氧化元素，砸通過抗氧化物消除細胞培養過程中 產生的自由基，減少和延緩脂褐素的形成，W達到抗細胞衰老和調亡的目的；另外，砸作為 谷脫甘膚過氧化物酶的成分，能催化還原型谷脫甘膚為氧化型谷脫甘膚，保護細胞的生物 膜結構和功能的完整性，并保護細胞膜功能及預防細胞壞死和突變。
[0038] 青霉素能夠阻礙細菌的細胞壁合成，導致細胞泄漏死亡，從而抑制細菌的生長;而 鏈霉素能夠作用于細菌的核糖體，阻礙蛋白翻譯，從而抑制細菌生長；自然環境下，不考慮 人為產生的抗藥性，對青霉素不敏感的絕大多數微生物對鏈霉素敏感，反之亦然；因此，最 為優選地是將青霉素和鏈霉素搭配使用能夠控制幾乎全部常見的細菌，從而能夠盡量避免 細菌對脂肪干細胞的生長及活性造成的不良影響。
[0039] EGF能夠促進細胞的遷移、黏附、增殖和存活，且EGF可W誘導脂肪干細胞的增殖、 遷移，且不影響其分化潛能，對損傷組織具有修復和保護功能。LIF能夠促進細胞生長、增殖 與分化，在細胞培養基中添加一定量的LIF可W取代滋養層細胞，維持脂肪干細胞的增殖， 提高細胞增殖速率和長期增殖能力，并使得脂肪干細胞能夠保持不分化狀態。
[0040] 進一步地，異體皮基質的獲取過程為：
[0041 ] Sl 1B、取健康豬腹部或背部皮進行脫脂脫毛處理，去掉0.2~0.6mm的表皮，制成厚 度為0.2~0.4mm的真皮層皮片，清洗后消毒20~40分鐘，反復清洗，于消化液中消化2~4 天，反復清洗皮片，然后加入非離子型表面活性劑解育2~4天，至細胞成分完全去除，獲得 脫細胞真皮，然后分別用氯化鋼溶液和PBS緩沖液反復沖洗，W充分降低皮基質的抗原性； 其中，氯化鋼的質量分數為5~9%，用氯化鋼溶液沖洗處理時間為8~16小時，每隔6小時換 液;PBS沖洗處理8~16小時，每隔6小時換液，即獲得異體皮基質。
[0042] 其中，優選地，消化液中包含有質量百分數為0.10~0.40 %膜蛋白酶、0.01~ 0.03 %乙二酸乙二胺和0.01~0.03 %氨氧化鋼；非離子型表面活性劑為（0.4~0.6) % TritonX-IOO 溶液。
[0043] 步驟2中，優選地，本發明所采用的水凝膠是由海藻酸鹽和明膠溶液混合制成的。 海藻酸鹽和明膠均是天然生物材料，具有價格低廉、安全可靠及生物相容性良好等優勢;但 海藻酸鹽本身的降解速率緩慢，其水凝膠降解方式不可控，降解產物因分子量過高難W排 出；而明膠常溫下易凝膠的性質，可控性差，因此，在本發明中采用海藻酸鹽和明膠共價交 聯形成水凝膠，不僅具有良好的生物相容性，降解產物分子量較小，而且具有較強的吸濕性 和使用安全性，用于制作皮膚貼片與皮膚創傷部位貼合度較好，有利于創傷部位與水凝膠 中負載的脂肪干細胞共同作用，W達到修復皮膚的目的；同時，由海藻酸鹽和明膠制成的水 凝膠能夠阻隔細菌，使傷口保持一個潮濕的環境，能夠延長貼片的使用時間，減少貼片的更 換次數，一方面可降低修復皮膚的成本，另一方面更換貼片時不與傷口粘連從而能夠保護 新生皮膚組織，減少病人在更換貼片時的痛苦。
[0044] 本發明中，海藻酸鹽-明膠水凝膠的制備過程為：
[0045] S21A、取海藻酸鹽溶于抑= 7.0~7.7的PBS溶液中，待海藻酸鹽完全溶解后，恒溫 放置0.2~0.8小時，制備濃度為20~80mg/ml的海藻酸鹽溶液；
[0046] S22A、取明膠溶于去離子水中，置于45~55°C，待明膠充分溶解后，恒溫放置0.2~ 0.8小時，制備濃度為20~80mg/ml的明膠溶液；
[0047] S23A、將步驟S21A中獲得的海藻酸鹽溶液和步驟S22A中獲得的明膠溶液混合，充 分攬拌，恒溫放置至溶液凝膠化，即獲得海藻酸鹽-明膠水凝膠。
[0048] 其中，優選地，海藻酸鹽為海藻酸鋼，當然也可W是海藻酸巧等。
[0049] 進一步地，在接種脂肪干細胞之前，需對異體皮基質進行殺菌處理，W進一步降低 異體皮基質的抗原性，具體過程為：
[0050] 無菌環境下，取步驟SllB中獲得的異體皮基質裝入無菌侶錐膜中，抽真空封口，用 鉆60福照霉菌3~5小時即可；其中，福照劑量為3~化Gy, W不改變異體皮基質的理化性質 為宜。
[0051] 另外，在接種脂肪干細胞之前，還需在無菌環境中，將殺菌后的異體皮基質鋪平， 且異體皮基質上皮面朝上，具體可將異體皮基質固定平鋪在略小于異體皮基質面積的玻璃 平板上，或平鋪與細胞培養皿內，多余的異體皮基質內折，使異體皮基質的接種面處于平整 狀態，然后再接種脂肪干細胞，并且在接種脂肪干細胞之后，異體皮基質需始終保持平整狀 態W使負載有脂肪干細胞的水凝膠均勻分布于異體皮基質上，避免脂肪干細胞堆積，影響 其細胞活性及正常生長。
[0052] 步驟S2的具體過程為：
[0053] 取步驟S13A中所獲得的脂肪干細胞進行細胞計數，W密度(2~8) X IO5個/ml與步 驟S23A中獲得的海藻酸鹽-明膠水凝膠充分混合；
[0054] 然后，在殺菌處理后的異體皮基質上鋪入含有脂肪干細胞的海藻酸鹽-明膠水凝 膠，優選地，水凝膠的高度為1~3mm。
