用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及組織工程領域，特別設及一種用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片及其制備 方法。
【背景技術】
[0002] 皮膚是人體與外界環境接觸的屏障，不僅起保護、分泌、代謝和感覺等作用，而且 參與免疫反應和維持機體內環境的穩定。作為人體最表露的皮膚，其受損傷及大面積燙燒 傷意外的發生率較高。早期的燒傷創面覆蓋可W抑制細菌生長、預防感染、防止水分及電解 質的丟失；自體皮膚移植是治療燒傷的首選，但是對于大面積燒傷，自體皮膚不能滿足需 求，且療程周期較長，治療過程中，皮膚創口易出現感染;而異體皮基質膚則會引起明顯的 免疫排斥反應;而移植人造皮膚，皮下的分泌物易形成水瘤，進而對人造皮膚造成損傷，且 人造皮膚較昂貴，制作工藝較復雜。因此，截至目前，嚴重創傷和大面積燒傷患者的皮源缺 乏仍然是臨床亟待解決的難題。
[0003] 目前，組織工程化皮膚的研究已成為生命科學研究領域的熱點之一，而市場上也 已出現用于臨床的組織工程皮膚產品，雖有一定的臨床效果，但不僅價格昂貴，技術操作繁 瑣，有一定的技術難度且成本造價較高。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術中采用異體皮基質修復皮膚燒傷創 口易引起免疫排斥反應且療效效率低等缺陷，提供一種能夠避免免疫排斥反應且修復效果 較好的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片及其制備方法。
[0005] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:提供一種用于修復皮膚燒傷的皮膚 貼片的制備方法，包括W下步驟：
[0006] 分別獲取脂肪干細胞和異體皮基質；
[0007] 將所述脂肪干細胞與水凝膠混合后接種于所述異體皮基質；
[000引其中，所述脂肪干細胞來源于皮膚燒傷患者自體；
[0009] 所述水凝膠是由海藻酸鹽溶液和明膠溶液混合制成的。
[0010] 在本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片的制備方法中，所述海藻酸鹽的濃 度為20~80mg/ml，所述明膠濃度為20~80mg/ml。
[0011] 在本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片的制備方法中，所述水凝膠的制備 過程，包括W下步驟：
[001 ^ 取海藻酸鹽于PBS溶液中，待海藻酸鹽完全溶解后，恒溫放置0.2~0.8小時，即獲 得所述海藻酸鹽溶液;取明膠溶于去離子水中，置于45~55°C，待明膠充分溶解后，恒溫放 置0.2~0.8小時，即獲得所述明膠溶液;將所述海藻酸鹽溶液和明膠溶液混合，攬拌，恒溫 放置至溶液凝膠化。
[0013]在本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片的制備方法中，所述海藻酸鹽為海 藻酸鋼或海藻酸巧。
[0014] 在本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片的制備方法中，所述脂肪干細胞的 濃度為(2~8) X IO5個/ml。
[0015] 在本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片的制備方法中，所述脂肪干細胞為 第2~4代中任一代脂肪干細胞。
[0016] 在本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片的制備方法中，所述異體皮基質的 獲取過程，包括W下步驟：
[0017] 取健康豬腹部或背部皮進行脫脂脫毛處理，去掉0.2~0.6mm的表皮，制成厚度為 0.2~0.4mm的真皮層皮片，清洗后消毒20~40分鐘，反復清洗，于消化液中消化2~4天，反 復清洗皮片，然后加入非離子型表面活性劑解育2~4天，至細胞成分完全去除，獲得脫細胞 真皮，然后分別用氯化鋼和PBS反復沖洗，即獲得異體皮基質。
[0018] 在本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片的制備方法中，所述消化液中包含 有質量百分數為0.10~0.40%膜蛋白酶、0.01~0.03%乙二酸乙二胺和0.01~0.03%氨氧 化鋼。
[0019] 在本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片的制備方法中，將所述脂肪干細胞 和水凝膠接種于所述異體皮基質之前，還包括采用福照對所述異體皮基質進行殺菌處理的 步驟。
[0020] 本發明還提供一種用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片，由上述用于修復皮膚燒傷的皮 膚貼片制備方法所獲得的。
