蜜桶花片在制備抑制黑色素瘤細胞b16細胞增殖藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中藥技術領域，具體涉及一種蜜桶花片在制備抑制黑色素瘤細胞B16 細胞增殖藥物中的應用及蜜桶花片的制備方法。
【背景技術】
[0002] 蜜桶花顆粒標準號WS-11440 (ZD-1440)-2002,記載于國家中成藥標準匯編內科 肝膽分冊。由蜜桶花1700g作為原料藥制成，具有清熱解毒，除濕利膽，用于肝膽濕熱所致 的急慢性肝炎。
[0003] 現有技術中，尚未有蜜桶花片在在制備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物 中的應用的報道，也未見有蜜桶花片提取制備方面采用超臨界萃取的報道，而傳統水煎煮 的方法，工藝粗糙、落后，雜質多，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床 上應用。
【發明內容】
[0004] 發明目的：本發明的目的在于提供一種蜜桶花片在制備抑制黑色素瘤細胞B16細 胞增殖藥物中的應用。
[0005] 本發明的另一個目的在于提供一種蜜桶花片的制備方法。
[0006] 本發明的目的是通過如下的方案實現的： 蜜桶花片在制備抑制黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用，所述蜜桶花片由蜜桶 花1700g作為原料藥制成，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成：取蜜桶花，加入到 〇)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓 力15-30MPa，溫度30-50°C，C(V流量l-3ml/g生藥·min，萃取時間800-900min，得超臨界 萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0. 50g。
[0007] 優選的，上述的蜜桶花片在制備抑制黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用， 所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成：取蜜桶花，加入到〇)2超臨界萃取器中，乙醇作 為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，C(V流量 2ml/g生藥·π?η，萃取時間850min，得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制 顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0. 50g。
[0008] 現有技術中，蜜桶花顆粒口服，一次5g，一日3次。蜜桶花顆粒服藥量大。采用本 發明方法制備成的蜜桶花片每片重〇. 50g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性 成分的條件下大大減少了服用量。此結論可以通過下述試驗證明。
[0009] 試驗一、不同方法制備的蜜桶花片中麥角甾苷含量的比較 1、儀器及試藥本發明蜜桶花片：按實施例1方法制備，使用1700g原料藥，經提取制 成400片，每片重0. 50g。原蜜桶花片，按照WS-11440 (ZD-1440) -2002標準方法制備。 Agilentl200高效液相色譜儀；METTLERAE240電子分析天平；麥角留苷對照品（中國藥品 生物制品檢定所)。
[0010] 2、方法 照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VID)測定。
[0011] 色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.5%醋 酸（42 : 58)為流動相；檢測波長為334nm。理論板數按麥角留苷峰計算應不低于3000。
[0012] 對照品溶液的制備精密稱取經五氧化二磷真空干燥至恒重的麥角留苷對照品 4mg，置100ml棕色量瓶中，加甲醇制成每lml含4(^g的溶液，即得。
[0013] 供試品溶液的制備取本發明蜜桶花片10片，精密稱定，研細，取0. 20g，精密稱 定，加水10ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，殘 渣加甲醇使溶解，并轉移至5ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
[0014] 對照產品供試品溶液的制備取對照的蜜桶花顆粒20g，研細，取lg，精密稱定， 加水l〇ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加 甲醇使溶解，并轉移至5ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
[0015] 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液、對照產品供試品溶液各5μ1， 注入液相色譜儀，測定，即得。
[0016] 3、結果 結果表明，本發明蜜桶花片中麥角留苷的含量為1. 51-2. 61mg/片；而原蜜桶花顆粒中 麥角留苷的含量為1. 02mg/袋(每袋含顆粒劑5g)，每次服用量2片的麥角留苷含量為原顆 粒劑5g含量的3-5倍，在服用量減少的情況下，麥角留苷含量有很大提高。
[0017] 上述研究表明，采用本發明制備方法制備的蜜桶花片，有效成分含量遠遠高于 WS-11440 (ZD-1440) -2002標準記載的方法制備的蜜桶花顆粒。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解 本發明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發明上述 內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0019] 實施例1 取蜜桶花1700g，加入到0)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，C(V流量2ml/g生藥·π?η，萃取時間850min， 得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片 重 0. 50g。
[0020] 經檢測，成品中麥角甾苷的含量為2. 61mg/片。
[0021] 實施例2 取蜜桶花1700g，加入到0)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C(V流量lml/g生藥·π?η，萃取時間900min， 得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片 重 0. 50g。
[0022] 經檢測，成品中麥角甾苷的含量為1. 58mg/片。
[0023]實施例3 取蜜桶花1700g，加入到0)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度60°C，C02流量3ml/g生藥·η?η，萃取時間800min， 得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片 重 0. 50g。
[0024] 經檢測，成品中麥角甾苷的含量為2. 04mg/片。
[0025] 實施例4 :蜜桶花片抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖的實驗研究資料 1.實驗材料 1. 1實驗用細胞株 小鼠黑色素瘤細胞B16細胞，山東大學實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規培養。
