1和617。在一些實施方式中，Xaa6 選自 His、Arg 和 6_NH2-Phe(6-胺基 苯基丙氨酸）。在一些實施方式中，所述肽具有氨基酸序列4]^1-4坪2-'\^13-561' 4-1165-!^6- Cys7(SEQ ID N0:18)。在一些實施方式中，所提供的肽是非環肽。
[0005] 在一些實施方式中，所提供的肽包含氨基酸序列
[0006] Ala^ArgtVaP-TyP-IleS-HisS-Prc^-PheS-His'SEQIDNOJjS
[0007] Ala^Arg^Va^-Ser^Ile^His^Cys^Phe^His^SEQ ID N0:3)〇
[0008] 在一些實施方式中，所述肽是環肽。在一些實施方式中，所述環肽在氨基酸之間 (例如在任意兩個氨基酸之間）包含接頭。在一些實施方式中，所述接頭位于與SEQ ID N0:1 的Ser4和Cys7位置對應的殘基。在一些實施方式中，所述肽包含一個或多個化學修飾以增加 蛋白酶抗性、血清穩定性和/或生物利用度。
[0009] 在一些實施方式中，本發明提供了包含根據式I的一種或多種肽的組合物。在一些 實施方式中，所提供的組合物包含根據式I的肽和藥學上可接受的載體。在一些實施方式 中，所述藥物組合物還包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑，所述賦形劑選自聚合物載 體、崩解劑、潤滑劑、溶劑或膨脹劑。在一些實施方式中，將所述藥物組合物制成片劑、丸劑、 膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、噴霧劑、氣溶膠、脂質體組合物、軟膏、栓劑、植入劑、膏劑或緩釋制 劑。
[0010] 在一些實施方式中，將所述藥物組合物制成用于口服、肌內、靜脈內、皮下、局部、 透皮、直腸、陰道、肺、鼻內、頰內或舌下施用。
[0011] 在一些實施方式中，本發明提供了治療疾病、狀況或病癥的方法，所述方法包括向 需要其的對象施用一種或多種根據式I的肽，或者包含一種或多種根據式I的肽的組合物。
[0012] 如在本申請中所使用的，術語"約"和"近似"所表達的意義相同。本申請中帶有或 不帶有約/近似的任意數字涵蓋相關領域普通技術人員可以理解的任意正常波動。
[0013] 下文詳細清楚地描述了本發明的其他特征、目的和優勢。但應理解，說明本發明實 施方式的詳細描述僅具有說明性，并不具有限制性。本領域技術人員可根據詳細描述清楚 地理解本發明范圍內的各種變化和修飾。
[0014] 附圖簡述
[0015] 圖1顯示了在HUVEC中血管緊張素（1-7)(SEQ ID N0:4)與在各劑量刺激下的BDNF 水平的劑量-響應曲線。
[0016] 圖2描述了在HUVEC中Pancyte與在各劑量刺激下的BDNF水平的劑量-響應曲線。
[0017] 圖3顯示了在HUVEC中TXA301(SEQ ID N0:20)與在各劑量刺激下的BDNF水平的劑 量-響應曲線。
[0018] 圖4顯示了與對照相比在HUVEC中血管緊張素（l-7)、Pancyte、TXA301(SEQIDN0:20)、弗司扣林或異丙腎上腺素對BDNF的刺激的圖。
[0019]圖5顯示了在HDMEC中血管緊張素（1-7)與在各劑量刺激下的BDNF水平的劑量-響 應曲線。
[0020] 圖6描述了在HDMEC中Pancyte與在各劑量刺激下的BDNF水平的劑量-響應曲線。
[0021] 圖7顯示了在HUVEC中TXA301(SEQ ID N0: 20)與在各劑量刺激下的BDNF水平的劑 量-響應曲線。
[0022]圖8顯示了在HUVEC中若干血管緊張素（1-7)肽劑量-響應的復合圖，包括血管緊張 素（l-7)、Pancyte、TXA301(SEQ ID NOJOhAlaLArgLVaf-TyP-IlekHisS-Pro'SEQ ID NO: 17)或AlaLArgtVaf-Ser4-! 1 e5-His6-Cys7(SEQ ID NO: 18，也稱為TXA302)。
[0023] 圖 9 顯示了 HUVEC 產生的 cAMP 對不同劑量 AlaLArglVaP-SeP-IlekHisS-Cys7(SEQ ID NO: 18)的應答的示例性圖。
[0024] 圖10顯示了暴露于下述之一的大鼠的前肢放置測試的示例性結果：多至7周每日 一次皮下給予載劑、50yg/kg TXA301(SEQ ID N0:20)或50yg/kg TXA302(SEQ ID N0:18)。
[0025] 圖11顯示了暴露于下述之一的大鼠的踏步測試的示例性結果：多至7周每日一次 皮下給予載劑、50yg/kg TXA301(SEQ ID N0:20)或50yg/kg TXA302(SEQ ID N0:18)。
[0026] 圖12顯示了暴露于下述之一的大鼠的身體擺動測試的示例性結果：多至7周每日 一次皮下給予載劑、50yg/kg TXA301(SEQ ID N0:20)或50yg/kg TXA302(SEQ ID N0:18)。
[0027] 圖13顯示了暴露于下述之一的大鼠的神經評分測試的示例性結果：多至7周每日 一次皮下給予載劑、50yg/kg TXA301(SEQ ID N0:20)或50yg/kg TXA302(SEQ ID N0:18)。
[0028] 圖14顯示了暴露于下述之一的大鼠血流比（左/右％)和血管直徑的基于激光多普 勒評估的示例性結果：多至7周每日一次皮下給予載劑、50yg/kg TXA301(SEQ ID N0:20)或 50μg/kgTXA302(SEQIDN0:18)。在中風發生后進行49天檢測。
[0029]
[0030] 為了使本發明更加易于理解，下文中首先對某些術語進行了定義。下列術語和其 他術語的額外定義將在說明書中闡述。
[0031] 激動劑:本文中使用的術語"激動劑"指對目標蛋白的功能具有正向影響的任意分 子。在一些實施方式中，激動劑直接或間接地加強、增強、活化和/或增加目標蛋白的活性。 在特定的實施方式中，激動劑直接與目標蛋白相互作用。此類激動劑可以是例如蛋白、化學 化合物、小分子、核酸、抗體、藥物、配體或其他試劑。
[0032] 動物:本文中使用的術語"動物"是指動物界的任何成員。在一些實施方式中，"動 物"指處于任何發育階段的人。在一些實施方式中，"動物"指處于任何發育階段的非人動 物。在某些實施方式中，非人動物為哺乳動物(如，嚙齒類動物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、貓、綿 羊、牛、靈長類動物和/或豬）。在一些實施方式中，動物包括但不限于哺乳動物、鳥類、爬行 動物、兩棲類、魚、昆蟲和/或蠕蟲。在一些實施方式中，動物可以是轉基因動物、基因工程改 造的動物和/或克隆體。
[0033] 近似或約：本文中使用的術語"近似"或"約"當適用于一個或多個目標值時，是指 與規定的參考值近似的數值。在某些實施方式中，除另有說明或上下文另有證據表明（除了 當這些數字將超過可能數值的100 %時），術語"近似"或"約"是指在所述參考值的任意方向 (高于或低于）的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11 %、10%、 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小幅度以內的數值范圍。
[0034] 生物活性:本文中的短語"生物活性"是指在生物系統中（特別是在生物體中）具有 活性的任何試劑的特性。例如，給予生物體的一種試劑對此生物體具有生物作用，則認為此 試劑具有生物活性。在特定的實施方式中，若一種肽具有生物活性，則具有所述肽至少一種 生物活性的所述肽的部分一般稱為"生物活性"部分。在某些實施方式中，若某種肽并不具 有內在的生物活性，但抑制一種或多種天然存在的血管緊張素化合物的作用，則認為這種 肽具有生物活性。
[0035] 運載體或稀釋劑:本文中所用的術語"運載體"和"稀釋劑"是指用于制備藥物制劑 的藥學上可接受的（如給予人體時安全無毒）的運載體或稀釋用的物質。示例性的稀釋劑包 括無菌水、抑菌性注射用水(BWFI )、pH緩沖液(如磷酸鹽緩沖液）、無菌鹽水溶液、林格氏溶 液或葡萄糖溶液。
[0036] 劑型:本文中使用的術語"劑型"和"單位劑型"是指用于待治療患者的治療劑的物 理上不連續單位。各單位含有經預先確定的活性物質的量，經計算此數量能夠產生所需的 治療作用。但是應理解，組合物的總劑量應由主治醫師在合理的醫學判斷范圍內決定。
[0037] 給藥方案:本文中使用的術語"給藥方案"（或"治療方案"）是分別給予對象的、通 常間隔一定的時間段的一組單位劑量(通常超過一個）。在一些實施方式中，給定的治療劑 具有推薦使用的可以涉及一個或多個劑量的給藥方案。在一些實施方式中，給藥方案包含 多次給藥，各次給藥彼此間隔相同長度的時間間隔;在一些實施方式中，給藥方案包含多次 給藥，并且至少有兩種不同長度的時間段間隔各次給藥。在一些實施方式中，在預設定的時 間段內連續給予治療劑。在一些實施方式中，每日一次(QD)或每日兩次(BID)給予治療劑。
[0038] 功能性等價物或衍生物:本文使用的術語"功能性等價物"或"功能衍生物"指代保 有與原始序列基本相似的生物活性(功能或結構）的分子。功能衍生物或等價物可能是天然 衍生物或人工制備物。示例性的功能衍生物包括具有一個或多個氨基酸取代、缺失或增加 的氨基酸序列，前提是仍保持所述蛋白的生物活性。用于取代的氨基酸與被取代的氨基酸 理想地具有相似的理化性質。理想的相似理化性質包括在電荷、大小、疏水性、親水性等上 的相似性。
[0039] 改善、增加或減少:本文中使用的術語"改善"、"增加"或"減少"，或在語法上等同 的術語，是指與基線測量結果相關的數值，所述基線測量如本申請所述的在開始治療前相 同個體的測量，或在未接受本申請所述的治療的對照對象(或多個對照對象）中的測量。"對 照對象"是指與接受治療的對象患有相同形式的疾病、并與接受治療的對象年齡相仿的對 象（以確保在治療個體和對照個體中的疾病階段是可比的）。
[0040] 體外:本文使用的術語"體外"是指在人工環境(如在試管或反應器、在細胞培養物 等）中發生的事件，而非在多細胞生物體中發生的事件。
[0041] 體內：本文使用的術語"體內"是指在多細胞生物體(例如人體和非人動物）中發生 的事件。在基于細胞的系統的上下文中，此術語可用于表示在活細胞(相對于，例如體外系 統）中發生的事件。
[0042] 分離的:本文中使用的術語"分離的"是指（1)從在最初生產時具有相關性(不論是 在性質上還是和/或在實驗環境上）的至少部分成分中分開的，和/或(2)人工生產、制備和/ 或制造的物質和/或實體。經分離的物質和/或實體可以從與其初始相關的其他成分的至少 約 10%、約 20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、 約99%、基本100%或100%中分開。在一些實施方式中，經分離的試劑的純度超過約80%、 約85%、約90%、約91 %、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、 基本100%或100%。如本申請中所使用的，若一種物質基本不含其他成分，則認為其是"純 的"。本文中使用的術語"分離的細胞"是指不包含在多細胞生物體中的細胞。
[0043] 預防：本文中使用的術語"預防"或"防止"，當與疾病、病癥和/或狀況的發生連用 時是指發生疾病、病癥和/狀況的風險下降。見對"風險"的定義。
[0044]多肽:本文中使用的術語"多肽"是指通過肽鍵連接到一起的連續的氨基酸鏈。使 用該術語指代任意長度的氨基酸鏈，但本領域的普通技術人員將理解此術語不限于指代長 鏈，也可指代包含通過肽鍵相連的兩個氨基酸的最短鏈。如本領域的技術人員所知，可對多 肽進行加工和/或修飾。
[0045] 蛋白：本文中使用的術語"蛋白"是指作為獨立單位發揮功能的一條或多條多肽。 如果單一多肽是獨立的功能單位，且無需通過與其他多肽形成永久或暫時的物理結合以形 成獨立的功能單位，則術語"多肽"和"蛋白"的用法可互換。若獨立的功能單位包含相互物 理結合的一條以上的多肽，則術語"蛋白"是指物理偶聯并作為獨立單位共同發揮作用的多 個多肽。
[0046] 風險：通過上下文的理解可知，疾病、病癥和/或狀況的"風險"包含特定個體將發 生疾病、病癥和/或狀況(如亨廷頓氏病、雷特綜合征或中風）的可能性。在一些實施方式中， 風險以百分比表示。在一些實施方式中，風險從〇%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%直至 100%。在一些實施方式中，風 險表示為與參照樣品或參照樣品組相關的風險相對的風險。在一些實施方式中，參照樣品 或參照樣品組具有疾病、病癥、狀況和/或結果（如亨廷頓氏病、雷特綜合征或中風）的已知 風險。在一些實施方式中，參照樣品或參照樣品組來自于與特定個體可比較的個體。在一些 實施方式中，相對風險為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
[0047] 穩定性:在本申請中使用的術語"穩定的"指治療劑在較長一段時間內維持其治療 效果(例如全部或大部分其預期的生物活性和/或物理化學完整性）的能力。可以在較長的 一段時間內（例如至少1、3、6、12、18、24、30、36個月或更長)評估治療劑的穩定性和藥物組 合物維持此治療劑穩定性的能力。在某些實施方式中，已將如本申請所述的藥物組合物制 劑以穩定制劑中的一種或多種治療劑，或者延緩或阻止其降解。在與制劑相關的上下文中， 穩定的制劑是在貯存和加工（如凍/融、機械混合和凍干)期間所述治療劑在其中基本上保 持其物理和/或化學完整性和生物活性。
