一種抑制細粒棘球蚴感染的方法和藥物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種抑制細粒棘球蝴感染的方法和治療由于細粒棘球蝴感染導致包 蟲病的藥物，屬于生物和醫藥領域。
【背景技術】
[0002] 包蟲病是一種由棘球絳蟲（Echinococcus granulosus)的續絳期幼蟲寄生在人體 肝、肺等臟器引起的一種嚴重危害健康的人畜共患寄生蟲病，在我國此類疾病主要包括囊 型包蟲病（CE)和泡型包蟲病（Alveolar echinococcosis, AE)兩種，分別由細粒棘球絳蟲 幼蟲（棘球蝴）和多房棘球絳蟲幼蟲（泡球蝴）寄生在人體的組織器官所導致。在這二者 之中，囊型包蟲病，亦稱細粒棘球蝴病，可在動物與動物之間或人與動物之間形成循環，成 為自然疫源性疾病，是目前亟需防治的主要種類。
[0003] 目前，對于包蟲病的治療尚無良好的預防治療方案。在臨床上通常是采用手術治 療。在臨床實踐中，外科手術治療的不足之處是手術時因囊液外溢而導致包蟲埋植；同時， 手術難處理肝實質深處較小的包蟲囊腫，尤其對于年老體弱或患有重要臟器疾患的病例， 以及對于多發性包蟲病及累及多個臟器者、外科手術就顯得尤為棘手，特別是由于肝包蟲 囊腫破裂可手術時囊液外滲種植所致的繼發性腹腔包蟲病，即使多次手術、也難全部摘除； 對于病變廣泛浸潤的多房型肝包蟲病，手術更是束手無策。
[0004] 近年來，國內外一直在研究包蟲病的化學治療和免疫治療，化學治療面臨著毒性 較大、適用范圍窄的缺陷，而免疫治療多年來始終未取得較為顯著的成果，此類研究多集中 在免疫診斷上。由于治療方法的缺失，本領域在動物包蟲病的治療上同樣面臨著上述嚴重 的問題。尤其是已有的用于人體包蟲病的治療方案成本較高，在動物包蟲病的治療上無應 用價值。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術的不足，申請人對細粒棘球蝴感染導致包蟲病的生物學過程進行了 深入研究，尤其是仔細分析和探究了細粒棘球蝴感染與免疫過程之間的作用關系，從而發 明了一種抑制細粒棘球蝴感染的方法，并基于此可制成治療細粒棘球蝴感染導致包蟲病的 藥物。
[0006] 具體地說，本發明是通過如下技術方案實現的：
[0007] -種抑制細粒棘球蝴感染的方法，使用抗Tim-3抗體阻斷細粒棘球蝴的感染。
[0008] 申請人進行的試驗顯示，通過使用抗Tim-3抗體，能夠降低Tim-3的表達，提高巨 噬細胞的吞噬功能，增強對細粒棘球蝴的免疫殺滅，降低其免疫逃逸。
[0009] 優選的，相對于1000個細粒棘球蝴感染量，抗Tim-3抗體的用量為30-80ug。
[0010] 本領域技術人員容易理解，為了便于抗Tim-3抗體生效，在使用抗Tim-3抗體時還 可以同步使用抗Fc抗體，抑制Tim-3對巨細胞的結合，提高抗Tim-3抗體的效用。
[0011] 在使用抗Fc抗體時，其用量與抗Tim-3抗體用量相同即可滿足需要；然而這并非 必須的，本領域技術人員可根據實際需要合理調整抗Fc抗體的用量。
[0012] 基于上述成果，本發明還公開了一種用于治療細粒棘球蝴感染所致包蟲病的藥 物，包含抗Tim-3抗體作為活性成分。
[0013] 同理，在優選情況下，上述藥物中還可包含與抗Tim-3抗體用量相同的抗Fc抗體。
【具體實施方式】
[0014] 為了說明本發明技術方案的效果，申請人以具體的科研試驗為例進行十一。本領 域技術人員應該理解，如下所公開的技術方案僅僅是對本發明原理的一種驗證和說明，并 不限制本發明技術方案的細節，如各種操作過程、用量、應用方式等。
[0015] 在下述試驗中，所用病原體為細粒棘球蝴，將其采集、培養后活力>90%用于實驗； 所用小鼠為雌性BALB/c小鼠，6-8周，體重20 ± 2g。