[0021] 實施本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片及其制備方法，可W達到W下有 益效果:通過利用脂肪干細胞的分化潛能，W及異體皮基質的刺激誘導作用，促使脂肪干細 胞分化成表皮細胞;而由于脂肪干細胞來源于燒傷患者自體，因此其抗原性較低，不易引起 免疫排斥反應，從而提高皮膚修復效果，達到快速修復皮膚創傷的目的；除此之外，將脂肪 干細胞負載于海藻酸鹽-明膠水凝膠中，不僅能夠阻隔細菌，使得脂肪干細胞和皮膚傷口保 持一個潮濕環境，提供一個良好的修復環境，而且能夠避免更換貼片時，貼片與傷口粘連從 而保護新生皮膚組織，不僅實現快速修復皮膚的目的，而且能夠減輕患者痛苦，不易造成創 傷部位色素累積形成瘤痕等。
【具體實施方式】
[0022] 為解決現有技術中通過異體皮基質修復燒傷皮膚存在易引起免疫排斥反應且修 復效率低等缺陷，本發明的創新點在于提供一種負載有皮膚燒傷患者自體脂肪干細胞的皮 膚貼片及其制備方法，通過采用自體脂肪干細胞結合異體皮基質，W降低因異體皮基質引 起的免疫排斥反應，從而降低皮膚貼片的抗原性，提高皮膚修復效率。
[0023] 具體地，本發明提供的用于修復皮膚燒傷的皮膚貼片，其制備方法包括W下步驟：
[0024] Sl、分別獲取脂肪干細胞和異體皮基質；
[0025] 其中，脂肪干細胞來源于皮膚燒傷患者自體，W降低免疫排斥反應;異體皮基質為 經脫細胞處理后的皮膚基質，可W是同種異體皮基質（即除皮膚燒傷患者W外的人類皮基 質），也可W是異種異體皮基質(如豬、牛等動物皮基質）；
[00%] S2、將脂肪干細胞與水凝膠混合后接種于異體皮基質上即可；
[0027] 異體皮基質不僅用來作為修復燒傷皮膚的貼片，而且其中保留了原有組織結構中 的不可溶成分，主要包括膠原、彈性蛋白、氨基葡聚糖和結構蛋白等，為細胞生長和皮膚創 傷修復提供了營養基礎能夠為脂肪干細胞提供生長所需營養物質及促使脂肪干細胞分化 成表皮細胞的細胞因子，使得脂肪干細胞能夠維持其細胞活性，并能夠分化成表皮細胞;而 由于脂肪干細胞來源于燒傷皮膚患者本體，因此其抗原性相對較弱，能夠避免異體皮基質 直接接觸皮膚燒傷部分所引起的免疫排斥反應，W此提高修復皮膚效率的目的。水凝膠是 一類能夠吸收并保有大量水分的具有交聯網絡結構的聚合物，具有=維孔隙結構，儲存有 豐富的水環境，具有良好的生物相容性，能夠為脂肪干細胞提供附著生長空間，擴大脂肪干 細胞與水分的接觸面積，W提高脂肪干細胞的細胞活性。因此，將水凝膠與脂肪干細胞混合 后接種于異體皮基質上，能夠保證脂肪干細胞的細胞活性，并對脂肪干細胞提供一定的固 化作用，有利于貼片的穩定性。
[0028] 進一步地，步驟Sl中，本發明優先采用第2~4代中任一代脂肪干細胞，脂肪干細胞 的獲取過程，包括W下步驟：
[0029] S11A、原代脂肪干細胞的獲取；
[0030] 無菌條件下，取所述皮膚燒傷患者的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖 維部分，經PBS溶液清洗后，剪碎，酶解振蕩消化20~60分鐘，用完全培養基中止消化，再置 于冰浴中吹打消化10~20分鐘，過濾，去除未消化的脂肪組織和結締組織后，對濾液進行離 屯、，去除上層油滴，取下層脂肪細胞，PBS清洗后，即獲得原代脂肪干細胞；
[0031] 其中，優選地，完全培養基為含有（5~10) %胎牛血清和(0.5~2) %雙抗的高糖 DMHM培養基。
[0032] S12A、對步驟SllA中獲取的原代脂肪干細胞進行純化；
[0033] 洗涂步驟Sl IA中獲取的原代脂肪干細胞，去除紅細胞，用完全培養基重懸，然后接 種于多聚鳥氨酸包被的培養板上，培養2~6小時，移去上清液后膜酶消化，去除未消化的成 纖維細胞和內皮細胞，即獲得純化后的原代脂肪干細胞。
[0034] S13A、對純化后的原代脂肪干細胞進行傳代培養；
[0035] 取步驟S12A中純化后的原代脂肪干細胞進行細胞計數，W(0.5~2) X IO5個/ml的 密度接種于DMEM培養基中進行原代培養，每隔2-3天更換新的DMEM培養基，待細胞融合度達 到70~80%后，膜酶消化2~4分鐘，加入等體積的PBS溶液或生理鹽水稀釋，反復吹打清洗， 然后離屯、棄上清液，用DMEM培養基重懸細胞后，按1: (3~5)的傳代比例進行培養，采用DMEM 培養基進行擴增培養第一代脂肪干細胞，擴增過程中每隔2~3天更換新鮮的DMBl培養基， 待細胞融合度達到70~80%后，如此重復上述細胞消化傳代步驟，完成第2~4代脂肪干細 胞的傳代和擴增培養。在本發明中，優選地，將原代脂肪干細胞接種于細胞培養袋中進行傳 代培養，便于后期接種涂覆于異體皮基質上；同時在原代脂肪干細胞培養過程中，通過輕微 晃動細胞培養袋更有利于原代脂肪干細胞充分接觸培養基，W提高脂肪干細胞活性。
[0036] 其中，DMBl培養基中添加有2~5%人血清、5~15ng/ml的ITS(其主要成份為膜島 素、轉鐵蛋白和砸）、50~150U/ml的鏈霉素、50~150U/ml青霉素、5~35ng/ml的EGF (Epidermal Growth Factor，表皮生長因子）和5~15ng/ml的LIFQeukemia inhibitory factor,白血病抑制因子）。
[0037] 其中，ITS中的膜島素，能夠降低蛋白質降解，增加氨基酸和葡萄糖的攝入，為細胞 生長和分化提供能量，促使脂肪干細胞處于低糖環境，保持細胞活性，有利于脂肪干細胞向 表皮細胞分化；同時，能夠促進細胞利用葡萄糖和蛋白質，促進RNA、蛋白質和脂肪酸的合 成，抑制細胞調亡，是非常重要的細胞存活因子。轉鐵蛋白能夠干預脂肪干細胞內的離子代 謝，促進脂肪干細胞的生成。而砸是強力抗