[0048] 對象:本文中使用的術語"對象"是指人或任何非人動物(如小鼠、大鼠、兔、犬、貓、 牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物）。人包括產前和產后的形態。在許多實施方式中，對象是人 類。對象可為患者，即去往醫師處診斷或治療疾病的人。本文中使用的術語"對象"與"個體" 或"患者"的用法可互換。對象可以患有或易患某種疾病或病癥，但可能顯示或可能未顯示 出所述疾病或病癥的癥狀。
[0049] 基本:本文中使用的術語"基本"是指顯示出目標特性或屬性的完全或接近完全的 范圍或程度的定性情況。生物領域的普通技術人員將理解，生物和化學現象極少(若有)達 到完全和/或向完全趨近，或者獲得或避免絕對結果。因此，本文中使用術語"基本"體現了 許多生物和化學現象中固有的缺乏完全性的可能。
[0050] 患有:個體"患有"疾病、病癥和/或狀況是指所述個體已確診或顯示出所述疾病、 病癥和/狀況的一種或多種癥狀。
[0051] 易患:個體"易患"疾病、病癥和/或狀況是指所述個體尚未確診此種疾病、病癥和/ 狀況。在一些實施方式中，易患疾病、病癥和/或狀況的個體可能未顯示出所述疾病、病癥 和/或狀況的癥狀。在一些實施方式中，易患疾病、病癥、狀況或結果的個體可能具有下列一 種或多種特征：（1)與所述疾病、病癥和/或狀況的發展相關的基因突變；（2)與所述疾病、病 癥和/或狀況的發展相關的基因多態性；（3)與所述疾病、病癥和/或狀況的發展相關的增加 和/或下降的蛋白表達和/或活性；（4)與所述疾病、病癥、狀況和/或結果的發展相關的習慣 和/或生活方式；（5)已進行、計劃進行或需要移植。在一些實施方式中，易患疾病、病癥和/ 或狀況的個體將發展為該疾病、病癥和/或狀況。在一些實施方式中，易患疾病、病癥和/或 狀況的個體將不會發展為該疾病、病癥和/或狀況。
[0052] 治療有效量:本文中使用的術語治療劑的"治療有效量"是指當給予患有或易患疾 病、病癥和/或狀況的對象時，足以治療、診斷、預防和/或延遲所述疾病、病癥和/或狀況的 癥狀的發作的量。本領域的普通技術人員應理解治療有效量通常是以包含至少一個劑量單 位的給藥方案來給藥的。
[0053] 治療:本文中使用的術語"治療" "處理"或"醫治"是指用于使特定疾病、病癥和/或 狀況的一種或多種癥狀或特征部分或完全減輕、改善、緩解、抑制、預防、延遲發作、減輕嚴 重程度和/或降低發生率的任何方法。可以向未顯示出疾病體征和/或僅顯示出疾病早期體 征的對象給予治療，以降低發生與疾病相關的病理的風險。
[0054] 某些實施方式的詳細描述
[0055] 除了其他以外，本發明提供了新型的肽、包括一種或多種那些肽的組合物和用于 治療或降低一種或多種疾病、病癥和/或狀況風險的方法，所述方法包括施用所提供的肽 和/或組合物。
[0056] 下列部分中詳述了本發明的各個方面。各部分的使用并不意味著限制本發明。各 部分可適用于本發明的任意方面。在本發明中，除另有說明，使用"或者"表示"和/或"。 [0057]所提供的肽
[0058]本申請中使用的術語"肽"和"多肽"是可互換使用的術語并且指由肽鍵鍵合在一 起的兩個或多個氨基酸。在本申請中使用的術語"肽"和"多肽"包括非環形(例如線形)和環 肽。
[0059]在一些實施方式中，本發明提供了多肽，所述多肽包含根據式I的氨基酸序列：
[0060] Ala^Xaa^Xaa^Ser^Xaa^Xaa^Cys^SEQ ID N0:l)〇
[0061] 在一些實施方式中，Xaa2_Xaa6均可以是任意氨基酸或肽鍵。在一些實施方式中， 父&&2選自厶坪、1^8、厶]^、(^1：(瓜氨酸）、〇1'11(鳥氨酸）、乙酰化的361'、331'、〇-厶坪和〇-1^8;父&& 3選自\%1、4]^、1^11、1'116、116、617、1^8、？1'〇、4;[13(2-氨基異丁酸）、40。(3(1-氨基環戊烷基羧 酸）和Tyr; Xaa5選自 11 e、Ala、Leu、norLeu、Val 和Gly;和Xaa6選自 Hi s、Arg和6_NH2-Phe (6-胺 基苯基丙氨酸）。
[0062] 在一些實施方式中，本發明提供了肽，所述肽包含氨基酸序列
[0063] Ala^Arg^Va^-Ser^Ile^His^Cys^SEQ ID N0:18)〇
[0064] 在一些實施方式中，所提供的肽是Mas受體的配體。Mas受體是包含七個跨膜區的G 蛋白偶聯受體。本申請中使用的術語"血管緊張素(1-7)受體"包含G蛋白偶聯的Mas受體。
[0065] 功能性等價物、類似物或衍生物
[0066] 在一些實施方式中，所提供的肽是根據式I的肽的功能性等價物。在本申請中使用 的根據式I的肽的功能性等價物指與根據式I的肽具有相同氨基酸序列，并基本保留了與對 照肽具有相同或相似的活性的任意肽。例如，在一些實施方式中，如本申請所述的根據式I 的肽的功能性等價物具有使用本申請所述的或本領域公知的方法確定的對來源于腦的神 經營養因子(BDNF)刺激活性。在一些實施方式中，如根據使用本申請中所述的或本領域公 知的多種檢測所測定的，本申請中所述的根據式I的肽的功能性等價物可連接至或活化血 管緊張素（1-7)受體(如G蛋白偶聯的Mas受體）。在一些實施方式中，所提供的肽是非環形 肽。
[0067] 通常，根據式I的肽的功能性等價物包含包括對照肽中出現的氨基酸中的至少3個 (如至少4個、至少5個、至少6個、至少7個)氨基酸的序列，其中所述至少3個(如至少4個、至 少5個、至少6個或至少7個)氨基酸保持了他們出現在對照肽中的相對位置和/或間距。在一 些實施方式中，所述對照肽是天然存在的Ang-( 1-7)，
[0068] AspLArglVaf-TyP-Ile^HisS-Pro'SEQ ID N0:4)〇
[0069] 在一些實施方式中，根據式I的肽的功能性等價物也包含含有與對照肽的氨基酸 序列具有至少約50% (如至少60%、70%、80%或90%) -致性的序列的任意肽。可通過氨基 酸序列比對確定氨基酸序列一致性的百分比。可按照本領域的多種方式進行氨基酸序列比 對，例如使用公眾可獲得的電腦軟件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域的 技術人員能夠確定用于測定比對的適宜參數，包括獲得相對于要對比序列全長的最大比對 所需的任意算法。優選使用WU-BLAST-2軟件來確定氨基酸序列一致性（Altschul等， Methods in Enzymology(酉每學方法)266,460-480(1996)；
[0070] http: //blast .wustl/edu/blast/README · html) m-BLAST-2使用多種檢索參數， 其大部分設置為默認值。可調參數的數值設置如下：重疊跨距=1，重疊分數= 0.125,代碼 閾值(word threshold)(T) = 11 ASP評分(S)和HSP S2參數為動態的數值，由程序自身根據 特定序列的組成來確定，然而最小值可以被調整并按上文所述來設置。
[0071] 在一些實施方式中，根據式I的肽的功能性等價物、類似物或衍生物是對照肽的片 段。在一些實施方式中，與對照肽相比，根據式I的肽的功能性等價物、類似物或衍生物含有 氨基酸的取代、缺失和/或插入。在一些實施方式中，功能性等價物、類似物或衍生物可通過 取代、添加和/或缺失來改變氨基酸序列來獲得。例如，AlalArg^VaP-SerMl^-His6- Cys'SEQ ID NO: 18)的序列中的一個或多個氨基酸殘基可被具有相似極性的另一個氨基 酸取代，作為功能性等價物，產生沉默改變。序列內氨基酸的取代可選擇此氨基酸所屬類別 的其他成員。例如正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。非極性(疏水性)氨基 酸包括亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。無電荷極 性氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。負電荷(酸性)氨基 酸包括谷氨酸和天冬氨酸。氨基酸甘氨酸可包括在非極性氨基酸家族或無電荷（中性)極性 氨基酸家族中。一個氨基酸家族內的取代一般稱為保守性取代。例如，肽抑制劑的氨基酸序 列可被修飾或取代。
[0072] 根據式I的肽的功能性等價物、類似物和衍生物示例在下文標題為"示例性肽"的 章節中描述。
[0073] 根據不同的實施方式，所提供的肽可以是任意長度。在一些實施方式中，根據本發 明的肽可以含有例如5-50或5-25個氨基酸殘基，如5-20、5-15或5-10個氨基酸殘基。在一些 實施方式中，根據本發明的肽含有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、30、35、40、45或50個殘基。
[0074] 在一些實施方式中，根據式I的肽含有一個或多個修飾以增加蛋白酶抗性、血清穩 定性和/或生物利用度。在一些實施方式中，適宜的修飾選自聚乙二醇化、乙酰化、糖基化、 生物素化、使用D-氨基酸和/或非天然氨基酸取代，以及/或肽環化。
[0075] 本申請中使用的術語"氨基酸"最為寬泛的含義是指可合并入一條多肽鏈的任何 化合物和/或物質。在某些實施方式中，氨基酸具有h2n-c(h)(r)-cooh的通式結構。在某些 實施方式中，氨基酸為天然存在的氨基酸。在某些實施方式中，氨基酸是合成或非天然的氨 基酸(例如，α，α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸）；在一些實施方式中，氨基酸為D-氨基酸;在 某些實施方式中，氨基酸為L-氨基酸。"標準氨基酸"是指在天然存在的肽中常見的二十種 標準氨基酸的任意一種，包括經天然摻入肽中的L-氨基酸和D-氨基酸。"非標準"或"非常規 氨基酸"是指除標準氨基酸以外的任何氨基酸，無論是通過合成制備的還是由天然來源獲 得的。本申請中使用的"合成或非天然氨基酸"包含經化學修飾的氨基酸，包括但不限于鹽、 氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代物。在肽中包括羧基末端和/或氨基末端氨基酸的氨基 酸，可進行甲基化、酰胺化、乙酰化修飾，和/或使用可改變肽的循環半衰期而對其活性沒有 不良影響的其他化學基團取代修飾。非常規或非天然氨基酸示例包括但不限于瓜氨酸、鳥 氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、4-(Ε)_ 丁烯基-4(R)_甲基-Ν-甲基蘇氨酸(MeBmt)、N-甲基-亮氨 酸(MeLeu)、氨基異丁酸、抑胃酶氨酸和N-甲基-丙氨酸(MeAla)。氨基酸可參與二硫鍵。術語 "氨基酸"可與"氨基酸殘基"互換使用，可指游離氨基酸和/或肽上的氨基酸殘基。從上下文 使用該術語時可顯而易見該術語是指代游離氨基酸還是肽的殘基。
[0076] 在某些實施方式中，根據式I的肽包含一個或多個L氨基酸、D-氨基酸和/或非天然 氨基酸。
[0077] 除了僅僅包含天然存在的氨基酸的肽以外，本發明還包含模擬肽 (peptidomimetic)或肽類似物。制藥業常使用肽類似物作為與模板肽具有類似性質的非肽 藥物。這種非肽化合物被稱為"肽模擬物"或模擬肽(Fauchere等，Infect. Immun. 54: 283- 287( 1986) ;Evans等，J.Med.Chem.30:1229-1239( 1987))。與具有療效的肽結構上有關的肽 模擬物可用于生產等價物，或者用于增強療效或預防效果。一般而言，模擬肽與樣板多肽 (paradigm polypeptide) (即，具有生物或藥理學活性的多肽）（例如天然存在的受體結合 多肽)結構相似，但其中一個或多個肽接頭被例如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH 2-、-CH=CH-(順 式和反式）、-ch2so-、-ch(oh)ch2-、-coch2-等接頭任選取代，取代的方法是本領域公知的 (Spatola,Peptide Backbone Modifications(肽骨架修飾），Vega Data, 1(3) :267(1983); Spatola等，Life Sci .38:1243-1249(1986) ;Hudson等，Int.J.Pept.Res. 14:177-185 (1979);和Weinstein.B.，1983，Chemistry and Biochemistry,of Amino Acids,Peptides and Proteins(氨基酸、肽和蛋白的化學和生物化學），Weinstein編，Marcel Dekker，New_ York，）。這種肽模擬物與天然存在的多肽相比可以具有顯著的優勢，包括更加經濟的生產、 化學穩定性提高、藥理性質(如半衰期、吸收、效能、有效性等)增強，抗原性降低等。
