可斷裂peg載阿霉素脂質體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于藥品技術領域，尤其涉及一種載阿霉素脂質體的制備方法。
【背景技術】
[0002]將脂質材料抽干成膜后，加入lmL硫酸銨緩沖液，水化超聲制備出均勻的小單室脂質體。將該lmL脂質體以一定的緩沖液洗脫通過SephadexG50凝膠柱替換外水相，收集脂質體組分于2mL容量瓶中，用外水相緩沖液定容后，加入適量鹽酸阿霉素水溶液，一定溫度下孵育即得阿霉素脂質體。理想的腫瘤靶向給藥系統，需要同時具有高效的腫瘤蓄積能力和強入胞作用。在脂質體表面修飾聚乙二醇，可顯著延長脂質體的循環時間，通過EPR效應使腫瘤蓄積增加，但PEG的存在同時也阻礙了脂質體與腫瘤細胞的相互作用，使藥物無法有效的被遞送到腫瘤細胞內發揮抗癌活性。為克服這一弊端，近年來開發出一系列可斷裂PEG技術，包括:pH敏感型,酶敏感型,還原敏感型等，對于還原敏感型可斷裂PEG構建的脂質體，主要通過二硫鍵作為橋接分子連接PEG和脂質材料，當脂質體在腫瘤部位高度蓄積后，通過外源性給予還原劑如半胱氨酸等，就可使PEG從脂質體表面斷裂開來，還原敏感型可斷裂PEG策略具有材料合成簡單，斷裂易于控制等優越性。TAT肽作為一種強效的細胞穿膜肽被修飾于脂質體后可以促進脂質體高效入胞，但TAT的非選擇特異性導致其腫瘤蓄積較低。
【發明內容】
[0003]本發明就是針對上述問題，提供一種提高腫瘤蓄積以及進入腫瘤細胞的效率的一種可斷裂PEG載阿霉素脂質體的制備方法。
[0004]為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案。
[0005]可斷裂PEG載阿霉素脂質體的制備方法，包括下步驟。
[0006](1)將處方量的 SPC，Cho, DSPE-PEG-TAT, DSPE-PEG-OMe 置 50ml 茄形瓶中，氯仿溶解后旋轉蒸發成膜，于真空干燥器中過夜，加入2.5mlPBS緩沖液，于空氣浴搖床中，35°C，150rpm, 28min水化，水浴超聲5min脫膜，探頭超聲制備得到TAT和遮擋PEG共修飾的脂質體(脂質濃度2.068ymol/ml);其中，制備Rh-ΡΕ標記的脂質體時，需在脂質材料中加入熒光標記的磷脂，用量為每份脂質體20 μ go
[0007](2)將脂質材料抽干成膜后，加入lmL硫酸銨緩沖液，水化超聲制備出均勻的小單室脂質體。將該lmL脂質體以一定的緩沖液洗脫通過SephadexG50凝膠柱替換外水相，收集脂質體組分于2mL容量瓶中，用外水相緩沖液定容后，加入適量鹽酸阿霉素水溶液，一定溫度下孵育即得阿霉素脂質體。
[0008](3)將脂質材料抽干成膜后，加入lmL硫酸銨緩沖液，水化超聲制備出均勻的小單室脂質體。將該lmL脂質體以一定的緩沖液洗脫通過凝膠柱替換外水相，收集脂質體組分于2mL容量瓶中，用外水相緩沖液定容后，加入適量鹽酸阿霉素水溶液，一定溫度下孵育即得阿霉素脂質體。
[0009]作為一種優選方案，采用的儀器包括，ZHWY-100H型恒溫空氣搖床；RE_200B型旋轉蒸發儀；恒溫水浴鍋；SB-5200D超聲波清洗儀；AL204-1C電子天平；超聲細胞粉碎機；RF-5301熒光分光光度計；SizerNanoZS90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀；細胞培養板；C02培養箱；SkanIt生物發光儀；SW_CJ-ZFD水平流凈化工作臺；XD_RFL倒置熒光顯微鏡；凝膠分離檢測系統。
[0010]本發明有益效果。
[0011]本發明細胞穿膜肽和可斷裂PEG共修飾的脂質體系統進行了進一步的優化，體外細胞當以10%的可斷裂PEG5000修飾脂質體時，可斷裂PEG對TAT的屏蔽率達到最大值94%，因此脂質體穩定性好，從而提高藥物的抗腫瘤效率。以該處方的脂質體系統對阿霉素進行包載，以粒徑，電位及包封率為指標篩選載藥脂質體的制備工藝，所制備的載D0X的共修飾脂質體粒徑均勻在90nm左右，PDK0.2分散性良好，zeta電位接近電中性，包封率>95%。成功的實現了對載阿霉素共修飾脂質體的制備和優化，所制備的脂質體穩定性好，載藥量高，這也是該載藥系統能夠最終實現有效的抗腫瘤作用的必備條件。
【具體實施方式】
[0012]可斷裂PEG載阿霉素脂質體的制備方法，包括下步驟。
[0013](1)將處方量的 SPC，Cho，DSPE-PEG-TAT，DSPE-PEG-OMe 置 50ml 茄形瓶中，氯仿溶解后旋轉蒸發成膜，于真空干燥器中過夜，加入2.5mlPBS緩沖液，于空氣浴搖床中，35°C，150rpm, 28min水化，水浴超聲5min脫膜，探頭超聲制備得到TAT和遮擋PEG共修飾的脂質體(脂質濃度2.068ymol/ml);其中，制備Rh-ΡΕ標記的脂質體時，需在脂質材料中加入熒光標記的磷脂，用量為每份脂質體20 μ go
