多肽Cbf-14抗真菌感染的醫藥用圖
【技術領域】：
[0001] 本發明設及生物醫藥領域，具體設及一種SEQ ID No:l氨基酸序列的多膚的用途， 即多膚Cbf-14具有抗真菌感染作用的用途。
【背景技術】：
[0002] 真菌感染性疾病是由致病性真菌新型隱球菌、霉菌、酵母菌及癖菌等在接觸到一 個有利條件時引起的淺表或深部感染，常見于高危人群，包括骨髓和實體器官移植、廣譜抗 生素治療、腫瘤和免疫抑制治療、插管等侵襲性治療W及AIDS患者。真菌感染性疾病如皮膚 癖病、真菌性腸炎、肺炎、腦膜炎等發病率雖稍低于細菌性感染，但多因病癥頑固、危害性 大、治療周期長、不易完全根除等特點給臨床治療帶來很大困難。
[0003] 現有抗真菌藥物主要分為多締類及非締類抗生素、挫類、締丙胺類、5-氣胞喀晚和 芬凈類等，因對腎臟、腎上腺有較大毒性反應，除少數可內服外多為局部用藥，單一用藥效 果差，且真菌耐藥性逐日增加。因此，研制高效低毒的新型抗真菌藥物對臨床用藥具有重要 意義。
[0004] 抗菌膚是一類廣泛存在于生物體內，具有多種生物學功能的小膚類物質，是生物 體固有免疫系統的重要組成部分，具有廣譜抗菌性，特別是對耐藥性微生物有強殺菌作用。 抗菌膚一般由15~45個氨基酸組成，其結構多數具有兩親性，熱穩定性高，均帶有正電荷。 目前研究已知其主要通過靜電作用被吸附到帶負電荷的細菌細胞質膜表面，使兩側膜電位 升高，從而在膜上形成離子通道，膜結構因此遭到破壞，細胞內外滲透壓失衡，胞內水溶性 物質大量滲出，最終導致細菌死亡。此作用機理獨特，不易使細菌對其產生耐藥性，并且由 于其低免疫原性、高選擇性、對正常細胞沒有任何破壞作用、易于被人體分解排除等特性， 因此被視為近年來發現的具有替代傳統抗生素潛質的重要物質。除此之外，研究證實多膚 還具有抗真菌、原蟲、病毒、腫瘤細胞W及促進傷口愈合等免疫調節類生物學活性，顯示出 其在醫學上良好、廣闊的應用前景。
[0005] 發明人在前期的研究中，基于多膚設計原理，由化thelicidin家族抗菌多膚采用 生物信息學技術設計并篩選出的高活性小分子O-螺旋膚，利用固相化學合成法獲得多膚 Cbf-14,具有SEQ ID No:l所示的氨基酸序列，由14個氨基酸組成，帶7個正電荷，分子量為 1819.33，等電點為12.31。其全序列為:精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨酸-鄉氨酸。具有抗耐藥性病原菌 感染功效，特別是具有抗超級耐藥細菌的功效。該技術記載于中國專利申請 CN2012101719018中。后續研究結果在CN201310053960X公開了多膚Cbf-14具有抗腫瘤的作 用，特別是抗肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌或惡性黑色素瘤的作用。
【發明內容】
[0006] 本發明公開了氨基酸序列如SEQ ID:N0.1所示的多膚具有抗真菌感染的功效，特 別是具有抗白色念珠菌和新型隱球菌的功效。可用于制備抗真菌感染的藥物。
[0007] 藥效學實驗表明，多膚化f-14具有明顯的抑制或殺滅白色念珠菌和新型隱球菌的 作用，可作為抗真菌候選藥物。
[0008] 下面是本發明的部分藥效學實驗及結果。
[0009] 一、多膚Cbf-14對白色念珠菌和新型隱球菌的體外抑制作用
[0010] (1)菌液的制備
[0011] 將實驗用真菌從甘油管中接至沙氏葡萄糖瓊脂斜面，30°C培養，取白色念珠菌24h 培養物，新型隱球菌4她培養物，挑取5個菌落懸浮于5mL無菌生理鹽水中，在縱滿振蕩器上 振蕩15秒混勻，并調節菌懸液至1 X IO6~5 X 106CFU/mL。再用RPMI 1640培養基作1:50稀釋， 再進行1:20稀釋W制成菌液濃度為1 X IO3~5 X IO3C即/mL的試驗濃度，當與等量藥物混合 后，菌液的最終濃度為0.5 X 1〇3~2.5 X l〇3cFU/mL。