[0078] 所提供的肽也包含其他類型的肽衍生物，所述衍生物包含通常不是肽的組成部分 的其他化學部分，但前提是所述衍生物保持了所需的肽的功能活性。此類衍生物的示例包 括（1)氨基末端或另一個游離氨基的N酰基衍生物，其中所述酰基可以是鏈烷酰基 (alkanoyl)(如，乙酰基、己酰基、辛酰基）、芳酰基（如苯甲酰基）或保護基團如F-moc(荷甲 基-0-C0-); (2)羧基末端或另一個游離羧基或羥基的酯；（3)羧基末端或另一個游離羧基的 酰胺，所述酰胺由與氨或適當的胺反應而生成；（4)磷酸化的衍生物；（5)與抗體或其他生物 配體偶聯的衍生物及其他類型的衍生物；以及(6)與聚乙二醇(PEG)鏈偶聯的衍生物。
[0079] 所提供的肽可通過本領域技術人員公知的任意肽合成方法來獲得，包括合成（例 如純(exclusive)固相合成、部分固相合成、碎片縮合、經典溶液合成、自然化學連接）以及 重組技術。例如，肽和肽的衍生物可以通過固相肽合成法來獲得，簡要而言，此法由將C末端 氨基酸的羧基偶聯至樹脂(如二苯甲基胺樹脂、氯甲基化樹脂、羥甲基樹脂)和連續添加 Ν-α 保護的氨基酸來組成。保護基團可以為本領域公知的任意這種基團。在向不斷增長的鏈中 增加每個新的氨基酸之前，去除此前向鏈中添加的氨基酸的保護基團。此種固相合成已在 下列文獻中公開：Merrifi eld，J. Am. Chem.Soc.85:2149(1964);Vale等，Science 213: 1394-1397(1981)，美國專利號4,305,872和4,316,891，8〇(1〇1181^等〇16111.111(1.(倫敦），38: 1597( 1966);以及Pietta 和 Mar shall，Chem. Comm. 650( 1970)，由Lubell等，在 "Peptides" 3(^61106〇€37111：116818("肽"合成的科學）21.11，〇16111181：巧〇€41111(168(酰胺化學）， Thieme，Stuttgart，713-809 (2005)中進行的技術綜述。向適當的樹脂上偶聯氨基酸也是本 領域公知的，并在美國專利號4,244,946(在Houver-Weyl,Methods of Organic Chemistry (有機化學方法），卷E22a. Synthesis of Peptides and Peptidomimetics(肽和模擬肽的 合成），Murray Goodman主編，Thieme,Stuttgart.New York 2002中進行了綜述）中公開。
[0080] 除另有定義以外，本文中使用的科學和技術術語以及命名法與本發明相關領域的 普通技術人員通常理解的意義相同。總體而言，細胞培養、感染、分子生物學方法等過程是 本領域中的常用方法。這種標準技術可在參考手冊（如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(現在分子生物學指南），Wiley Interscience,New York 2001;以及 Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆：實驗室手冊），第3版， Cold Spring Harbor Laboratory Press,(紐約冷泉港實驗室出版社)Ν·Υ·,2001)中找到。
[0081] 在制備所提供肽的任何過程中，可能需要保護任何相關分子的敏感性反應基團。 可通過常規的保護基團來達到此種目的，例如在下列文獻中所述的保護基團：T.W.Greene& P.G.M.Wuts 的Protective Groups In Organic Synthesis(有機合成中的保護基團）， 1991，John Wiley and Sons，New_York;以及Sewald和Jakubke的Peptides:chemistry and Biology (肽:化學和生物學），2002，Wiley-VCH，Wheinheim，第142頁。例如，α氨基保護性基 團包括酰基型保護性基團（如三氟乙酰基、甲酰基、乙酰基）、脂肪族氨基甲酸乙酯保護性基 團（如t-丁氧羥基(B0C)、環己氧代羰基）、芳香族氨基甲酸乙酯型保護性基團（例如芴基-9- 甲氧基-羰基(Fmoc)、芐氧羰基(Cbz)、Cbz衍生物)和烷基型保護性基團（如三苯基甲基、芐 基）。氨基酸側鏈保護性基團包括芐基(對Thr和Ser)，Cbz(Tyr、Thr、Ser、Arg、Lys)、甲基乙 基、環己基(48口、把8)、130(：(4找、!^8、〇78)等。所述保護基團可使用本領域公知方法在方便 的后續階段中去除。
[0082]此外，所提供的肽可按照FM0C方案在有機相中使用保護性基團合成。理想的是，所 述肽使用高效液相色譜(HPLC)在C18色譜柱中以70%的產率純化，并使用10%~60%的乙 腈梯度洗脫。肽的分子量可通過質譜法進行檢測（在Fie Ids的"Solid-Phase Peptide Synthesis"（固相肽合成）Methods in Enzymology (酶學方法）·卷289,學術出版社 (Academic Press) ,1997中進行了綜述）。
[0083] 或者，所提供的肽可在重組系統中使用例如編碼多肽的多核苷酸序列來制備。應 理解，在同一多肽中可以包含一種以上的上述修飾。
[0084] 雖然肽在體外可有效地引起生物學活性，但所述肽的體內有效性可能因蛋白酶的 存在而下降。血清蛋白酶具有特異性的底物要求。底物必須同時具有L氨基酸和以供斷裂的 肽鍵。此外，代表了在血清中蛋白酶活性的最主要成分的肽鏈端解酶通常對肽的第一個肽 鍵產生作用，并且需要游離的N末端(Powell等，Pharm. Res .10:1268-1273( 1993))。鑒于此， 使用經修飾的肽常更有優勢。經修飾的肽保留了原始L氨基酸肽產生根據式I的肽所需生物 活性的結構特性，但具有不易被蛋白酶和/或肽鏈端解酶斷裂的優勢。
[0085] 可使用相同類型的D氨基酸系統性取代參照序列中的一個或多個氨基酸（如D-賴 氨酸取代L-賴氨酸）以生成更為穩定的肽。因此，本發明中的肽衍生物或模擬肽可全部為L、 全部為D或為由0和1^混合的肽、具有正向序列或反向序列。N末端或C末端D氨基酸的存在能 夠增加肽的體內穩定性，因為肽酶不能使用D氨基酸作為底物(Powell等，Pharm. Res . 10 : 1268-1273(1993))。反向D肽是指包含D氨基酸的肽，所述肽以與包含L-氨基酸的肽相反的 序列來排列。因此L-氨基酸肽的C末端殘基變為D氨基酸肽的N末端，以此類推。反向D肽保留 了與L氨基酸肽相同的二級構象，以及因此具有的相似活性，但在體外和體內對酶降解的抗 性更高，因此比原始肽具有更強的療效（Brady和Dodson,Nature 368:692-693(1994); Jameson等，Nature 368:744-746(1994))。類似地，可使用標準方法來生成反向L肽，其中母 體肽的C末端取代反向L肽的N末端。可以預見的是，不具有顯著二級結構（如短肽）的L氨基 酸肽的反向L肽保留了與L氨基酸肽相同的間距和側鏈構象，因此常與原始的L氨基酸肽具 有相似的活性。此外，反向肽可包含L氨基酸和D氨基酸的組合。氨基酸間的間距以及側鏈的 構象可以得到保留，從而產生與原始的L氨基酸肽相似的活性。
[0086] 另一種通過作用于肽的N末端或C末端殘基產生肽酶抗性的有效方法是在肽末端 增加化學基團，以使得經修飾的肽不再是肽酶的底物。一種此類化學修飾是在肽的一個或 兩個末端進行糖基化。某些化學修飾，特別是N-末端糖基化，已顯示出增加了人血清中肽的 穩定性(Powell等，Pharm. Res. 10:1268-1273(1993))。其他增強血清穩定性的化學修飾包 括但不限于，增加 N-末端烷基，所述烷基由從一到二十個碳的低級烷基組成，例如乙酰基， 和/或增加 C末端酰胺或經取代的酰胺基。特別地，本發明包括經修飾的肽，所述肽由帶有N 末端乙酰基和/或C末端酰胺基的肽組成。
[0087] 在肽的子序列中使用非天然存在的氨基酸取代天然氨基酸也可產生蛋白水解抗 性。此種取代可以例如通過肽鏈端解酶作用于N末端而不影響生物活性產生蛋白水解抗性。 非天然存在的氨基酸的例子包括α，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、C-α-甲基氨基酸、β-氨 基酸和甲基氨基酸。在本發明中有用的氨基酸類似物可包括但不限于丙氨酸、正纈氨 酸、正亮氨酸、4-氨基丁酸、鳥氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、環己基丙氨酸、 2_氨基異丁酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、〇-磷酸絲氨酸、Ν-乙酰絲氨酸、Ν- 甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸和其他非常規氨基酸。此外，使用非天然存在的氨基酸合成肽 是本領域的常規技術。
[0088] 此外，可使用本領域公知的方法產生包含參照序列或基本相同的參照序列變體的 限制性肽（constrained peptide) (Rizo和Gi eras ch，Ann .Re v.Biochem .61:387-418 (1992))。例如，限制性肽可通過增加能夠形成二硫橋的半胱氨酸殘基而生成環肽來產生。 可將環肽構建成沒有游離N或C末端。因此盡管這種肽易于被不能斷裂肽鏈末端的內肽酶水 解，但是不易于被肽鏈端解酶水解。除了存在N末端或C末端的D氨基酸殘基或其環狀結構以 外，具有N末端或C末端D氨基酸的肽的氨基酸序列以及環肽的氨基酸序列通常與其相應肽 的序列相同。
[0089] 環肽
[0090] 在一些實施方式中，根據式I的肽的功能性等價物、類似物或衍生物是環肽。本申 請中使用的環肽具有兩個非相鄰殘基間的分子內共價鍵。此分子內的鍵可以為主鏈與主 鏈、側鏈與主鏈或側鏈與側鏈間的鍵（即線形肽的末端官能團和/或末端或內側殘基的側鏈 官能團可以連接形成環化）。典型的分子內鍵包括二硫鍵、酰胺鍵和硫醚鍵。多種環化多肽 的方法以及可以對這種肽進行的多種其他修飾是本領域公知的。對于一般性的討論，參見 國際專利公開號W0 01/53331和W0 98/02452,其內容均通過引用并入本申請。此類環化鍵 合和其他修飾也可用于本發明的環肽和衍生化合物。
[0091] 本文中所述的環肽包含L氨基酸殘基、D氨基酸殘基或其任意組合。氨基酸可來自 天然或非天然來源，只要分子中存在至少一個氨基和至少一個羧基;一般優選α和β氨基酸。 環肽也可以含有一種或多種稀有氨基酸(例如4-羥脯氨酸或羥賴氨酸）、有機酸或酰胺和/ 或常見氨基酸的衍生物，例如具有C-末端羧酸鹽酯化(如芐基、甲基或乙基酯)或酰胺化和/ 或具有Ν末端氨基修飾(如乙酰化或烷氧基羰基化)的氨基酸，帶有或不帶有任意多種側鏈 修飾和/或取代（如甲基化、芐基化、叔丁基化、甲苯磺酰化、烷氧基羰基化等）。適當的衍生 物包括具有Ν-乙酰基(例如代表環化前的線形肽Ν末端的氨基被乙酰化)和/或C末端酰胺基 (即環化前的線形肽的羧基末端被酰胺化)的氨基酸。環肽中可存在的普通氨基酸以外的殘 基包括但不限于青霉胺、β，β_四亞甲基半胱氨酸、β，β_環戊烷半胱氨酸、β-巰基丙酸、β，β- 環戊烷-β_巰基丙酸、2-巰基苯、2-巰基苯胺、2-巰基脯氨酸、鳥氨酸、二氨基丁酸、α-氨基己 二酸、m-氨基甲基苯甲酸以及α，β-二氨基丙酸。
[0092]在合成帶有或不帶有Ν-乙酰化和/或C-酰胺化的線形肽后，可采用本領域技術人 員熟知的任意多種技術來進行環化。在一個實施方式中，在具有反應活性的氨基酸側鏈間 產生鍵合。例如，可通過任意多種方法使肽氧化使得包含兩個含有巰基殘基的線形肽形成 二硫橋。在一種這種方法中，可使用堿性或中性的水性介質，在數天時間內，通過巰基的空 氣氧化產生二硫鍵。對所用的肽進行高度稀釋使得聚凝集和分子間副反應最小化。另一種 方法是，使用強氧化劑如12和K3Fe(CN)6來形成二硫鍵。本領域的那些普通技術人員將理解 必須謹慎操作以防止將Met、Tyr、Trp或His的敏感側鏈氧化。在其他實施方式中，可通過形 成酰胺鍵完成環化。例如，可在末端官能團（即環化前的線形肽的氨基末端和羧基末端）間 形成肽鍵。在另一個此類的實施方式中，線形肽含有D-氨基酸。或者，可以通過連接一個末 端和一個殘基側鏈或使用兩個側鏈(帶有或不帶有N末端乙酰基和/或C末端酰胺的）來實現 環化。能夠形成內酰胺鍵的殘基包括賴氨酸、鳥氨酸(〇rn)、a-氨基己二酸、m-氨基甲基苯甲 酸、α，β_二氨基丙酸、谷氨酸或天冬氨酸。形成酰胺鍵的方法通常為本領域熟知。在一個這 種方法中，可以通過羧酸與DCC、DIC、ED AC或DCCI的反應來完成碳二亞胺介導的內酰胺形 成，從而形成了 0-酰基脲，然后0-酰基脲能夠立即與游離氨基反應來完成環化。或者，可使 用疊氮化物的方法完成環化，其中具有反應活性的疊氮化物中間體可由烷基醚通過酰肼產 生。或者，可以使用經活化的酯類來完成環化。酯類的烷氧基碳上存在吸電子取代基增加了 對氨解的敏感性。P-硝基酚、N-羥基化合物以及多鹵化苯酚的酯的高反應性使得這些"活性 酯"可用于合成酰胺鍵。在其他實施方式中，在含巰基殘基側鏈和適當衍生化的α-氨基酸之 間可形成硫醚鍵。舉例如下，賴氨酸側鏈可通過碳二亞胺偶聯的方法(DCC、EDAC)被偶聯至 溴乙酸，然后與上文所述的包含巰基殘基的任何側鏈反應來形成硫醚鍵。為了形成二硫醚 (dithioether)，任意兩種含疏基側鏈可與二溴乙燒和二異丙胺在DMF中反應。
[0093]示例性的肽 [0094]線形肽