[0014](2)將脂質材料抽干成膜后，加入lmL硫酸銨緩沖液，水化超聲制備出均勻的小單室脂質體。將該lmL脂質體以一定的緩沖液洗脫通過SephadexG50凝膠柱替換外水相，收集脂質體組分于2mL容量瓶中，用外水相緩沖液定容后，加入適量鹽酸阿霉素水溶液，一定溫度下孵育即得阿霉素脂質體。
[0015](3)將脂質材料抽干成膜后，加入lmL硫酸銨緩沖液，水化超聲制備出均勻的小單室脂質體。將該lmL脂質體以一定的緩沖液洗脫通過凝膠柱替換外水相，收集脂質體組分于2mL容量瓶中，用外水相緩沖液定容后，加入適量鹽酸阿霉素水溶液，一定溫度下孵育即得阿霉素脂質體。
[0016]作為一種優選方案，采用的儀器包括，ZHWY-100H型恒溫空氣搖床；RE_200B型旋轉蒸發儀；恒溫水浴鍋；SB-5200D超聲波清洗儀；AL204-1C電子天平；超聲細胞粉碎機；RF-5301熒光分光光度計；SizerNanoZS90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀；細胞培養板；C02培養箱；SkanIt生物發光儀；SW_CJ-ZFD水平流凈化工作臺；XD_RFL倒置熒光顯微鏡；凝膠分離檢測系統。
[0017]不同總磷脂與膽固醇的比例下制備的脂質體包封率，粒徑電位無顯著差異，包封率均在90%以上，由于我們脂質體處方中PEG5000含量較高，將使脂質體膜穩定性下降，考慮到膽固醇在維持脂質體膜穩定性中的“膜緩沖劑”作用。
[0018]選擇300mM硫酸銨緩沖液為水化溶劑，載藥前脂質濃度2.585 μ mol/mL;，以PBS(pH=7.4)為洗脫溶劑替換外水相的硫酸銨，載藥溫度為45°C，載藥時間為15min，藥脂比為1:10ο
【主權項】
1.可斷裂PEG載阿霉素脂質體的制備方法，包括下步驟； (1)將處方量的SPC，Cho，DSPE-PEG-TAT，DSPE-PEG-OMe 置 50ml 茄形瓶中，氯仿溶解后旋轉蒸發成膜，于真空干燥器中過夜，加入2.5mlPBS緩沖液，于空氣浴搖床中，35°C，150rpm, 28min水化，水浴超聲5min脫膜，探頭超聲制備得到TAT和遮擋PEG共修飾的脂質體(脂質濃度2.068 μ mol/ml);其中，制備Rh_PE標記的脂質體時，需在脂質材料中加入熒光標記的磷脂，用量為每份脂質體20 μ g ; (2)將脂質材料抽干成膜后，加入lmL硫酸銨緩沖液，水化超聲制備出均勻的小單室脂質體；將該lmL脂質體以一定的緩沖液洗脫通過S印hadexG50凝膠柱替換外水相，收集脂質體組分于2mL容量瓶中，用外水相緩沖液定容后，加入適量鹽酸阿霉素水溶液，一定溫度下孵育即得阿霉素脂質體； (3)將脂質材料抽干成膜后，加入lmL硫酸銨緩沖液，水化超聲制備出均勻的小單室脂質體；將該lmL脂質體以一定的緩沖液洗脫通過凝膠柱替換外水相，收集脂質體組分于2mL容量瓶中，用外水相緩沖液定容后，加入適量鹽酸阿霉素水溶液，一定溫度下孵育即得阿霉素脂質體。2.根據權利要求1所述可斷裂PEG載阿霉素脂質體的制備方法，其特征在于，采用的儀器包括，ZHWY-100H型恒溫空氣搖床；RE-200B型旋轉蒸發儀；恒溫水浴鍋；SB-5200D超聲波清洗儀；AL204-1C電子天平；超聲細胞粉碎機；RF_5301熒光分光光度計；SizerNanoZS90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀；細胞培養板；C02培養箱；SkanIt生物發光儀；SW-CJ-ZFD水平流凈化工作臺；XD-RFL倒置熒光顯微鏡；凝膠分離檢測系統。
【專利摘要】可斷裂PEG載阿霉素脂質體的制備方法屬于藥品技術領域，尤其涉及一種載阿霉素脂質體的制備方法。本發明提供一種提高腫瘤蓄積以及進入腫瘤細胞的效率的一種載阿霉素脂質體的制備方法。含糖聚合物修飾納米粒的制備方法，包括下步驟。（1）將處方量的SPC，Cho，DSPE-PEG-TAT，DSPE-PEG-OMe置50ml茄形瓶中，氯仿溶解后旋轉蒸發成膜，于真空干燥器中過夜，加入2.5mlPBS緩沖液。（2）將脂質材料抽干成膜后，加入1mL硫酸銨緩沖液，水化超聲制備出均勻的小單室脂質體。（3）將脂質材料抽干成膜后，加入1mL硫酸銨緩沖液，水化超聲制備出均勻的小單室脂質體。將該1mL脂質體以一定的緩沖液洗脫通過凝膠柱替換外水相，一定溫度下孵育即得阿霉素脂質體。
【IPC分類】A61K47/10, A61K9/127, A61K31/704, A61P35/00, A61K47/42
【公開號】CN105310983
【申請號】CN201410376265
【發明人】孫仁
【申請人】孫仁
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年8月3日