[0012] (2)藥液的配置
[0013] 分別精確稱取一定量的多膚化f-14和咪康挫配置成濃度為1024iig/mL的藥物膽存 液，0.22皿膜無菌過濾除菌，分裝，置-70°C保藏備用。
[0014] (3)最小抑菌濃度(MIC)的測定
[0015] 用RPMI 1640培養基分別將各藥物膽存液倍比稀釋成濃度為512、256、128、64、32、 16、8、4、2、1、0.5、0.25iig/mL的藥液。取一次性無菌、U形孔底的96孔板，從低濃度到高濃度 加入10化L藥液(2倍終濃度)于反應板的各排;加入I(K)化含1 X IO3~5 X IO3CFlVmL的菌液； 同時設立生長對照孔(加有I(K)化菌液和不含藥物的10化L RPMI 1640培養液）d30°C解育 4她（白色念珠菌），72h(新型隱球菌）。觀察抗菌效果，并記錄MIC值。重復試驗3次，結果見表 1：
[0016] 表1多膚Cbf-14和咪康挫對白色念珠菌和新型隱球菌臨床株及標準株的MIC
[0018]由藥敏試驗結果表1可看出白色念珠菌和新型隱球菌對多膚饑f-14敏感性較強， 其MIC值較低，表明多膚化f-14對運兩種真菌有著明顯的抑菌作用，特別是對新型隱球菌的 MIC值低至4~16iig/mL，由此可得出多膚饑f-14具有研制成為替代現用抗真菌藥物的良好 潛質。
[0019] (4)最小殺菌濃度(MFC)的測定
[0020] 依次將上述未見真菌生長的各管培養物分別吸取0.1 mL加到無菌平皿中，傾注適 量溫度不超過45°C烙化的沙氏葡萄糖瓊脂培養基混勻，置30°C再培養2地計數，平皿上菌落 小于5個的最小稀釋度的藥物濃度即為最低殺菌濃度MFC。重復試驗3次，結果見表2:
[0021] 表2多膚Cbf-14和咪康挫對白色念珠菌和新型隱球菌臨床株及標準株的MFC
[0023] 由表2可得出與表1類似的結論，多膚化f-14對于白色念珠菌和新型隱球菌具有明 顯的殺菌作用。新型隱球菌多由呼吸道侵入，在肺部引起炎癥，當機體免疫功能下降時可向 全身播散，主要侵犯中樞神經系統，發生腦膜炎、腦炎、腦肉芽腫等，病情嚴重，療程長，預后 差，病死率高。兩性霉素B是目前對抗此病菌藥效最強的抗真菌藥物，但因其不良反應多且 嚴重，在臨床應用中有較多局限性，由新型隱球菌引起的感染仍是臨床上的一個嚴峻問題。 白色念珠菌為最主要的真菌致病菌，多引起皮膚及粘膜性感染，其臨床上的主要用藥為氣 康挫，但該藥雖具有明顯的抑菌作用，卻缺乏殺菌活性，因此其用藥后復發性較高。表2數據 顯示多膚化f-14對于不同來源的白色念珠菌和新型隱球菌均有良好的殺菌活性，且其新穎 的作用機制不易使病菌對其產生耐藥、并且幾乎無毒副作用。因此，我們可初步將多膚化f-14擬為一種良好的新型抗真菌替代候選藥物。
[0024] (5)多膚化f-14和咪康挫對白色念珠菌和新型隱球菌臨床株及標準株殺菌曲線的 繪制
[002引分別將4 XMI切農度的多膚Cbf-14和咪康挫藥液，與制備好的約1 X IO6C即/mL的菌 懸液混合，使其終濃度為IO5CFlVmL左右。放置于30°C靜置培養，分別于0、0.5、1、2、4、8、12、 16和24h時，吸取一定量培養物系列稀釋，并進行平皿活菌計數，每個稀釋度做=個平行實 驗，取平均值。W真菌濃度對數為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制殺菌曲線。結果見圖1、2、 3、4。
[00%]從圖1、2、3和圖4中發現多膚化f-14作用于細胞化時使真菌細胞數下降50%左右， 在4h或化對真菌基本殺滅完全，對白色念珠菌和新型隱球菌作用效果類似，且作用效果強 于對照藥物咪康挫。由此表明多膚饑f-14對于此兩種真菌殺菌作用較強，并且在較短時間 內完成，因此進一步顯示出多膚化f-14可作為良好的新型抗真菌替代候選藥物的潛質和可 行性。
[0027]二、多膚Cbf-14對新型隱球菌細胞膜結構的影響