[0095] 在某些方面，本發明提供了非環形(例如線形)肽。如上文所討論的，在不同實施方 式中，所提供的肽包含根據式I的氨基酸：
[0096] Ala^Xaa^Xaa^Ser^Xaa^Xaa^Cys^SEQ ID N0:1)
[0097] 其中Xaa可以是任意氨基酸，或其藥學上可接受的鹽。
[0098] 在一些實施方式中，Xaa2是六作、1^8、六1&、(^以瓜氨酸）、0?1(鳥氨酸）、乙酰化的 Ser、Sar、D-Arg和D-Lys。在某些實施方式中，Xaa2是帶正電的氨基酸如Arg或Lys，通常是 Arg〇
[0099] 在一些實施方式中，Xaa3是￥&1、六1&、1^11、肌6(正亮氨酸）、116、617、1^8、？仰、羥基 Pro (羥脯氨酸）、Aib (2-氨基異丁酸）、Acpc或Tyr。在某些實施方式中，Xaa3是脂肪族氨基酸 如￥&1、1^11、116或肌6，通常是￥&1或肌6。
[0100] 在一些實施方式中，Xaa5是116、六1&、1^11、11〇凡611、￥&1或617。在某些實施方式中， Xaa5是脂肪族氨基酸如Val、Leu、Ile或Nle，通常是lie。
[0101] 在一些實施方式中，Xaa6是His、Arg或6-NH2-Phe(6-氨基苯丙氨酸）。在某些實施方 式中，Xaa6是全部或部分帶正電的氨基酸(如Arg或His)。
[0102] 在某些實施方式中，Xaa2_Xaa6的一個或多個與天然存在的Ang_( 1-7)(即六叩1- Arg2-Val3-Tyr4-I le5-Hi s6-Pro7(SEQ ID N0:4))中的相應氨基酸相同。在某些此類實施方 式中，除一個或兩個以外其他Xaa2_Xaa6與天然存在的Ang-(l-7)中相應的氨基酸相同。在其 他實施方式中，全部的Xaa2_Xaa6與天然存在的Ang-(1_7)中相應的氨基酸相同。
[0103] 在某些實施方式中，Xaa3是Nle。當Xaa3是Nle，Xaa 2和Xaa5-6的一個或多個任選地與 天然存在的Ang-(l-7)中相應的氨基酸相同。在某些此類實施方式中，除一個或兩個以外其 他Xaa2和Xaa5^6與天然存在的Ang-(1-7)中相應的氨基酸相同。在其他實施方式中，每個Xaa 2和Xaa5^6與天然存在的Ang-(l-7)中相應的氨基酸相同，得到氨基酸序列"^^找 2-?^3- Ser4-Ile5-His6-Cys7(SEQIDN0 :5)。在一些實施方式中，所述的線形肽包含氨基酸序列 Ala^Arg^Va^-Tyr^Ile^His^Pro^SEQ ID N0:17)〇
[0104] 在一些實施方式中，所述的線形血管緊張素肽包含AspLArgtVaP-TyP-Ile5- His6-Pro7-Phe8-His9(SEQ ID ^):19)(其與六即-(1-9)的序列相同）的一個或多個氨基酸取 代、缺失或增加。在某些實施方式中，所述肽具有氨基酸序列41&14找2， &13-5打4-1165- His6-Cys7-Phe8-His9(SEQIDN0 :3)。在一些實施方式中，所述肽具有氨基酸序列Ala1- Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His 6-Pro7-Phe8-His9(SEQ ID N0:2)〇
[0105] 在一些實施方式中，所提供的線形肽可以包含下文所述的任意環肽的氨基酸序列 (即環肽未環化的線形版的氨基酸序列）。
[0106] 環肽
[0107] 在某些方面，本發明提供了包含接頭的根據式I的環肽類似物，例如在式I中Ser4和Cys7位置的相應氨基酸側鏈之間的接頭。這些肽的類似物一般包含7個氨基酸殘基，但也 可包含可裂解序列。如下文的更加詳細的描述，本發明包括片段和類似物，其中一個或多個 氨基酸被另一個氨基酸(包含片段)取代，例如AlalArg^ValS-SerLll^-HiJ-CysYSEQ ID從):18)，其中5虹4與0787之間形成接頭。
[0108] 雖然下面的章節描述了本發明在位置4和位置7連接殘基的硫醚鍵的方面，應理解 其他接頭(如上文所述)可以替代硫醚橋且其他殘基可以被環化。硫醚橋也可稱為單硫橋， 或者在Ala-S-Ala中，稱為羊毛硫氨酸橋。包含硫醚橋的肽可由具有下式之一的兩個氨基酸 形成：
[0109]
[0110]
[0111] 在這些式中，1?1、妒、1?3、1?4、1? 5和1?6獨立地為-11、烷基（如(：1-(：6烷基、(： 1-〇4烷基）或芳 烷基，其中所述烷基和芳烷基任選地被一個或多個鹵素、-OH或-NRR'基團取代(其中R和R' 獨立地為-HSCrCa烷基）。在某些實施方式中，1^、1?2、1?3、1?4、1? 5和1?6分別獨立地為-11或-〇13， 例如全部為-H。在一些實施方式中，所提供的環肽不包括硫醚橋。在一些實施方式中，所提 供的環肽不包括4,7硫醚橋。
[0112] 在某些實施方式中，本發明提供了包含如式（II)的硫醚橋的根據式I所示的肽或 其類似物或衍生物。通常，R1、R2、R3和R4獨立地選自-H和-CH 3。包含如式(II)的硫醚橋的肽可 通過例如羊毛硫細菌素（lantibiotic)酶或通過二硫化物的硫的擠出來生產。在一個實施 例中，擠出硫的二硫化物可通過位置4的D半胱氨酸和位置7的L半胱氨酸或通過位置4的D半 胱氨酸和位置7的L青霉胺形成（參見如Galande，Trent和Spatola(2003)Biopolymers 71， 534-551)。
[0113] 在其他實施方式中，兩個氨基酸間的接頭可以為式(III)或式(IV)中所示的橋。包 含如式(III)的硫醚橋的肽可以通過例如在位置4的D-高半胱氨酸和在位置7的L-半胱氨酸 形成的二硫化物的硫脫出來制備。類似的，包含如式（IV)所示的硫醚橋的肽可以通過例如 位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-高半胱氨酸形成的二硫化物的硫脫出來制備。
[0114] 如上文所述，本發明的肽及其類似物和衍生物的長度和氨基酸組成可以改變。在 一些實施例中，本發明的肽優選具有生物活性或者是可通過蛋白水解活化(例如通過裂解2 個氨基酸將具有10個氨基酸的血管緊張素（I)轉化為活性片段)的無活性前體分子。所提供 的肽或其類似物或衍生物的大小可以改變，但一般是約5至10個氨基酸，只要所述包含3-7 個硫醚-環結構的"核心"五聚體片段包含在內即可。本發明的類似物或衍生物的氨基酸序 列可以改變，通常前提是其具有生物活性或可通過蛋白水解來活化。可使用本領域公知的 方法來確定類似物或衍生物的生物活性，所述方法包括放射配體結合研究、體外細胞激活 檢測和體內實驗。例如可參見Godeny和Sayeski，（2006)Am.J.Physiol ·Cell .Physiol · 291: C1297-1307; Sarr等，Cardiovasc. Res. (2006)71:794-802 ;以及Koziarz等，（1933) Gen.Pharmacol.24:705-713〇
[0115] 當僅肽的長度改變時，所提供的肽或其類似物和衍生物包括下述：
[0116] 命名為[Cyc4-7]的4，7-環化類似物，具有包含厶13 1-厶作2，&13-〇7(：4-1165-!^8 6- Cyc7，SEQIDN0:6的氨基酸序列。
[0117] 命名為[Nle3，Cyc4-7] (1-10)的4，7-環化類似物，具 Ile5-His6-Cyc7-Phe8-His 9-Leu1Q，SEQ ID N0:7的氨基酸序列；
[0118] 命名為[Nle3，Cyc4-7] (1-8)的4，7-環化類似物，具有包含41&14找2-犯6 3氣7(：4- Ile5-His6-Cyc7-Phe8，SEQ ID N0:8的氨基酸序列；
[0119] 命名為[Nle3，Cyc4-7] (2-8)的4，7-環化類似物，具有包含厶找2，163-07(3 4-1165- His6-Cyc7-Phe8，SEQIDN0:9的氨基酸序列 ；
[0120] 命名為[祖63,07(34-7](3-8)的4,7-環化類似物，具有包含犯6 3-〇7(34-1165-財86- Cyc7-Phe8，SEQIDN0:10的氨基酸序列；
[0121 ]命名為[Nle3，Cyc4-7] (1-7)的4，7-環化類似物，具 Ile5-His6-Cyc7，SEQIDNO:ll的氨基酸序列 ；和
[0122] 命名為[Nle3，Cyc4-7] (1-9)的4，7-環化類似物，具 Ile5-His6-Cyc7-Phe8-His 9，SEQIDN0:12的氨基酸序列。
[0123] 這些類似物可具有式（11)-( IV)中所示硫醚橋之一作為Cyc〃部分，例如，其中 Cyc4和Cyc7可由式(II)表示，例如其中R1-!?4各自為-H或-CH 3,通常為-H。
[0124] 在某些實施方式中，本發明的肽如式(V)所示：
[0125] Ala^Xaa^Xaa^Cyc^Xaa^Xaa^Cyc^IV.SEQ ID NO: 13)
[0126] Xaa2是帶正電的氨基酸(如Arg或Lys)，通常是Arg。
[0127] Xaa3是脂肪族氨基酸(如Leu、Ile或Val)，通常是Val。
[0128] Cyc4與Cyc7結合形成硫醚橋。Cyc4可以為D-立體異構體和/或L-立體異構體，通常 為D-立體異構體。Cyc4(與Cyc7-起）的示例如式（II)、（III)和（IV)所示。通常，式（II)、 (III) 和（IV)中的R基團為-H或-CH3,特別是-H。
[0129] Xaa5是脂肪族氨基酸(如Leu、lie或Val)，通常是lie。
[0130] Xaa6 是 His。
[0131] Cyc7與Cyc4結合形成硫醚橋，如式(11)、（111)或(1\〇中所示。〇7〇 7可為〇-立體異構 體和/或L-立體異構體，通常為L-立體異構體。Cyc7的示例（與Cyc4-起)如式（II)、（III)和 (IV) 所示。通常，式（11)、（111)和（1￥)中的1?基為-!1或-〇13，特別是-!1。
[0132]在某些實施方式中，一個或多個Xaa2_Xaa6(Cyc4和Cyc 7除外）與天然存在的Ang- (1-7)的相應氨基酸相同。在某些此類實施方式中，除了一個或兩個以外，Xaa2_Xaa6中的全 部均與天然存在的Ang-(1_7)的相應氨基酸相同。在其他實施方式中，Xaa2_Xaa6中的全部均 與天然存在的Ang-( 1-7)中的相應氨基酸相同。
[0133] 在某些實施方式中，Cyc4和Cyc7獨立地選自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸），其中 Ala在至少一個位置上存在。因此，環狀類似物可具有由-Ala4-S-Ala7-(式（II)，其中RlR 4各自為-Η);-Ala4-S-Abu7-(式（II):R1-!? 3為-Η且R4為-CH3)或-Abu4-S-Ala 7-(式（II):R1、R3和R4為-H且R2為-CH3)形成的硫釀接頭。環狀類似物的特定不例包括-Abu 4-S_Ala7-或-Ala4- S-Ala7-接頭。
[0134] 在某些實施方式中，本發明的肽如式(VI)所示：
[0135] Ala^Xaa^Nle^Cyc^Xaa^Xaa^Cyc^Xaa^Xaa^Xaa^CVI.SEQ ID NO: 14)
[0136] 如上文所述，Xaa2、Xaa8、Xaa9和Xaa 1()中的一個或多個在某些實施方式中缺失。例 如，（1) Xaa1Q缺失，（2) Xaa9和Xaa1Q缺失，（3) Xaa8、Xaa9和Xaa1Q缺失，（4)Xaa2缺失，（5) Xaa2和 Xaa1()缺失，（5)Xaa2、Xaa9和Xaa1()缺失，或(6)Xaa 2、Xaa8、Xaa9和Xaa1()缺失。對于這些實施方式 中的各個實施方式，剩余的氨基酸如下所述。
[0137] Xaa2當存在時是帶正電的氨基酸(如Arg或Lys)，通常是Arg。
[0138] Nle3是正亮氨酸。
[0139] Cyc4與Cyc7結合形成硫醚橋。Cyc4可以為D-立體異構體和/或L-立體異構體，通常 為D-立體異構體。Cyc4(與Cyc7-起）的示例如式（II)、（III)和（IV)所示。通常，式（II)、 (III)和（IV)中的R基團為-H或-CH3,特別是-H。
[0140] Xaa5是脂肪族氨基酸(如Leu、Nle、Ile或Val)，通常是Ile。
[0141] Xaa6是His。
[0142] Cyc7與Cyc4結合形成硫醚鍵，例如式（11)、（111)或（1￥)中所示。〇5^ 7可為〇-立體異 構體和/或L-立體異構體，通常為L-立體異構體。Cyc7(與Cyc4-起）的示例如式（II)、（III) 和(IV)所示。通常，式(II)、（III)和(IV)中的R基為-Η或-CH3,特別是-Η。
[0143] Xaa8存在時為除Pro以外的氨基酸，通常為Phe或lie。在某些實施方式中，lie產生 Ang(l-8)抑制劑。在某些實施方式中，Phe保持了 Ang(l-8)或Ang(l-lO)的生物活性。
[0144] Xaa9當存在時是His。
[0145] Xaa1()當存在時是脂肪族殘基，例如Ile、Val或Leu，通常是Leu。