[0016] 在下述中，所用的相關抗體均可從試劑公司購買，例如Ebioscience公司銷售的 抗Fc抗體、抗Tim-3抗體、抗IgG抗體，其它抗體公司也在市場上銷售類似抗體類商品。
[0017] 首先建立細粒棘球蝴感染小鼠動物模型：將24只健康的雌性BALB/c小鼠，隨機分 成實驗組和對照組。感染組：腹腔接種濃度為10000個/ml原頭蝴，0. 2ml/只；對照組：腹 腔接種PBS，0. 2ml/只，分別在1、5、9、13天的時候無菌采集外周血，椎脫臼法處死小鼠，提 腹腔巨噬細胞，并摘取脾臟，制備脾細胞懸液。
[0018] 其次建立Tim-3阻斷后細粒棘球蝴感染小鼠動物模型：將24只健康的雌性BALB/ c小鼠，隨機分成實驗組和阻斷組。感染組：腹腔接種200ug的抗IgG抗體；阻斷組：接種 l〇〇ug抗Fc抗體和100ug抗Tim-3抗體，第二天，各組腹腔接種濃度為10000個/ml原頭 蝴，0. 2ml/只，分別在感染后1、5、9、13天的時候無菌采集外周血，椎脫臼法處死小鼠，提腹 腔巨噬細胞，并摘取脾臟，制備脾細胞懸液。
[0019] 在上述完成后，根據生物學方法采集分離小鼠腹腔巨噬細胞，并進行巨噬細胞吞 功能檢測和巨細胞相關各炎癥相關細胞因子含量。
[0020] 在細粒棘球蝴感染小鼠動物模型中，實驗結果顯示：
[0021] 流式細胞術檢測小鼠細粒棘球蝴感染早期脾巨噬細胞上Tim-3的表達（表1)，細 粒棘球蝴早期感染小鼠后，感染后第1，5天，感染組（9. 0±2. 14%~8. 03±1. 17% )與對 照組（6. 1±1. 2%~7. 5±0. 8% )脾巨噬細胞上Tim-3的表達未明顯改變，經統計學分析， 無統計學差異（卩>0.05)。在感染后9，13天，感染組（11.63±0.50%~12.37±0.21%)與 對照組（7. 1±0. 9%~7. 8±1. 3% )脾巨噬細胞上Tim-3的表達都有所升高。
[0022] 表1細粒棘球蝴早期感染小鼠不同時間脾巨噬細胞上Tim-3的表達
[0024] 注：感染組與對照組比較，* :P〈0. 05。
[0025] 流式細胞術檢測小鼠細粒棘球蝴感染早期腹腔巨噬細胞上Tim-3的表達（表2)， 除感染后第1天，第5、9、13天腹腔巨噬細胞上Tim-3的表達都升高，經統計學分析，感染組 與對照組，Tim-3的表達升高有統計學差異（P〈0. 05)。
[0026] 表2細粒棘球蝴早期感染小鼠不同時間腹腔巨噬細胞上Tim-3的表達
[0028] 注：感染組與對照組比較，* :P〈0. 05。
[0029] 通過QRT檢測小鼠細粒棘球蝴感染早期感染組相對于對照組巨噬細胞相關炎性 細胞因子的mRNA表達水平，見表3。
[0030] 表3小鼠感染細粒棘球蝴后各炎癥因子的mRNA表達水平
[0032] 注：感染組與對照組比較，* :P〈0. 05。
[0033] 上表顯示，TNF-α在感染后表達升高，IL-6在感染后表達升高，IL-10在感染后表 達升高，IL-1 β在感染后表達升高，TLR2只在感染后第13天表達升高，TLR4只在感染后第 1天表達升高，HMGB1只在感染后第13天表達升高。
[0034] ELISA檢測小鼠細粒棘球蝴感染早期感染組相對于對照組巨噬細胞相關炎性細胞 因子的蛋白水平表達（表4):
[0035] 表4細粒棘球蝴早期感染小鼠不同時間巨噬細胞相關炎性細胞因子蛋白水平表 達
[0037] 注：感染組與對照組比較，* :P〈0. 05。
[0038] 從上表可以看到，TNF-α在感染后表達升高，IL-6在感染后表達升高，IL-10在感 染后表達升高，IL-Ιβ在感染后表達升高。
[0039] 通過小鼠腹腔巨噬細胞體外吞噬雞紅細胞，分別觀察小鼠細粒棘球蝴感染早期感 染組和對照組腹腔巨噬細胞吞噬率和腹腔巨噬細胞吞噬指數（表5)來反應巨噬細胞的吞 嗤功能。
