用于抗腫瘤的人參總皂苷提取物與絲裂霉素c聯合用藥方案的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及天然藥物領域，具體涉及人參總皂苷提取物增強絲裂霉素C、順鉑的抗腫瘤的應用。
【背景技術】
[0002]在中國，人參歷來被視為百草之王，其主要的活性成分有幾十種人參皂苷，其中抗腫瘤成分有Rh2、Rhl、Rg3和Rg5等，具有增強機體免疫力和快速恢復體質的作用。但是大多數的抗腫瘤機制不明。
[0003]絲裂霉素C是從頭狀鏈霉菌培養液中分離提取的一種廣譜抗腫瘤抗生素，對多種癌癥有抗癌作用，其作用原理可使細胞的DNA解聚，同時阻礙DNA的復制，從而抑制腫瘤細胞分裂。但治療指數不高，毒性較大。
[0004]CN105287611A公開了人參皂苷Rh2通過抑制Treg細胞，從而改善人體內T細胞的平衡，進一步加強自身免疫功能，從而達到抗腫瘤或改善免疫缺陷性疾病的效果，而人參皂苷Rh2是將生曬參加工成紅參時，由于某些原人參二醇組人參皂苷受熱分解，配基上糖鏈斷裂降解產生的次皂苷，在人參總皂苷提取物中并不存在;CN105017369A公開了一種熱裂解人參皂苷組合物的制備方法及在制備抗腫瘤藥物中的應用，主要是對人參皂苷Rgl進行高溫熱裂解，得到熱裂解皂苷組合物，該組合物主要包括人參皂苷20(S)-Rhl，20(R)-Rhl，人參皂苷Rk3和Rh4，經實驗研究表明，該熱裂解人參皂苷組合物對H22移植瘤小鼠具有明顯抑瘤作用，而我們的給藥方案中不存在藥物高溫熱裂解;CN104814972A公開了一種含有人參皂苷的藥物組合物，按重量百分含量包括活性成分人參皂苷Rg320%?70%、人參皂苷Rh210%?40%、三七皂苷ftl 20%?50%，同時還提供了組合物在預防和治療癌癥及抗癌輔助藥物及提高機體免疫力的藥品或保健品中的應用；CN104800297A公開了包含姜黃素、人參皂苷Rg3和虎杖皂苷的藥物組合，對腫瘤有預防和治療作用，對化療有藥有增效、減毒作用；上述兩種給藥方案中Rg3的含量很高，而Rg3在我們的人參總皂苷提取物中的含量約為0.003%，所以給藥方案相差甚遠;CN103961385A公開了人參提取物和抗腫瘤藥物成分5-氟尿嘧啶l:l，增強抗腫瘤成分的療效，并減少抗腫瘤成分治療造成的副作用，該藥物組合物特別針對治療胃癌疾病;我們的發現是人參總皂苷提取物和抗腫瘤藥物成分絲裂霉素C、順鉑聯用具有協同抗腫瘤的藥效，該藥效特別針對治療非小細胞肺癌和肝癌。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是闡明人參總皂苷提取物與絲裂霉素C、順鉑聯合給藥協同抗非小細胞肺癌的藥效。其中人參總皂苷提取物經LC-MS分析鑒定的主要成分為Rbl 11.2%，Rb211.1% ,Re 10.5% ,Rd 7.7% ,Re 8.9% ,Rf 0.9% ,Rgl 3.3% ,Rg2 1.4% ,and Rhl0.2%ο
[0006]CCK_8、Hoechst染色及TUNEL實驗結果顯示，人參總皂苷提取物和絲裂霉素C、順鉑的聯合給藥能夠協同誘導非小細胞肺癌A549細胞以及肝癌細胞株HepG2細胞的死亡。同時我們在A549裸鼠移植瘤模型上驗證了人參總皂苷提取物和絲裂霉素C聯用的協同抗腫瘤藥效。
【附圖說明】
[0007]圖1:人參總皂苷提取物協同增敏絲裂霉素C和順鉑的抗腫瘤藥效；
[0008]圖2:H0eChst染色顯示聯用能協同促進癌細胞細胞核碎裂(細胞凋亡)；
[0009]圖3:TUNELstaining流式細胞凋亡檢測顯示聯用具有強協同抗腫瘤作用；
[0010]圖4:人參總皂苷提取物能協同增敏絲裂霉素C對肝癌細胞株的毒性；
[0011]圖5:人參總皂苷提取物與絲裂霉素C聯合給藥協同抗腫瘤的裸鼠藥效。
【具體實施方式】
[0012]實驗材料:
[0013]人非小細胞肺癌細胞株A549細胞、人肝癌細胞株HepG2細胞購自ATCC，于37°C，5 %CO2條件下常規培養，培養基分別為含10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的RPM1-1640(6丨1^0)和01^]?培養基；胎牛血清卬83)購于取(310116(1^8311，1^311，1]34);胰蛋白酶(Trypsin)購于Amersco(Solon，Oh1，USA);青霉素、鏈霉素、均購于南京生興生物工程公司(江蘇)；Caspase3、Cleaved Caspase3、Caspase7、Cleaved Caspase7、PARP、Cleaved PARP、GAPDH抗體購自Cell Signaling;RIPA細胞裂解液、Hoechst 33342染色液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所;CCK8試劑盒購自日本同仁化學，FITC-AV-PI Kit購于BDPharmingen公司(USA) Jude裸鼠購自于上海斯萊克實驗動物有限公司。
[0014]實施例1.CCK-8實驗
[0015]實驗方法:
[0016]A549細胞接種于96孔細胞培養板中，待細胞密度達到80%時，給予一系列劑量的人參總皂苷提取物、絲裂霉素C以及聯合給藥組，處理48h后，小心吸棄培養基，每孔加入10ul含1ul CCK-8溶液的無酚紅1640培養基，37°C搖床，350rpm，30min后取出置于酶標儀(測定波長450nm，參比波長630nm)中測定其吸光度。給藥組細胞存活率用以下公式計算:
[0017]存活率=(處理組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)*100%
[0018]實施例2.Hoechst染色
[0019]實驗方法:
[0020]A549細胞接種于12孔板中，待細胞達到60%密度時，給予不同劑量的人參總皂苷提取物、絲裂霉素C和聯合給藥組，給藥24h后，棄掉培養基，PBS洗I遍，碧云天Hoechst染色液避光室溫染色30min，PBS洗2遍，熒光倒置顯微鏡藍色熒光觀察、拍照。
[0021 ] 實施例3.TUNEL實驗
[0022]實驗方法:
[0023]A549細胞接種于6孔板中，待細胞達到80%密度時，給予不同劑量的人參總皂苷提取物、絲裂霉素C和聯合給藥組，給藥24h后，I3BS洗滌細胞一次，每孔加Iml無EDTA的0.25%的胰酶消化細胞，待細胞縮成單顆后，及時用含血清培養基終止，轉移到EP管中，lOOOrpm，5min中離心收集細胞。
[0024]A細胞固定
[0025]將細胞重新懸浮在4%的甲醛溶液(溶于I XPBS)使其終密度為I X 106/ml，室溫孵育1分鐘。按照上述方法離心收集細胞，去除固定液并用75 %乙醇溶液以相同細胞密度重懸。固定后的細胞可以保存在_20°C ο流式細胞儀檢測。
[0026]B 水化
[0027]1、將Iml固定細胞(I X 106cells/ml)轉移到干凈的離心管中。
[0028]2、室溫緩慢離心(100rpm) 5分鐘，去除乙醇溶液上清。
[0029]3、將細胞重懸在200μ1 I XTBS溶液中。
[0030]4、室溫緩慢離心(1000rpm)5分鐘，去除TBS溶液。
[0031]C.增加樣本通透性
[0032]1、按1: 100的比例，用1mM Tri s溶液(pH8.0)作為稀釋液來稀釋2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其終濃度為20yg/ml。
[0033]2、將細胞重懸在10yL 20yg/ml的蛋白酶K溶液中。室溫孵育5分鐘。注意嚴格控制孵育時間，孵育時間過長可對細胞造成一定的傷害，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。蛋白酶K工作液的使用濃度、處理時間及溫度因組織或細胞的類型或固定方法的不同而有所不同，使用者可參照試劑盒提供的標準使用說明摸索最合適的實驗條件。
[0034]3、室溫緩慢離心(100rpm) 5分鐘，去除蛋白酶K溶液。
[0035]D.平衡和標記反應
[0036]1、按1: 5的比例用蒸餾水稀釋5 X TdT平衡緩沖液(每個樣本需用20μ1 5 X緩沖液和80μI蒸餾水混合稀釋成100μI緩沖液)。