[00%]采用透射電鏡的方法觀察多膚化f-14對新型隱球菌細胞膜的影響。將新型隱球菌 培養至對數期，加入終濃度為4倍MIC的多膚化f-14解育地，解育結束后離屯、洗涂S次，沉淀 重懸于ImL 2.5 %戊二醒固定，4°C過夜。棄掉固定液，用PBS緩沖液洗涂2次。1 % 0S04固定，4 °C化。用0.1 M憐酸漂洗液漂洗15minS次，1 %餓酸固定液固定2-化。再次漂洗。然后用乙醇 梯度脫水。分別為：50%乙醇15-20min，70%乙醇15-20min，90%乙醇15-20min，90%乙醇： 90 % 丙酬（1:1) 15-20min，90 % 丙酬 15-20min，低溫 4°C 進行，100 % 丙酬室溫 15-20minS 次。 然后進行包埋，用純丙酬和包埋液進行包埋，包埋后進行固定，分別在37°C烘箱過夜，45°C 烘箱12h，60°C烘箱2地。然后用巧M-IOll切片機切片，最后加入醋酸軸-構祿酸鉛雙染色。透 射電鏡觀察，拍片。鑒定真菌細胞膜的變化。圖5為多膚化f-14作用于新型隱球菌后其細胞 形態的變化。
[0029] 從圖5中我們可W發現多膚化f-14對新型隱球菌細胞膜的破壞現象非常明顯。對 照組細胞結構完整，形態正常，細胞圓潤且邊緣光滑；多膚化f-14試驗組作用比之后細胞膜 上有明顯破裂形成，大量細胞內含物流出；作用化之后新型隱球菌細胞明顯皺縮，不能維持 正常的細胞形態。通過透射電鏡圖我們可W準確判斷出多膚化f-14對于新型隱球菌主要作 用在細胞膜上，且對于真菌有很好的殺菌活性。
【附圖說明】
[0030] 圖1是多膚Cbf-14對白色念珠菌ATCC10231的殺菌曲線圖。
[0031] 圖2是多膚Cbf-14對白色念珠菌臨床株1#的殺菌曲線圖。
[0032] 圖3是多膚Cbf-14對新型隱球菌ATCC4902的殺菌曲線圖。
[0033] 圖4是多膚Cbf-14對新型隱球菌臨床株3#的殺菌曲線圖。
[0034] 圖5是多膚Cbf-14對新型隱球菌ATCC4902的透射電鏡圖。 序刻表 <110>中國藥科大學；南京映海月生物科技有限公司 < 120〉多狀Cbf-14抗真菌感染的醫藥用途 <130> 2012 <160> 1
[00；35] <170> Patent In V姊.si城么 3 <210> 1 <211> 14： <212> PRT <213〉人工序列 <4〇0> 1 Arg Leu Leu Ar 搜 Lys Ph巧 Phe Ar 搜 Lys Leu Lys Lys Ser ￥al 1 5 IQ
【主權項】
1. 氨基酸序列如SEQ ID:N0:1所示的多肽用于制備預防和/或治療真菌感染性疾病的 藥物的用途。2. 權利要求1的用途，其中真菌感染性疾病是白色念珠菌引起的陰道炎或口腔炎。3. 權利要求1的用途，其中真菌感染性疾病是新型隱球菌引起的肺炎或腦膜炎。
【專利摘要】本發明涉及生物藥物領域，具體涉及一種多肽Cbf-14在抗真菌感染中的應用。多肽Cbf-14來源于Cathelicidin家族抗菌多肽的部分活性氨基酸位點突變序列，其氨基酸序列為RLLRKFFRKLKKSV。本發明公開了多肽Cbf-14在體外對真菌生長的抑制及殺滅作用。研究結果顯示真菌對多肽Cbf-14具有強敏感性，其MIC值較低，并且多肽Cbf-14能夠在較短時間內起到殺滅效果。機理研究表明多肽Cbf-14主要作用于真菌的細胞膜，造成膜孔道，使細胞內容物大量滲出，從而導致真菌細胞的死亡。因此多肽Cbf-14具有制備預防和/或治療真菌感染性疾病的藥物的用途。
【IPC分類】A61P31/10, A61P11/00, A61K38/10, A61P15/02, A61P25/00, A61P1/02
【公開號】CN105497872
【申請號】CN201510981388
【發明人】周長林, 韓小容, 余昌仲, 馬菱蔓, 竇潔, 賈源賓
【申請人】中國藥科大學, 南京映海月生物科技有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月23日