[0040] 表5細粒棘球蝴早期感染小鼠不同時間巨噬細胞吞噬功能
[0043] 注：感染組與對照組比較，* :P〈0. 05。
[0044] 上述實驗結果顯示，細粒棘球蝴早期感染小鼠后，綜合吞噬率和吞噬指數結果，巨 噬細胞的吞噬功能在感染后降低。
[0045] 通過Greiss試劑法檢測小鼠腹腔巨噬細胞N0釋放量（表6)，細粒棘球蝴早期感 染小鼠后，N0釋放量升高。
[0046] 表6細粒棘球蝴早期感染小鼠不同時間巨噬細胞的N0釋放
[0048] 注：感染組與對照組比較，* :P〈0. 05。
[0049] 在Tim-3阻斷后細粒棘球蝴感染小鼠動物模型中，實驗結果顯示：
[0050] 通過QRT檢測小鼠細粒棘球蝴感染早期Tim-3阻斷組相對于感染組巨噬細胞相關 炎性細胞因子的mRNA表達水平（表7):
[0051] 表7抗Tim-3單抗阻斷后小鼠感染細粒棘球蝴后各炎癥因子的mRNA表達水平
[0052]
[0053] 注：Tim-3Ab+感染組與感染組比較，* :P〈0. 05。
[0054] 上述結果顯示，阻斷Tim-3后再感染與普通感染細粒棘球蝴早期感染小鼠， TNF-α進一步升高。
[0055] 通過ELISA檢測小鼠細粒棘球蝴感染早期Tim-3抗體阻斷組相對于感染組巨噬細 胞相關炎性細胞因子的蛋白表達水平（表8):
[0056] 表8抗Tim-3單抗阻斷處理后細粒棘球蝴早期感染小鼠不同時間各炎癥因子蛋 白水平表達
[0058] 注：Tim-3Ab+感染組與感染組比較，* :P〈0. 05。
[0059] 上述結果同樣顯示出用抗Tim-3單抗阻斷處理后細粒棘球蝴早期感染小鼠不同 時間各炎癥因子蛋白水平表達，TNF-a表達升高明顯。
[0060] 通過小鼠腹腔巨噬細胞體外吞噬雞紅細胞，分別觀察小鼠細粒棘球蝴感染早期感 染組和Tim-3阻斷組腹腔巨噬細胞吞噬率和腹腔巨噬細胞吞噬指數（表9)來反應巨噬細 胞的吞噬功能，顯示細粒棘球蝴早期感染小鼠后，巨噬細胞的吞噬功能在感染后升高。
[0061] 表9抗Tim-3單抗阻斷處理后細粒棘球蝴早期感染小鼠不同時間巨噬細胞吞噬 功能
[0063] 注：Tim_3Ab+感染組與感染組比較，* :P〈0. 05。
[0064] 通過Greiss試劑法檢測小鼠腹腔巨噬細胞NO釋放量（表10)，細粒棘球蝴早期感 染小鼠后，小鼠腹腔巨噬細胞NO釋放量在感染后降低：
[0065] 表10 Tim-3阻斷后細粒棘球蝴早期感染小鼠不同時間巨噬細胞的N0釋放
[0067] 注：Tim_3Ab+感染組與感染組比較，* :P〈0. 05。
[0068] 綜合上述實驗結果我們可以看到，通過阻斷Tim-3,能夠增強細粒棘球蝴早期感染 小鼠后巨噬細胞巨噬細胞吞噬功能，提高其對細粒棘球蝴，有效降低蟲體的免疫逃逸，從而 改善對包蟲病的防治效果。
【主權項】
1. 一種抑制細粒棘球蝴感染的方法，其特征在于使用抗Tim-3抗體阻斷細粒棘球蝴的 感染。2. 根據權利要求1的方法，其特征在于相對于1000個細粒棘球蝴感染量，抗Tim-3抗 體的用量為30-80ug。3. -種用于治療細粒棘球蝴感染所致包蟲病的藥物，其特征在于包含抗Tim-3抗體作 為活性成分。
【專利摘要】本發明公開了一種抑制細粒棘球蚴感染的方法，通過使用抗Tim-3抗體阻斷細粒棘球蚴的感染。本發明所公開的技術方案，通過使用抗Tim-3抗體直接增強了受細粒棘球蚴感染對象自身的巨噬細胞吞噬功能，從而提高了其對細粒棘球蚴的免疫能力。
【IPC分類】A61P33/10, A61K39/395
【公開號】CN105288617
【申請號】CN201510689071
【發明人】陳雪玲, 吳向未, 徐芳潔
【申請人】陳雪玲
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年10月20日