[0037]2、將細胞重懸在ΙΟΟμΙ I XTdT平衡緩沖液中。室溫孵育10_30分鐘，等待孵育的同時準備標記反應物。
[0038]3、把TcTT酶從冰箱中取出，為了減少試劑損耗，在打開管蓋前需短暫離心試管。將置于冰上的潔
[0039]凈離心管一一做好標記，用移液器準確加入57μ1熒光素片段末端標記反應混合物和3μ1 TcTT酶，輕輕吹打混勻備用。陰性對照的標記反應混合物中不加TdT酶，而用蒸餾水替代。
[0040]4、孵育結束后，室溫緩慢離心(1000rpm)5分鐘，去除平衡緩沖液。
[0041 ] 5、將細胞重懸在60μ1標記反應混合物溶液中，37°C避光孵育1-1.5小時。
[0042]E.終止與結果評斷
[0043]1、室溫緩慢離心(100rpm) 5分鐘，去除標記反應混合物。
[0044]2、將細胞重懸在200μ1 I X TBS溶液中。重復用TBS溶液清洗。
[0045]3、將細胞重懸在0.5ml I XTBS溶液中。
[0046]4、在BD FACS Calibur流式細胞儀上進行熒光分析。
[0047]實施例4.WesternBlot實驗
[0048]實驗方法:
[0049]A549細胞接種于Cell culture dish，待細胞密度達到80%時，給予不同劑量的人參總皂苷提取物、絲裂霉素C和聯合給藥組，處理不同的時間后，PBS洗滌細胞一次后，置于冰板上，用細胞刮子將細胞刮下收集，8000rpm X Imin離心得到細胞沉淀，每20yL細胞壓積中加入10yL RIPA細胞裂解液，冰上裂解30min后，超聲破碎5次，每次2s，15000rpmX10min離心得到上清即為提取到的總蛋白樣品。BCA法測定蛋白含量。蛋白樣品按體積比3:1加入上樣緩沖液并煮沸5min。制備8 % -12 % SDS-PAGE，對樣品進行電泳分離。電泳分離后，進行濕電轉移，將蛋白轉至PVDF膜。PVDF膜在含5 %脫脂奶粉的TBST溶液中封閉Ih后，4°C孵育一抗過夜，相應二抗室溫孵育Ih，ECL顯影，B1-Rad凝膠成像儀成像。
[0050]實施例5.裸鼠移植瘤模型實驗
[0051]實驗動物:非小細胞肺癌A549誘導胸腺免疫缺陷裸鼠移植瘤，雄性，已皮下接種A549非小細胞肺癌細胞。
[0052]實驗分組:n = 10
[0053]1、空白 Contro I 組
[0054]2、人參總皂苷提取物單給組(TGS)
[0055]3、絲裂霉素C單給組(MMC)
[0056]4、人參總皂苷提取物和絲裂霉素C聯用組(MT)
[0057]給藥方案:
[0058]TGS和MMC均為腹腔注射給藥，其中
[0059]TGS給藥劑量為0.8mg/20g體重，每天一次；
[0060]MMC給藥劑量為10ug/20g體重，每天一次；
[0061 ] 聯用組為TGS和MMC各自按上述劑量每天一次。
[0062]裸鼠飼養于SPF級動物飼養室，適應一周后，開始給藥，給藥兩周后處死取瘤組織。
【主權項】
1.一種中藥提取物的治療應用，即人參總皂苷提取物及其藥物制劑輔助抗腫瘤的應用，特別針對非小細胞肺癌、肝癌等惡性腫瘤。2.—種新的藥物聯用方案，即人參總皂苷提取物及其藥物制劑聯合抗腫瘤藥物協同抗腫瘤的應用，所述抗腫瘤藥物包括絲裂霉素C、順鉑等具有DNA損傷作用的抗腫瘤藥物。
【專利摘要】本發明涉及天然藥物領域，具體涉及人參總皂苷提取物增強絲裂霉素C和順鉑的抗腫瘤藥效。本發明公開了人參總皂苷提取物在體外增強絲裂霉素C和順鉑的抗非小細胞肺癌和肝癌的藥效，在人非小細胞肺癌細胞株A549和肝癌細胞株HepG2中，人參總皂苷提取物能在無毒劑量下增強絲裂霉素C和順鉑所誘導的細胞凋亡，同時在A549裸鼠移植瘤模型上驗證了人參總皂苷提取物和絲裂霉素C聯用的協同抗腫瘤藥效。
【IPC分類】A61K33/24, A61K31/407, A61P35/00, A61K36/258
【公開號】CN105497088
【申請號】CN201610118928
【發明人】郝海平, 曹麗娟, 趙敏, 王廣基
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年3月2日