[0146] 在某些實施方式中，Xaa2_Xaa1()的一個或多個(Nle3、Cyc 4和Cyc7除外）與天然存在 的Ang(包含Ang-( 1-7)、Ang( 1-8)、Ang( 1-9)、Ang(l_10)、Ang(2_7)、Ang(2_8)、Ang(2_9)、 Ang(2-10)、Ang(3-8)、Ang(3-9)和Ang(3-10))中相應氨基酸相同。在某些此類實施方式中， 除了一個或兩個以外，Xaa2_Xaa1()(對于存在的那些而言）中的全部均與天然存在的Ang的相 應氨基酸相同。在其他實施方式中，Xaa2_Xaa1()(對于存在的那些而言）中的全部均與天然存 在的Ang中的相應氨基酸相同。
[0147] 在某些實施方式中，Cyc4和Cyc7獨立地選自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸），其中 Ala在至少一個位置上存在。因此，所包括的為含有由-Ala4-S-Ala7-(式（II)，其中RlR 4各 自為-H);-Ala4-S-Abu7-(式(II):R1-!? 3為-H且R4為-CH3)或-Abu4-S-Ala 7-(式(II):R1、R3和R4為-H且R2為-CH3)形成的硫醚接頭的環狀類似物。特定的環狀類似物包括-Abu 4-S-Ala7-或_ Ala4_S_Ala7_ 接頭。
[0148] 在一些實施方式中，本發明提供了在位置4和位置7之間具有硫醚橋且具有氨基酸 序列Ala^ArglNle3-Abu4-11 e5-His6-Ala7(SEQ ID NO: 15)或氨基酸序列Alai-Arg^Nle3- Ala4-Ile5-His6-Ala7(SEQIDN0 :16)的肽或其類似物或衍生物。
[0149] 在一些實施方式中，所提供的環肽可以是上文所述任意線形肽的環化版。
[0150] 藥物組合物
[0151 ]根據本發明的方法，所提供的肽或其類似物或衍生物可以單獨（例如以純的肽或 化合物），或者如本申請所述作為組合物或藥物中的成分(例如在生產用于治療疾病的藥物 中）向對象施用。所述組合物可以與生理學上可接受的運載體或賦形劑制劑以制備藥物組 合物。所述運載體和組合物可以是無菌的。所述制劑應適合于給藥方式。將組合物制劑的方 法是本領域公知的（參見例如Remington ' s Pharmaceuticals Sciences (雷明頓制藥科 學），第17版，Mack Publishing Co·, (Alfonso R.Gennaro 編著）（1989))。
[0152] 適宜的藥學上可接受的運載體包括但不限于水、鹽溶液(例如NaCl)、生理鹽水、緩 沖鹽、醇類、甘油、乙醇、阿拉伯膠、植物油、芐醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(如乳糖、直鏈 淀粉或淀粉）、糖類(如甘露醇、蔗糖或其他）、右旋糖、硬脂酸鎂、滑石粉、硅酸、粘性石蠟、芳 香油、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，及其組合。如有需要，所述藥物配制品 可以與助劑(例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色 劑、調味劑和/或芳香物質等)混合，其不與活性化合物發生有害的反應或干擾其活性。在優 選的實施方式中，使用適于靜脈內施用的水溶性運載體。
[0153] 如有需要，所述組合物或藥物還可以含有較少量的潤濕或乳化劑，或pH緩沖劑。所 述組合物可以是液態溶液、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、持續釋放制劑或粉劑。還可以 將所述組合物與常規的粘合劑和運載體(如甘油三酯)制劑成栓劑。口服制劑可以包括標準 的運載體(如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、糖精鈉、纖維素、碳酸 鎂等）。
[0154] 可以根據常規程序將所述組合物或藥物制成適于向人施用的藥物組合物。例如， 在優選的實施方式中，靜脈內施用的組合物通常是無菌等滲水性緩沖溶液。必要時，所述組 合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑以緩解注射部位疼痛。在通常情況下，成分在單位劑 型中單獨地或混合在一起提供，例如作為在密封容器中的凍干粉末或無水濃縮物，如標明 活性劑的量的安瓿或小袋中。當擬通過輸注施用所述組合物時，可以將其配制在含有無菌 藥用級水、生理鹽水或者右旋糖/水的輸注瓶中。當通過注射施用所述組合物時，可以使用 無菌注射用水或生理鹽水的安瓿，這樣可以在施用前將所述成分混合。
[0155] 在一些實施方式中，提供了組合物，包括作為藥物制劑提供的那些，所述組合物包 含液體運載體，例如但不限于水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、林格氏溶液、右旋糖溶液、含有 血清的溶液、Hank ' s溶液、其他水溶性生理平衡溶液、油、酯類和乙二醇。
[0156] 所提供的本申請所述的肽或其類似物或衍生物可以以中性或鹽的形式制劑。藥學 上可接受的鹽包括與游離的氨基基團形成的那些，如來源于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸 等的那些，和與游離的羧基基團形成的那些，如來源于鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三 乙胺、2-乙胺基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些。
[0157] 口服制劑
[0158] 在一些實施方式中，適宜的藥物組合物是口服制劑。可以預期，在本發明的范圍內 可以使用任意醫學上可接受的口服制劑。
[0159] 在一些實施方式中，提供了包括至少一種pH降低劑的組合物。可以預期，適用于本 發明一些實施方式的pH降低劑包括任意藥學上可接受的pH降低劑或pH降低劑的組合物，其 a)對胃腸道無毒性，b)能夠遞送氫離子或者能夠從局部環境誘導較高的氫離子含量和/或 c)能夠以一定的量口服施用，所述量足以將局部腸道pH降低至低于在此處發現的蛋白酶的 最適pH。可以使用不同檢測以確定一種pH降低劑是否適于本發明及其適當的用量。例如，當 將特定量的pH降低劑或pH降低劑的組合加入至10毫升0.1M碳酸氫鈉溶液使得該溶液的pH 降低至不高于5.5、4.7或3.5時，則該pH降低劑或pH降低劑的組合適于本發明。在一些實施 方式中，可以將某一量的pH降低劑加入10毫升0.1M碳酸氫鈉溶液中以降低pH，使其不高于 3·4、3·2、3·0或2.8〇
[0160] 在一些實施方式中，適宜的pH降低劑包括具有不高于4.2(例如不高于4.0、3.8、 3.6、3.4、3.2、3.0或2.8)的pKa的至少一種pH降低劑。適于本發明的示例性pH降低劑包括但 不限于羧酸，如乙酰水楊酸、乙酸、抗壞血酸、檸檬酸、富馬酸、葡糖醛酸、戊二酸、甘油酸、乙 醇酸、乙醛酸、異檸檬酸、異戊酸、乳酸、馬來酸、草酰乙酸、草酰琥珀酸、丙酸、丙酮酸、琥珀 酸、酒石酸和戊酸;氯化鋁;氯化鋅;氨基酸的鹽(或其衍生物)包括乙酰谷氨酸、丙氨酸、精 氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甜菜堿、肉毒堿、肌肽、瓜氨酸、肌酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、羥 基賴氨酸、羥脯氨酸、亞牛磺酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲基組氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、 苯丙氨酸、脯氨酸、肌氨酸、絲氨酸、牛磺酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸的鹽;某些磷 酸酯(包括1，6二磷酸果糖和1，6二磷酸葡萄糖)在某些實施方式中也可以是適宜pH降低劑。 在特定的實施方式中，將檸檬酸或酒石酸作為pH降低劑。
[0161]任意特定pH降低劑或pH降低劑的組合所需的量是可以改變的。典型地，可以使用 本領域公知的和本申請所述的多種檢測確定適宜的量(例如，在上文所述的10毫升0.1M碳 酸氫鈉溶液中進行pH降低檢測）。作為非限制性示例，在根據本發明的制劑中使用的pH降低 劑的適宜的量可以是或高于約 100mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、425mg、450mg、 475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、 77511^、80011^、82511^、85011^、87511^、90011^、92511^、95011^、97511^或1，00011^的量。在其他實施 方式中，所使用的檸檬酸的量可以超過1，〇〇〇mg。
[0162] 在一些實施方式中，可以將所使用的pH降低劑(例如檸檬酸或酒石酸）的適宜的量 測定為特定劑型總重量的百分率。作為非限制性示例，所使用的pH降低劑的適宜的量可以 是或大于固體劑型總重量的約10% (例如是或大于15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%)。
[0163] 在不同的實施方式中，本發明的組合物包括一種或多種吸收增強劑。如在本申請 中所使用的，吸收增強劑指增加其他成分在其釋放的水性或親脂性環境中的溶解度和/或 增強活性肽(例如根據式I的線形肽或環肽)穿過腸壁的攝取的試劑。在一些實施方式中，吸 收增強劑指作為溶解度增強劑和/或攝取增強劑。
[0164] 在一些實施方式中，吸收增強劑的混合物是可能的，其中一些提供增強的溶解度， 一些提供增強的攝取，還有一些提供這兩者。在給定的實施方式中具有不同數量的吸收增 強劑是可能的，包括但不限于：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種吸收增強劑。
[0165] 表面活性劑是具有溶解度增強劑和攝取增強劑兩種性質的有用的吸收增強劑的 示例。在一些實施方式中，當將表面活性劑作為吸收增強劑時，其可以是便于在生產過程中 混合和裝載膠囊的自由流動的粉末。在其他實施方式中，當將表面活性劑用于增加所提供 的肽的生物利用度時，所述表面活性劑可以選自下組：（a)陰離子表面活性劑，如膽固醇衍 生物(例如膽汁酸），（b)陽離子表面活性劑(例如酰基肉毒堿、磷脂等），（c)非離子表面活性 劑，和(d)陰離子表面活性劑和負電荷中和劑(negative charge neutralizers)的混合物， 及其組合。負電荷中和劑包括但不限于酰基肉毒堿、氯化十六烷基吡啶等。
[0166] 在一些實施方式中，酸性可溶性膽汁酸和陽離子表面活性劑可以共同用作吸收增 強劑。在一些實施方式中，酰基肉毒堿(如月桂酰基肉毒堿）、磷脂和膽汁酸可能是特別有效 的吸收增強劑。
[0167] 各種吸收增強劑適用于不同的實施方式中，下述示例性列出旨在說明本發明的一 些實施方式。不具有限制性的，一些適宜的吸收增強劑包括：（a)水楊酸鹽，如水楊酸鈉、3- 甲氧基水楊酸鹽、5-甲氧基水楊酸鹽和高香草酸鹽；（b)膽汁酸，如牛磺膽酸、牛磺去氧膽 酸、去氧膽酸、膽酸、glycholic、石膽酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、熊膽酸、去氫膽酸、夫西 地酸等；（c)非離子表面活性劑，如聚氧乙稀醚(例如Brij 36T、Brij 52、Brij 56、Brij 76、 Brij 96、Texaphor A6、Texaphor A14、Texaphor A60等）、p_t_辛基酸聚氧乙稀（TritonX- 45、Triton X_100、Triton X_114、Triton X-305)、壬基苯氧基聚氧乙稀（例如Igepal CO系 列）、聚氧乙烯山梨醇酯（例如吐溫-20、吐溫-80等）；（d)陰離子表面活性劑，如磺基丁二酸 鈉二辛酯；（e)溶血磷脂，如溶血卵磷脂和溶血磷脂酰乙醇胺；（f)酰基肉毒堿、酰基膽堿和 酰基氨基酸，如月桂酰基肉毒堿、肉豆蔻酰基肉毒堿、棕櫚酰基肉毒堿、月桂酰基膽堿、肉豆 蔻酰基膽堿、棕櫚酰基膽堿、十六烷基賴氨酸、N-酰基苯丙氨酸、N-酰基甘氨酸等；（g)水溶 性磷脂，如二庚酰基磷脂酰膽堿、二辛基磷脂酰膽堿等；（h)中鏈甘油酯，其是含有中鏈長度 的脂肪酸（辛酸、癸酸和月桂酸）的單、雙和三甘油酯的混合物；（i)乙二胺四乙酸；（j)陽離 子表面活性劑，如氯化十六烷基吡啶；（k)聚乙二醇的脂肪酸衍生物，如Labrasol、Labrafac 等;和（1)烷基糖類，如月桂酰基麥芽糖苷、月桂酰基蔗糖、肉豆蔻酰基蔗糖、棕櫚酰基蔗糖 等。
[0168] 在一些實施方式中，所述吸收增強劑將以相對于藥物組合物總重量(通常不計腸 溶包衣）以重量計的百分率的測定定量形式存在。以附加的非限制性示例的方式，在實施方 式中存在的吸收增強劑的量的范圍可以是以重量計從〇. 1 %至20% ;以重量計從0.5%至 20% ;以重量計從1.0%至20%、以重量計從2.0%至20%、以重量計從3.0%至20%、以重量 計從4.0%至20%、以重量計從5.0%至20%、以重量計從5.0%至15%、以重量計從5.0%至 14%、以重量計從5.0%至13%、以重量計從5.0%至12%、以重量計從5.0%至12%、以重量 計從5.0%至11 %、以重量計從5.0%至10%、以重量計從6.0%至10%、以重量計從7.0%至 10%、以重量計從8.0%至10%、以重量計從9.0%至10%、以重量計從5.0%至9.0%、以重 量計從5.0%至8.0%、以重量計從5.0%至7.0%和以重量計從5.0%至6.0%。