[0026] 1. 2實驗藥物 研究藥物：本發明蜜桶花片：按實施例1方法制備。
[0027] 藥液儲液：稱取100mg蜜桶花片，溶于5ml無水乙醇中，0. 2μπι濾器過濾， 50(^ldoff管分裝，-20°C存儲，同時0. 濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0028] 1. 3實驗試劑 DMEM(GIBC0公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學試劑有限公司Cat.No. 11810-033Lot. No. 1088387);Trypsin(AMRESC0 公司）;EDTA(AMRESC0 公司）;PenicillinGSodiumSalt (AMRESC0公司l);StreptomycinSulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經貿有限公 司）；MTT(Biosharp批號：0793):PBS(實驗室自配）； 1. 4實驗器材 萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號：DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型 號：SPECTRAMAX 190);C02培養箱（FORMA型號：3111);超凈臺（蘇凈集團安泰公司制造型號： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號：S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型 號：P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號：BT323S);全自動高壓滅菌鍋（日本SANYO 公司型號：MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱（上海精密實驗設備公司型號：DHG9123A);冰 箱（西門子公司型號：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號：2001);低速離心機(上海安亭科學儀 器廠型號：KA-1000) ;0.2Mm濾器（MILLIP0RE型號：SLGP033RB) ;lcm培養皿（NEST公司）、 96孔培養板（NEST公司）；細胞計數板；離心管、移液管、Tips若干。
[0029] 2.實驗方法 1)B16細胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規培養（10cm培養皿)，當細胞生長 至對數期時，收集細胞，棄去培養液，PBS輕洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋白酶-0. 04%EDTA， 37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養基中和反應，吹打細胞后將其轉入離心管中， lOOOrpm離心5min，調整細胞懸液濃度3X104個/ml。
[0030]2)將細胞種入96孔培養板中，每孔加入細胞懸液18〇μ1，培養板放入細胞培養箱 中（37°C，5%C02)常規培養。
[0031 ] 3)根據細胞生長情況，一般長至50%-70%，加入蜜桶花片溶液，繼續培養24h。
[0032]4) 24h后加入 2〇μ1MTT溶液（5mg/ml，即 0· 5%MTT)，繼續培養 4h。
[0033] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入20〇μ1二甲基亞砜，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0034] 6)同時設置本底(不加細胞，只加培養液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介 質、培養液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定6個復孔。
[0035] 7)結果以藥物對細胞的抑制率表示：細胞增值抑制率（%)=(對照孔0D值-給藥 孔0D值)、對照孔0D值X100%。實驗重復3次。
[0036] 3.統計處理 采用MicrosoftExcel2007軟件中的相關分析和Studentt檢驗，數據以mean土S.D. 表不。
[0037] 4.實驗結果 MTT法實驗后統計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對B16細胞增殖抑 制有差異（P〈〇. 05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當劑量達到15-20mg/ ml時有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0038] 表1蜜桶花片對B16細胞增殖抑制影響研究（X土SD)
注：與對照組比較，*P〈〇. 01 ;#P〈〇. 001。
[0039] 5 ·實驗結論 本發明的蜜桶花片可以抑制B16細胞增殖，減少B16細胞的細胞生長數目，該作用呈劑 量依賴性。
【主權項】
1. 蜜桶花片在制備抑制黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用，所述蜜桶花片由蜜 桶花1700g作為原料藥制成，其特征在于，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成：取蜜 桶花，加入到〇) 2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為 4-6%，萃取壓力 15-30MPa，溫度 30-50°C，C02流量l-3ml/g生藥·π?η，萃取時間 800-900min， 得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片 重 0. 50g。2. 根據權利要求1所述的蜜桶花片在制備抑制黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的 應用，其特征在于，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成：取蜜桶花，加入到C02超臨界 萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫 度40°C，C(V流量2ml/g生藥·min，萃取時間850min，得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加 入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0. 50g。
【專利摘要】本發明屬于中藥技術領域，具體涉及一種蜜桶花片在制備抑制黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用及蜜桶花片的制備方法。所述蜜桶花片由蜜桶花1700g作為原料藥制成，采用超臨界萃取制備而成，使得麥角甾苷含量有很大提高。
【IPC分類】A61K9/20, A61K36/80, A61P35/00
【公開號】CN105362450
【申請號】CN201510986122
【發明人】李萍
【申請人】濟南新時代醫藥科技有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月25日