[0055] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，W下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用W解釋本發明，并不用于限 定本發明。
[0化6] 實施例1
[0057]本發明提供的一種用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片，其制備方法包括W下步驟：
[0化引 Sla、患者選擇；
[0059] 燒傷病人入選標準：n~虹度燒傷創面患者，并排除W下患者：
[0060] 懷孕哺乳期婦女;對治療中所用生物制劑過敏者；重度吸入性損傷及其他重要臟 器損傷，如:肝腎功能損傷、煩腦損傷等;嚴重基礎性疾病如:糖尿病、高血壓、腫瘤或慢性臟 器損害等;阻礙簽署及理解知情同意者。
[0061 ] S2a、治療前，對病人進行檢查評估；
[0062] 評估標準：檢驗血常規(WB03.0 X 10*9/L、LO15 % ; Hb〉80g/L; PLT〉60 X 10*9/L)、 肝腎功能、乙肝=系(表面抗原陰性）、丙肝抗體陰性、艾滋抗體陰性、梅毒抗體陰性。
[0063] S3a、脂肪干細胞的獲取；
[0064] S31a、采集脂肪組織；
[0065] 選擇步驟S2a中達到評估標準的病人，在無菌條件下用抽脂機抽取病人腹部、臀 部、大腿等脂肪含量豐富部位的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分，用PBS 清洗脂肪組織3次，放入含有雙抗(青霉素/鏈霉素，各為1%含量)的緩沖液中，無菌環境于4 °c條件下保存備用。
[0066] S32a、獲取原代脂肪干細胞；
[0067] 取步驟S31a中獲得的脂肪組織，于無菌條件下剪碎后，加入0.075%1型膠原酶，37 °C恒溫并WSOrpm振速振蕩搖床消化40分鐘，然后加入等量體積的完全培養基（高糖DMEM+ 8%胎牛血清+1 %雙抗）中止消化；然后，將消化液置于冰浴中，用吸管吹打15次后加入 lOmg/L的DnaseI (脫氧核糖核酸酶I)解育15分鐘，經100微米濾網過濾，去除未消化的脂肪 組織和結締組織，4°C環境下、10(K)rpm離屯、10分鐘，成熟脂肪細胞在表層油滴下方、培養基 上方，去除上層油滴，將漂浮的脂肪細胞轉移至新的離屯、管中，加入PBS清洗，4°C環境中 100化pm離屯、10分鐘，重復此離屯、過程數次，即獲得原代脂肪干細胞。
[0068] S33a、脂肪干細胞純化；
[0069] 將步驟S32a中獲得的原代脂肪干細胞用1 %的鹽水洗涂2~3次W除去污染的紅細 胞，用完全培養基重懸，接種于多聚鳥氨酸包被的培養板，培養4小時，移去上清液，用 0.25%的膜酶消化，去除難W消化的成纖維細胞、內皮細胞等，獲得純化后的原代脂肪干細 胞。
[0070] S34a、脂肪干細胞的傳代培養；
[0071] 取步驟S33a中獲取的原代脂肪干細胞，Wl X IO5個/cm2的密度接種于DMEM培養基 中進行原代培養，在37°C、5%的C〇2培養箱中，每隔2-3天更換新鮮的培養基，待細胞融合度 達到70%-80%后，采用1 X化ypLESelect(膜蛋白酶無酪紅，來源于美國Invihogen公司） 于37°C消化3分鐘，加入等體積的PBS稀釋，反復吹打，將細胞清洗干凈，然后將清洗后的細 胞移入50血離屯、管中，W1000-200化pm轉速離屯、5min，棄上清液，將細胞重懸于新的DMEM培 養基，按照1:4的傳代比例，傳代接種于新的細胞培養袋中，采用DMM培養基進行培養第一 代脂肪干細胞，擴增過程每隔2-3天更換新鮮DMEM培養基，待細胞融合度達到70 % -80 %后， 如此重復上述的細胞消化傳代過程，待第S代細胞融合度達到70 %-80 %后，停止傳代培 養，用于制作貼片。其中，DMEM培養基中添加有5%人血清、lOng/ml的ITS(膜島素、轉鐵蛋 白、砸），lOOU/ml的鏈霉素和青霉素，20ng/ml的EGF化Pidermal Growth Factor，表皮生長 因子），10ng/ml的LIFQeukemia inhibitory factor,白血病抑制因子）。
[0072] S4a、異體皮基質的制備；
[0073] 將健康豬的整張腹部與背部皮用機械法進行初步脫脂，用綴子把毛剔除干凈，用 電動取皮機先將豬皮的皮下組織去掉，再去掉表皮0.4mm，制成厚度為0.3mm的真皮層皮片， 經生理鹽水洗凈后浸入濃度為0.1 %的醫用新潔爾滅溶液中消毒，30分鐘后取出，用無菌生 理鹽水反復沖洗10次;然后將皮片剪成IcmX Icm大小，PBS液沖洗兩遍，浸泡于裝有0.25% 膜蛋白酶、0.02 %乙二酸乙二胺巧DTA)及0.02 %氨氧化鋼混合消化溶液的玻璃瓶內，4 °C下 消化3d，每天晃動5次左右。4天后取出皮