[0169] 在一些實施方式中，pH降低劑與吸收增強劑的重量比可以是約3:1、4:1、5 :1、6:1、 7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1 或者在任意 兩個前述示例性比例之間。在給定的藥物組合物中的全部pH降低劑的總重量和全部吸收增 強劑的總重量包括在前述示例性比例中。例如，如果藥物組合物包括兩種pH降低劑和三種 吸收增強劑，則將以兩種pH降低劑的總組合重量和全部三種吸收增強劑的總組合重量計算 前述比例。
[0170]在一些實施方式中，所述吸收增強劑在酸性pH下將是可溶的，如低于pH 5.5,和特 別地在pH 3.0和pH 5.0之間。
[0171] 在一些實施方式中，提供了包含一種或多種保護性載劑的組合物。如在本申請中 所使用的，保護性載劑指任意保護性組分和/或結構，如運載體、層、包衣或其他載劑，其保 護活性肽(例如根據式I的線形肽或環肽)免于受胃蛋白酶破壞。典型地，保護性載劑最終溶 解，以使得在特定劑型中的活性和其他成分可以釋放。保護性載劑的常見形式是腸溶包衣。 在一些實施方式中，在以100轉每分鐘旋轉所述組合物的溶出池中，適宜的腸溶性包衣可以 持續至少2小時阻止本發明的藥物組合物在0.1 N HC1中被破壞，然后當pH增加至6.3后能夠 允許所述藥物組合物在30分鐘以內完全釋放所有內容物。
[0172] 多種腸溶性包衣是本領域公知的并且在一個或多個實施方式中是有用的。腸溶性 包衣的非限制性示例包括乙酸纖維素鈦酸酯、羥丙基甲基乙基纖維素琥珀酸酯、羥丙基甲 基纖維素鈦酸酯、羧甲基乙基纖維素以及甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物。在一些實施 方式中，吸收增強劑(如溶解度和/或攝取增強劑）以及pH降低劑包括在足夠粘的保護性糖 漿中，以使得所述實施方式的組分能夠受保護地通過胃部。
[0173] 可以將適宜的腸溶性包衣應用于例如膠囊，在這之前所述膠囊中已裝載了本發明 的活性和其他成分。在其他實施方式中，將腸溶性包衣包覆在片劑外部或者包覆在活性成 分顆粒的外表面，然后再將其壓制成片劑，或者裝入膠囊。
[0174]在一些實施方式中，理想的可能是本發明的所有成分盡可能同時從運載體或載劑 中釋放并且溶解在腸道環境中。在一些實施方式中也可能優選的是載劑或運載體在小腸中 釋放活性成分，增加細胞間或細胞旁轉運的攝取增強劑在此處釋放較小可能引起不良副作 用(與如果相同的攝取增強劑在結腸中更晚釋放相比）。然而，應理解，本發明被認為在結腸 中與在小腸中同樣有效。除了上文中討論的以外，多種載劑或運載體是本領域公知的。
[0175] 在一些實施方式中，理想的可能是保持較低的腸溶性包衣量(特別是在優化如何 同時釋放本發明的組分的情況下）。在一些實施方式中，腸溶性包衣增加不超過藥物組合物 (如固體劑型)其余重量的30 % ( "其余"是藥物組合物不包括腸溶性包衣本身）。在其他實施 方式中，腸溶性包衣增加低于20%、低于19%、低于18%、低于17%、低于16%、低于15%、低 于14%、低于13%、低于12%、低于11 %或低于10%的重量。在一些實施方式中，保護性載劑 (如腸溶性包衣）構成或低于藥物組合物（例如固體劑型）總重量的約25%、24%、23%、 22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、 6%、5%的量。
[0176] 劑量
[0177] 在一些實施方式中，組合物以治療有效量和/或根據與特定所需結果(例如治療或 減輕疾病的風險)相關的劑量方案施用。
[0178] 根據本申請所述式I的任意肽（或者含有根據本申請所述式I的肽的組合物或藥 物)可以以任意適宜的途徑施用。在一些實施方式中，根據本申請所述式I的肽是皮下施用 的。如在本申請中所使用的，術語"皮下組織"被定義為緊貼皮膚下方的疏松、無規則的結締 組織層。例如，所述皮下施用可以通過將組合物注射進入包括但不限于大腿區、腹部、臀部 或肩胛區的區域進行。在一些實施方式中，根據本申請所述式I的肽靜脈內施用。在其他實 施方式中，根據本申請所述式I的肽通過直接向靶組織施用給藥，如心臟或肌肉（例如肌 內）、腫瘤(瘤內）、神經系統（例如直接注射至腦;腦室內；鞘內）。或者，根據本申請所述式I 的肽(或者含有如本申請所述肽的組合物或藥物)可以通過吸入、胃腸外、皮內、經皮或經粘 膜(例如口服或鼻內）施用。如有需要，可以同時使用多于一種的途徑。
[0179] 在一些實施方式中，根據本申請中式I的肽口服施用。在一些實施方式中，本發明 提供了用于口服施用的根據本申請所述式I的肽的固體劑型，包括(a)根據式I的肽、（b)至 少一種藥學上可接受的pH降低劑、（c)至少一種有效促進根據式I的肽的生物利用度的吸收 增強劑和(d)保護性載劑。在一些實施方式中，所述固體劑型是膠囊或片劑。用于制備口服 制劑的不同方法和成分是本領域公知的并且預計本領域技術人員將能夠確定這些方法和 成分中的哪些與本說明書中和/或2013年9月17日申請的PCT專利申請號PCT/US13/60139 (其公開的內容整體并入本申請）中描述的發明具有相容性。此類方法和成分也包括在本發 明的范圍內。
[0180] 在一些實施方式中，組合物以治療有效量和/或根據與特定所需結果(例如治療或 減輕疾病的風險)相關的劑量方案施用。
[0181] 根據本發明施用的特定劑量或量可以改變，例如根據預期結果的性質和/或程度， 特定的施用途徑和/或時間，和/或一個或多個特征(例如體重、年齡、個人病史、遺傳特征、 生活方式參數、心臟缺陷的嚴重程度和/或心臟缺陷的風險水平等或其組合）。此類劑量或 量可以由那些普通技術人員確定。在一些實施方式中，根據標準臨床技術確定適宜的劑量 或量。例如，在一些實施方式中，適宜的劑量或量是足以使一種或多種癥狀降低1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、100 %或更多的劑量或量。替代地或附加地，在一些實施方式中，通過使用一種或 多種體外或體內測定來輔助鑒定待施用的理想的或最佳的劑量范圍或量以確定適宜的劑 量或量。
[0182] 在不同實施方式中，根據式I的肽以治療有效量施用。如在本申請中所使用的，術 語"治療有效量"主要是根據在本發明的藥物組合物中所含的治療劑的總量確定的。在通常 情況下，治療有效量足以使對象獲得有意義的益處(例如治療、調節、治愈、預防和/或改善 潛在疾病或狀況）。在一些特定的實施方式中，待施用的適宜劑量或量可以由來自體外或動 物模型檢測系統的劑量應答曲線外推得到。
[0183] 根據式I的肽(包括衍生物、類似物和/或鹽)的治療有效劑量的量在不同實施方式 中可以以變化的量存在。在一些實施方式中，治療有效劑量可以是，例如約1-10，〇〇〇yg/kg、 約5-1，500yg/kg、約100-1，000yg/kg或50-500yg/kg。在一些實施方式中，所述治療有效劑 量可以是，例如約 lyg/kg、2 · 5yg/kg、5yg/kg、10yg/kg、20yg/kg、30yg/kg、40yg/kg、50yg/ kg、60yg/kg、70yg/kg、80yg/kg、90yg/kg、100yg/kg、150yg/kg、200yg/kg、250yg/kg、300yg/ kg、400yg/kg、500yg/kg、600yg/kg、700yg/kg、800yg/kg、900yg/kg、1000yg/kg或1500yg/ kg。特定個體的有效劑量可以隨著時間而改變(例如增加或減少），其取決于所述個體的需 求。在一些實施方式中，本申請所述的治療有效量在一個劑量中提供。在一些實施方式中， 本申請所述的治療有效量在一天提供。
[0184] 在其他實施方式中，治療有效劑量的量可以是，例如約0.001mg/kg體重至500mg/ kg體重，例如從約0 · 001mg/kg體重至400mg/kg體重、從約0 · 001mg/kg體重至300mg/kg體重、 從約0.00 lmg/kg體重至200mg/kg體重、從約0.001mg/kg體重至100mg/kg體重、從約 0 · 00 lmg/kg 體重至 90mg/kg 體重、從約0 · 00 lmg/kg 體重至 80mg/kg 體重、從約0 · 00 lmg/kg 體 重至70mg/kg體重、從約0.00 lmg/kg體重至60mg/kg體重、從約0.00 lmg/kg體重至50mg/kg體 重、從約Ο . 〇〇lmg/kg體重至40mg/kg體重、從約Ο . 001mg/kg體重至30mg/kg體重、從約 0.00 lmg/kg 體重至 25mg/kg 體重、從約0.00 lmg/kg 體重至 20mg/kg 體重、從約0.00 lmg/kg 體 重至15mg/kg體重、從約0.001mg/kg體重至10mg/kg體重D在一些實施方式中，本申請所述的 治療有效量在一個劑量中提供。在一些實施方式中，本申請所述的治療有效量在一天提供。
[0185] 在又一個實施方式中，治療有效劑量可以是，例如約0.001mg/kg體重至約lmg/kg 體重，例如從約0.00111^/1^體重至約0.911^/1^體重、從約0.00111^/1^體重至約0.811^/1^體 重、從約0.00111^/1^體重至約0.811^/1^體重、從約0.00111^/1^體重至約0.711^/1^體重、從約 0.00111^/1^體重至約0.611^/1^體重、從約0.00111^/1^體重至約0.511^/1^體重、從約0.0111^/ kg體重至約lmg/kg體重、從約0.0 lmg/kg體重至約0.9mg/kg體重、從約0.0 lmg/kg體重至約 0.8mg/kg體重、從約0.0111^/1^體重至約0.711^/1^體重、從約0.0111^/1^體重至約0.611^/1^ 體重、從約0. 〇lmg/kg體重至約0.5mg/kg體重、從約0.02mg/kg體重至約lmg/kg體重、從約 0.02mg/kg體重至約0.9mg/kg體重、從約0.02mg/kg體重至約0.8mg/kg體重、從約0.02mg/kg 體重至約0.7mg/kg體重、從約0.02mg/kg體重至約0.6mg/kg體重、從約0.02mg/kg體重至約 0.5mg/kg體重、從約0.03mg/kg體重至約lmg/kg體重、從約0.03mg/kg體重至約0.9mg/kg體 重、從約0.03mg/kg體重至約0.8mg/kg體重、從約0.03mg/kg體重至約0.7mg/kg體重、從約 0.03mg/kg體重至約0.6mg/kg體重、從約0.03mg/kg體重至約0.5mg/kg體重、從約0.04mg/kg 體重至約lmg/kg體重、從約0.04mg/kg體重至約0.9mg/kg體重、從約0.04mg/kg體重至約 0.8mg/kg體重、從約0.04mg/kg體重至約0.7mg/kg體重、從約0.04mg/kg體重至約0.6mg/kg 體重、從約0.04mg/kg體重至約0.5mg/kg體重、從約0.05mg/kg體重至約lmg/kg體重、從約 0.05mg/kg體重至約0.9mg/kg體重、從約0.05mg/kg體重至約0.8mg/kg體重、從約0.05mg/kg 體重至約0.7mg/kg體重、從約0.05mg/kg體重至約0.6mg/kg體重、從約0.05mg/kg體重至約 0.5mg/kg體重。在一些實施方式中，本申請所述的治療有效量在一個劑量中提供。在一些實 施方式中，本申請所述的治療有效量在一天提供。
[0186] 在又一個實施方式中，治療有效劑量可以是，例如約0.0001mg/kg體重至0.1mg/kg 體重，例如從約0. 〇〇〇lmg/kg體重至0.09mg/kg體重、從約0.0001mg/kg體重至0.08mg/kg體 重、從約0. 〇〇〇 lmg/kg體重至0.07mg/kg體重、從約0.000 lmg/kg體重至0.06mg/kg體重、從約 0.000111^/1^體重至0.0511^/1^體重、從約0.000111^/1^體重至約0.0411^/1^體重、從約 0 · 000 lmg/kg體重至0 · 03mg/kg體重、從約0 · 000 lmg/kg體重至0 · 02mg/kg體重、從約 0.000111^/1^體重至0.01911^/1^體重、從約0.000111^/1^體重至0.01811^/1^體重、從約 0.0001mg/kg體重至0.017mg/kg體重、從約0.0001mg/kg體重至0.016mg/kg體重、從約 0.0001mg/kg體重至0.015mg/kg體重、從約0.0001mg/kg體重至0.014mg/kg體重、從約 0.0001mg/kg體重至0.013mg/kg體重、從約0.0001mg/kg體重至0.012mg/kg體重、從約 0 · 000 lmg/kg體重至0 · 01 lmg/kg體重、從約0 · 000 lmg/kg體重至0 · 0lmg/kg體重、從約 0.000111^/1^體重至0.00911^/1^體重、從約0.000111^/1^體重至0.00811^/1^體重、從約 0.000111^/1^體重至0.00711^/1^體重、從約0.000111^/1^體重至0.00611^/1^體重、從約 0.000111^/1^體重至0.00511^/1^體重、從約0.000111^/1^體重至0.00411^/1^體重、從約 0.000111^/1^體重至0.00311^/1^體重、從約0.000111^/1^體重至0.00211^/1^體重。在一些實 施方式中，所述治療有效劑量可以是〇.〇〇〇lmg/kg體重、0.0002mg/kg體重、0.0003mg/kg體 重、Ο · 0004mg/kg 體重、Ο · 0005mg/kg 體重、Ο · 0006mg/kg 體重、Ο · 0007mg/kg 體重、Ο · 0008mg/ kg 體重、Ο · 0009mg/kg 體重、Ο · 00 lmg/kg 體重、Ο · 002mg/kg 體重、Ο · 003mg/kg 體重、Ο · 004mg/ kg 體重、Ο · 005mg/kg 體重、Ο · 006mg/kg 體重、Ο · 007mg/kg 體重、Ο · 008mg/kg 體重、Ο · 009mg/kg 體重、Ο · Olmg/kg 體重、Ο · 02mg/kg 體重、Ο · 03mg/kg 體重、Ο · 04mg/kg 體重、Ο · 05mg/kg 體重、 Ο · 06mg/kg體重、Ο · 07mg/kg體重、Ο · 08mg/kg體重、Ο · 09mg/kg體重或Ο · lmg/kg體重。特定個 體的有效劑量可以隨著時間而改變(例如增加或減少），其取決于所述個體的需求。在一些 實施方式中，本申請所述的治療有效量在一個劑量中提供。在一些實施方式中，本申請所述 的治療有效量在一天提供。
[0187] 在一些實施方式中，根據式I的肽以范圍從約l-l，000yg/kg/天(例如范圍從約1- 900yg/kg/天、l_800yg/kg/天、l_700yg/kg/天、l_600yg/kg/天、l_500yg/kg/天、l_400yg/ kg/天、l_300yg/kg/天、l-200yg/kg/天、l-100yg/kg/天、l-90yg/kg/天、l-80yg/kg/天、1- 70yg/kg/天、l-60yg/kg/天、l-50yg/kg/天、l-40yg/kg/天、l-30yg/kg/天、l-20yg/kg/天、 l-10yg/kg/天)的有效劑量施用。在一些實施方式中，根據式I的肽以范圍從約l-500yg/kg/ 天的有效劑量施用。在一些實施方式中，根據式I的肽以范圍從約50-500yg/kg/天的有效劑 量施用。在一些實施方式中，根據式I的肽以范圍從約l-l〇〇yg/kg/天的有效劑量施用。在一 些實施方式中，根據式I的肽以范圍從約l-6〇yg/kg/天的有效劑量施用。在一些實施方式 中，根據式I的肽以選自下述的有效劑量施用：約1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或1，000yg/kg/天。特定個體的有效劑量可以隨著時間而改變(例如增加或減少），其取決于 所述個體的需求。在一些實施方式中，本申請所述的治療有效量在一個劑量中提供。在一些 實施方式中，本申請所述的治療有效量在一天提供。
[0188] 在一些實施方式中，根據式I的肽以范圍從約l-l，000pg/kg/天(例如范圍從約1- 900pg/kg/天、l-800pg/kg/天、l-700pg/kg/天、l-600pg/kg/天、l-500pg/kg/天、l-400pg/ kg/天、l_300pg/kg/天、l-200pg/kg/天、l-100pg/kg/天、l-90pg/kg/天、l-80pg/kg/天、1- 70pg/kg/天、l-60pg/kg/天、l-50pg/kg/天、l-40pg/kg/天、l-30pg/kg/天、l-20pg/kg/天、 l-10pg/kg/天)的有效劑量施用。在一些實施方式中，血管緊張素（1-7)肽以范圍從約1-60μ g/kg/天的有效劑量施用。在一些實施方式中，血管緊張素（1-7)肽以選自下述的有效劑量 施用：約1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、 450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1，00(^8/1^/天。特定個體的有效劑量 可以隨著時間而改變(例如增加或減少），其取決于所述個體的需求。在一些實施方式中，本 申請所述的治療有效量在一個劑量中提供。在一些實施方式中，本申請所述的治療有效量 在一天提供。
[0189] 在一些實施方式中，所提供的組合物以藥物制劑的形式提供。在一些實施方式中， 藥物制劑是或包括用于根據與實現降低疾病的發生或風險相關的劑量方案施用的單位劑 量的量。
[0190] 在一些實施方式中，包含根據本申請所述式I的肽的制劑以單劑量施用。在一些實 施方式中，包含根據本申請所述式I的肽的制劑以規律間隔施用。如在本申請中所使用的， 以"間隔"施用表示治療有效量周期性地施用（區別于一次性劑量）。所述間隔可以通過標準 臨床技術確定。在一些實施方式中，包含根據本申請所述式I的肽的制劑每兩個月、每個月、 每月兩次、每三周、每兩周、每周、每周兩次、每周三次、每日、每日兩次或每六小時施用。單 一個體的施用間隔不需要是固定的間隔，而是可以隨著時間而改變，其取決于所述個體的 需求。
[0191] 如在本申請中所使用的，術語"每兩個月"指每兩個月施用一次（即每兩個月一 次）；術語"每月"指每個月施用一次；術語"每三周"指每三周施用一次（即每三周一次）；術 語"每兩周"指每兩周施用一次（即每兩周一次）；術語"每周"指每周施用一次；和術語"每 日"指每天施用一次。
[0192] 在一些實施方式中，包含根據本申請所述式I的肽的制劑以規律的間隔無限期施 用。在一些實施方式中，包含根據本申請所述式I的肽的制劑以規律的間隔在限定的時間段 施用。在一些實施方式中，包含根據本申請所述式I的肽的制劑以規律的間隔施用5年、4年、 3年、2年、1年、11個月、10個月、9個月、8個月、7個月、6個月、5個月、4個月、3個月、2個月、1個 月、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天。
[0193] 試劑盒
[0194] 本發明還提供了試劑盒或其他生產制品，其包含含有相同的根據式I的肽，并提供 了將其重構（若為凍干的）和/或使用的說明書。試劑盒或其他生產制品可包括容器、注射 器、小瓶和任意其他在給藥(如皮下、口服、吸入）中使用的物品、裝置或設備。適當的容器包 括如瓶子、小瓶、注射器(如預裝注射器）、安瓿、套筒、儲液器或二室注射器。這些容器可以 由多種材質(例如玻璃或塑料)形成。在一些實施方式中，容器是預裝注射器。適當的預裝注 射器包括但不限于帶有烤硅酮涂層的硼硅酸鹽玻璃注射器、帶有噴涂硅酮的硼硅酸鹽玻璃 注射器或不帶有硅酮的塑料樹脂注射器。
[0195] 通常，容器可以包含制劑和在容器上或與容器關聯的標簽，所述標簽可以說明重 構和/或使用的方法。例如，標簽可說明將制劑重構成上述濃度。標簽可以進一步說明制劑 用作或旨在用作如皮下給藥。在一些實施方式中，容器可以包括含有根據式I的肽的穩定制 劑的單一劑量。在各種實施方式中，穩定制劑的單一劑量的體積少于約15ml、10ml、5.0ml、 4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml、1.5ml、1.0ml或0.5ml。或者，包含制劑的容器可以為多 次使用瓶，允許進行制劑的重復給藥(如2至6次給藥）。試劑盒或其他生產制品還可包括含 有適當稀釋劑(如BWFI、鹽水、緩沖鹽水）的第二容器。在混合稀釋劑和制劑時，在重構制劑 中的最終蛋白濃度一般為至少lmg/ml (如至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少 30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml)。試劑盒或其他生產制 品還可包括從商業和用戶角度出發所需要的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、濾器、針 頭、注射器和帶有使用說明的說明書。在一些實施方式中，試劑盒和其他生產制品可包括進 行自行給藥的說明。
[0196] 通過參考下述實施例將能夠更加充分地理解本發明。但是，不應將其解釋為限制 本發明的范圍。所有文獻引文均通過引用并入。
[0197] 用途
[0198] 在一些實施方式中，所提供的肽可以用于治療一種或多種疾病、病癥或狀況。在一 些實施方式中，本發明提供了治療疾病、狀況或病癥的方法，所述方法包括：向需要其的對 象施用根據式I的肽或包含一種或多種此類肽的組合物。在一些實施方式中，根據式I的一 種或多種肽以有效劑量并以一定的施用間隔周期性地施用，以使得疾病、病癥或狀況的至 少一種癥狀或特征的強度、嚴重程度、持續時間或頻率降低或發病推遲。 實施例
[0199] 實施例1--體外BDNF生產的刺激
[0200]本實施例顯示了施用血管緊張素（1-7)肽使得在多種細胞類型中BDNF生產增加。
[0201] 細胞培養條件
[0202] 刺激前，使用無菌PBS洗滌細胞兩次，然后給予相應的無血清細胞培養基。在無血 清培養基中培育細胞1小時并且隨后刺激24小時。對于劑量應答測定，使用范圍為1 0-14Μ至 10-6Μ的肽。對于所有其他實驗，使用濃度為10-7Μ的肽，使用濃度為10-6Μ的異丙腎上腺素和 弗司扣林。為了在24小時時間段內維持物質濃度，在12小時后將其再次加入培養基。刺激 后，在細胞培養基中確定BDNF的濃度。直接使用樣品或者將其保存在-80 °C。
[0203]測定條件
[0204] 為了確定BDNF的濃度，使用來自Promega的BDNFEmax ?的免疫測定系統。首先，在 4 °C下使用抗BDNF將96孔板包被過夜。次日，使用TBST洗板并使用封閉緩沖液在室溫下培育 1小時。隨后，使用TBST再次洗板并在各孔中加入100μΙ樣品。在室溫下將板在搖床（~ 400rpm)上培育2小時并且隨后使用TBST洗滌5次。向各孔中加入100μΙ pAb抗人BDNF，并且 在連續振蕩條件下在室溫下再次培育該板2小時。隨后，使用TBST洗板5次，每孔加入100μΙ 抗-IgY-HRP偶聯物并在室溫下振蕩培育1小時。然后，使用TBST洗板5次并在室溫下在搖床 上使用TMB One溶液培育10min。使用1M鹽酸終止反應并立即在450nm處測定吸光度。從標準 曲線確定BDNF的濃度。
[0205]所檢測的每個血管緊張素（1-7)肽均能夠刺激BDNF的顯著表達。如圖1和5所示，在 劑量低至lx 10-8Μ時給予Ang(l-7)能夠在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和人真皮微血管內皮 細胞(HDMEC)中刺激顯著的BDNF表達。
[0206] 如圖2中所示，在劑量低至lx 10-nM時Pancyte能夠在HUVEC中刺激顯著的BDNF表 達。有趣的是，BDNF表達的最大刺激出現在Pancy t e的劑量為1X 1 0-1 ^與1X 1 0-9Μ之間。圖6 顯示了在劑量低至lx 10-ηΜ時Pancyte能夠在HDMEC中刺激BDNF表達并且表達的最強刺激 出現在lx 10-ηΜ與lx 10-9Μ之間。
[0207] ΤΧΑ301也能夠在HUVEC和HDMEC中刺激顯著的BDNF表達。圖3和7顯示了劑量低至lx 10 一 nM的TXA301能夠刺激顯著水平的BDNF表達，并且有趣的是，高于1x10-11 100,000倍的劑 量能夠在HUVEC和HDMEC中得到統計學上相似水平的表達。
[0208] 還考察了 Ang(l-7)、Pancyte和TXA301對在完全(含有血清)培養基中的HUVEC的作 用。此外，使用弗司扣林和異丙腎上腺素作為陽性對照。如圖4所示，即使在含血清的培養基 中，Pancy t e仍能夠刺激BDNF到對照水平之上。
[0209]圖 8 顯示了圖 1、2、3、5和6 中的數據以及在 HUVEC 中 AlaLArgLVaP-TyP-Ile5- His6-Pro7(SEQIDN0:17)和Ala1-Arg 2-Val3-Ser4-Ile5-His6-Cys 7(SEQIDN0:18)的劑量響 應的復合圖。如圖8所示，與所有其他經測試的肽相比，lx 10_nM至lx 劑量的Ala1- Arg2-Val3-Ser4-Ile5-His 6-Cys7(SEQIDN0:18)以及lxl0-12M至lxl0-11M劑量的Ala 1-Arg2- Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro 7(SEQ ID勵：17)能夠刺激非常高的即陬表達。
[0210] 實施例2--體外cAMP生產的刺激
[0211] 在使用Alal-Arg2-Val3-Ser4-Ile 5-His6-Cys7(SEQIDN0:l8)刺激前，使用PBS洗 滌HUVEC細胞兩次，然后在無血清培養基中培育1小時。在這個實施例中，為了產生劑量響應 曲線，所述肽的濃度范圍為lx 10-13-1χ 10-6Μ。刺激15分鐘后，除去含有肽的培養基并裂解 細胞(0.1Μ HCl，0.1%Triton Χ-100)。收集澄清的裂解物，使用25μ1確定蛋白濃度(Pierce BCA蛋白測定試劑盒，Thermo Scientific，Rockford,USA)并將剩余部分保存在-80°C用于 進行隨后的分析。
[0212] 使用3丨8111&41(14(^(3七丄〇1^8，10，1^4)的〇41^酶免疫測定試劑盒確定細胞裂解 物中的cAMP濃度。簡言之，使用50μ1中和試劑中和96孔板（山羊抗家兔I gG預包被)的孔。接 下來，加入1 〇〇μ1乙酰化的環AMP標準品或細胞裂解物，隨后加入50μ1藍色cAMP堿性磷酸酶 偶聯物和50μ1黃色EIA家兔抗cAMP抗體。然后在室溫下將板在搖床（~500rpm)上培育2小 時。接下來，對孔進行抽吸并使用洗滌緩沖液（1:10,在去離子水中的含有去垢劑和疊氮鈉 的Tris緩沖鹽)洗滌3次。最后一次洗滌后，將板在干凈的紙巾上拍打以除去任何殘留的洗 滌緩沖液。向各孔中加入200μ1 p-硝基苯磷酸鹽底物溶液，并將板在室溫下培育1小時。通 過加入50μ1終止溶液終止酶促反應，并立即在405nm處測定吸光度。使用GraphPad Prism 5.0軟件從非線性標準曲線確定cAMP濃度。針對總蛋白濃度對最終的cAMP濃度進行校正。 [0213] 如圖9所示，施用劑量低至lx 10-nM的根據SEQ ID N0:18的肽引起了cAMP的顯著 增加，在該實施例中在約lx 10-9Μ觀察到了最大值。
[0214] 實施例3 中風后的感覺運動功能恢復
[0215] 在這個實施例中，使用公認的暫時性腦中動脈阻塞(tMCAO)中風大鼠模型評估某 些所提供的肽在體內治療和/或改善中風的一種或多種感覺運動功能癥狀的能力。在這個 實施例中還評估了所提供的肽對血流和血管直徑的作用。如下文所述，施用所提供的肽(包 括TXA302(SEQ ID N0:18))在中風后的感覺運動功能和血管結構兩方面產生了令人吃驚的 顯著改善。
[0216] 根據美國國立衛生研究院(NIH)和實驗動物飼養評估認證協會(AAALAC)的指導原 則進行動物處理。將動物飼養在尺寸為35X30 X 15cm的聚乙烯籠（5只/籠）中，其具有便于 塑料瓶中的顆粒飼料和飲用水的不銹鋼上柵格;使用蒸汽滅菌的潔凈稻殼(Harlan，Sani- chip cat#:2018SC+F)作為墊料并且墊料與籠一起每周至少更換兩次。在這個實施例中，共 使用60只大鼠并且在研究開始時每只大鼠的體重為約300克。
[0217] 動物通過自由采食喂養市售嚙齒動物飼料(Teklad Certified Global 18%蛋白 飼料cat#: 106S8216)。動物自由飲用來自按照PharmaSeed ' s SOP No. 214(水系統）的市政 供應的酸化飲用水(pH 2.5至3.5)。動物飼養在標準實驗室條件中，裝有空調并有足量的經 過濾(HEPA F6/6)的新鮮空氣供應(最少換氣15次/小時）。將動物保持在氣候受控的環境 中。將動物保持在溫度范圍約20-24°C、相對濕度范圍30-70 %和12小時明暗交替循環。在動 物抵達后對其進行檢驗并且每日檢查發病和死亡的任何征兆。對在瀕死狀態下的動物和表 現出嚴重疼痛和持久存在極度痛苦跡象(如呼吸困難、側臥、抽搐、癱瘓或不能夠到食物或 水)的動物進行人道處置。
[0218]對于本實施例的目的而言，將暫時性腦中動脈阻塞(tMCAO)程序日定義為在這項 研究中的"第1天"。在手術當天，在70%N20和30%02的混合物中使用4%異氟烷誘導麻醉并 使用1.5-2 %的異氟烷維持。
[0219] 根據R.Schmid-Elsaesser等，A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-doppler flowmetry(局 灶性腦缺血栓線法模型關鍵的重新評估:通過激光多普勒血流儀確定的在大鼠中意外過早 灌注和蛛網膜下腔出血的證據），Stroke ,1998,29(10) :2162-2170所述的方法進行tMCAO程 序。簡言之，通過中線頸部切口暴露右側CCA(頸總動脈)并且仔細地將其與周圍的神經和筋 膜剝離一一從其分叉處至顱底。然后分離ECA(頸外動脈)的枕動脈分支，并將這些分支切去 并凝固。沿著舌末端和上頌動脈分支進一步遠側切去并凝固ECA，然后將其分離。分離ICA (頸內動脈）并將其與鄰近的迷走神經仔細分離，并且在靠近其源頭處使用5-0尼龍縫線 (SMI，Belgium)結扎翼腭動脈。接下來，將4-0絲質縫線松散地綁繞在鼓起的ECA殘端，并將 4cm長的4-0單絲尼龍縫線(使用火焰將縫線尖端修平，并且在插入前使用聚賴氨酸涂覆縫 線)通過近端ECA插入ICA并由此進入韋利斯氏環，以有效地阻塞MCA。閉合手術傷口并將動 物送回籠中使其從麻醉中恢復。阻塞一個半小時以后將大鼠再次麻醉，將單絲抽出使其再 灌注，閉合手術傷口并將大鼠送回籠中。
[0220] 再灌注24小時后利用經修訂的神經評定量表(mNRS)對動物進行評分。在這項研究 中僅包括總分2 10的動物。根據第2天時的mNRS結果，將動物分配至檢測組，以使得組間具 有相似的大鼠行為分布。從第2天手術后24小時開始，通過皮下（SC)施用，給予每只動物50μ g/kgTXA301(SEQIDN0:20)或TXA302(SEQIDN0:18)之一或者在PBS中為25mg/ml。組別 分配見表1:
[0221 ] 表1 一組別分配 [0222]
[0223] 前肢放置測試(在手術前和在第15、22、29、36、43和50天進行）
[0224] 肢體放置測試分為前肢和后肢測試。對于前肢放置測試而言，檢查者抓住大鼠接 近桌面并且將大鼠前肢置于桌面上以評估大鼠對胡須、視覺、觸覺或本體感受刺激響應的 能力。類似地，對于后肢放置測試而言，檢查者將大鼠后肢置于桌面上以評估大鼠對觸覺或 本體感受刺激響應的能力。每個感覺輸入模式獲得單獨的子分數并且相加以給出總分(對 于前肢放置測試:〇 =正常、12 =最大損傷;對于后肢放置測試:0 =正常、6 =最大損傷）。以 0.5分為增量按照如下所示給出評分:胡須放置(0-2)，視覺放置-前面(0-2)、-側面(0-2); 觸覺放置-背面(0-2)、-側面(0-2);本體感覺放置(0-2);總計0-12。
[0225] 圖10顯示與載劑對照動物相比施用ΤΧΑ302第15天(最早測定的時間點）得到顯著 行為改善。而施用ΤΧΑ301在第15天時得到改善的趨勢，但是該組直到第22天才取得具有統 計學意義的顯著效果。值得注意的是，與載劑對照動物相比第50天時ΤΧΑ302組的評分改善 超過7點（~78 % )。通過比較，在相同時間段ΤΧΑ301組的評分改善4點（~44% )。
[0226] 踏步測試(在手術前和在第15、22、29、36、43和50天進行）
[0227] 在踏步測試中對動物前肢的運動失能情況進行測試。使用一只手固定住動物的后 肢握住動物并且另一只手不監控前肢，同時使未束縛的前爪觸及桌子。在兩個前肢正手和 反手方向上，計數經校正的步的數量，與此同時動物沿著桌子表面側移(在約5秒內85cm)。
[0228] 如圖11所示，與載劑對照動物相比，給予TXA301或TXA302的大鼠早在第15天時就 顯示具有統計學意義的顯著效果。該具有統計學意義的顯著效果保持了整個研究期間。
[0229] 身體擺動測試(在手術前和在第15、22、29、36、43和50天進行）
[0230] 在距離其尾根部約1英寸的位置握住大鼠。然后將其提升至桌子表面上1英寸的位 置。將大鼠保持在垂直軸內，所述垂直軸的定義為左側或右側不超過10°。當大鼠將其頭部 移出任意一側的垂直軸時記錄為一次擺動。在嘗試進行另一次擺動之前，大鼠必須返回垂 直位置以便下次擺動可計數。共計數20次擺動。正常大鼠通常在兩側具有相同數量的擺動。 在局灶性缺血以后，大鼠趨向于向健側擺動(在本實施例中為左側）。身體擺動評分以右側 占總擺動次數的百分率表示。
[0231] 圖12顯示了與載劑對照動物相比施用TXA302第15天(在本研究中評估的最早時間 點)得到具有統計學意義的顯著行為改善。在TXA302組中大鼠的這種行為改善保持了整個 研究的其余時間。直至第22天開始，施用TXA301也得到了具有統計學意義的顯著行為改善。
[0232] mNRS評估(在手術前和在第2、15、22、29、36、43和50天進行）
[0233] 由不知道所給予的藥物/劑量的個體進行經修訂的神經評定量表評分(mNRS)(盲 測）mNRS可以使用0至18可能的點作為尺度進行神經評分。與評分較低的大鼠相比，具有較 高評分的動物顯示出更加嚴重的癥狀和殘疾。
[0234] 如圖13所示，與載劑對照動物相比，給予TXA301或TXA302的大鼠早在第15天時在 行為上就顯示出顯著的改善。這些改善保持了整個研究期間。
[0235] 腦血流和血管直徑檢測(第50天）
[0236] 使用Flow-R激光多普勒系統進行大腦皮層中的血流和血管收縮評估，其中對顱內 血流和血管直徑(收縮/舒張)進行監測。在中風后第50天進行多普勒程序并且在動物處于 異氟烷麻醉下進行。
[0237] 圖14顯示了第50天時在給予50yg/kg TXA301或TXA302的大鼠中觀察到了血流比 和血管直徑的具有統計學意義的顯著改善。令人吃驚的是，不僅與載劑對照而且與給予 TXA301的大鼠相比，給予TXA302的大鼠顯示出顯著改善的血流和增加的血管直徑。
[0238] 除了其他以外，本實施例顯示了根據若干公知的和可接受的感覺功能測試的檢測 以及血流和血管直徑評估可知施用所提供的肽特別是TXA302(SEQ ID N0:18)使得中風的 恢復改善。
[0239] 等同方式和范圍
[0240] 本領域的技術人員將能夠理解，或能夠使用不超出常規實驗的方法來確定，本申 請所描述的特定實施方式的多種等同方式。本發明的范圍并不旨在限于上述說明書，而是 如所附的權利要求書中所示。
【主權項】
1. 一種肽，所述肽包含如式I所示的氨基酸序列： Ala^Xaa^Xaa^Ser^Xaa^Xaa^Cys^SEQ ID N0:1) 其中 Xaa2選自Arg、Lys、Ala、Cit(瓜氨酸）、Orn(鳥氨酸）、乙酰化的Ser、Sar、D-Arg和D_Lys; 父&&3選自\%1、八1&、1^11、犯6、116、617、1^8、？1'〇、八;[13(2-氨基異丁酸）、八〇。(3(1-氨基環戊 烷基羧酸)和Tyr; Xaa5 選自 Ala、Leu、norLeu、Va]^PGlyjPI Xaa6選自Hi s、Arg和6-NH2-Phe (6-胺基苯丙氨酸）。2. 權利要求1所述的肽，其中所述肽含有7至25個氨基酸，包括端點。3. 權利要求1所述的肽，其中所述肽含有一個或多個化學修飾以增加蛋白酶抗性、血清 穩定性和/或生物利用度。4. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權利要求1所述的肽和藥學上可接受的載 體。5. 權利要求4所述的藥物組合物，其中將所述藥物組合物制成用于口服、肌內、靜脈內、 皮下、局部、透皮、直腸、陰道、肺、鼻內、頰內或舌下施用。6. 權利要求4所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物還包含一種或多種選自下述的 藥學上可接受的賦形劑:聚合物載體、崩解劑、潤滑劑、溶劑或膨脹劑。7. 權利要求4-6中任意一項所述的藥物組合物，其中將所述藥物組合物制成片劑、丸 劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、噴霧劑、氣溶膠、脂質體組合物、軟膏、栓劑、植入劑、膏劑或緩 釋制劑。8. -種治療疾病、狀況或病癥的方法，所述方法包括： 向需要其的對象施用根據權利要求1-7中的任意一項所述的肽或組合物。 9 · 一種肽，所述肽包含氨基酸序列Alai-ArgLVaP-Ser4-〗le5-His6-Cys 7(SEQ ID NO: 18)〇10. 權利要求9所述的肽，其中所述肽含有一個或多個化學修飾以增加蛋白酶抗性、血 清穩定性和/或生物利用度。11. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權利要求9所述的肽和藥學上可接受的載 體。12. 權利要求11所述的藥物組合物，其中將所述藥物組合物制成用于口服、肌內、靜脈 內、皮下、局部、透皮、直腸、陰道、肺、鼻內、頰內或舌下施用。13. 權利要求11所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物還包含一種或多種選自下述 的藥學上可接受的賦形劑:聚合物載體、崩解劑、潤滑劑、溶劑或膨脹劑。14. 權利要求11-13中任意一項所述的藥物組合物，其中將所述藥物組合物制成片劑、 丸劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、噴霧劑、氣溶膠、脂質體組合物、軟膏、栓劑、植入劑、膏劑或 緩釋制劑。15. -種治療疾病、狀況或病癥的方法，所述方法包括： 向需要其的對象施用權利要求9-14中任意一項所述的肽或組合物。16·肽Ala1-Arg2-Val3-Ser4-Ile 5-His6-Cys7(SEQIDN0:18)在治療人中的用途。17.權利要求15所述的方法，其中所述疾病、狀況或病癥是中風。18.權利要求17所述的方法，其中所述肽或組合物包含具有氨基酸序列Ala^Arg2-Val3-Ser 4-Ile5-His6-Cys7(SEQIDN0:18W^ic。
【文檔編號】A61K38/08GK105828831SQ201480066852
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年10月1日
【發明人】R·弗蘭克林
【申請人】塔瑞克斯制藥有限公司