血紅素氧化酶-2在制備抑制器官移植免疫排斥制劑中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及血紅素氧化酶-2在制備抑制器官移植免疫排斥制劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 器官移植是治療肝臟、腎臟和心臟等慢性終末期疾病的主要方法，抑制排斥反應 是移植器官長期存活的重要因素之一。隨著研究的進展，移植器官自身保護性反應對阻止 移植物排斥反應的作用逐漸引起重視。保護性作用主要通過保護性基因來介導，通過研究 發現，在移植存活器官的平滑肌細胞和血管內皮細胞上有保護性基因的表達，在有排斥反 應的移植器官上很少或沒有表達。血紅素氧化酶-2 (Heme 0xygenase-2, H0-2)H0_2是一 種重要的內源性抗凋亡因子，對氧化應激和細胞因子介導的細胞凋亡起關鍵保護性作用， H0-2在調控新生豬和小鼠的腦血流量中扮演重要角色.本研究通過制備了 H0-2的轉基因 小鼠，通過對小鼠皮膚的同種異體移植發現，H0-2轉基因小鼠皮膚的存活率顯著高于野生 型小鼠皮膚存活率。
【發明內容】
[0003] 為了解決移植器官因免疫排斥反應導致長期存活率低的難題，我們制備了 H0-2 的轉基因小鼠，研究H0-2在小鼠皮膚同種異體移植中降低免疫排斥反應的作用，進而提供 了 H0-2及其基因在制備抑制器官移植免疫排斥反應制劑中的應用。
[0004] 本發明公開了血紅素氧化酶-2在制備抑制器官移植免疫排斥反應制劑中的應 用。
[0005] 本發明同時提供了血紅素氧化酶-2基因在制備抑制器官移植免疫排斥反應制劑 中的應用。
[0006] 更具體地，提供了 H0-2的真核表達載體在制備抑制器官移植免疫排斥反應制劑 中的應用。
[0007] 我們構建了 H0-2的真核表達載體pEFl a -IRES-AcGFP，通過胚胎顯微注射技術制 備H0-2轉基因小鼠。H0-2轉基因小鼠皮膚移植到BALB/c小鼠后背上，同時野生型FVB小 鼠作為陰性對照。觀察H0-2轉基因小鼠與陰性對照皮膚的存活時間、免疫組化分析炎性細 胞的數量對比變化。
[0008] 本發明的制劑可用于抑制器官移植免疫排斥反應，提高器官移植的存活率，為治 療肝臟、腎臟和心臟等慢性終末期疾病提供了有效方法。
【附圖說明】
[0009] 圖1是H0-2轉基因小鼠與野生型小鼠皮膚移植存活率對比。
[0010] 圖2是H0-2轉基因小鼠與野生型小鼠皮膚移植后炎癥反應。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1 :H0-2基因的擴增及真核表達載體pEFl α -HO-2-AcGFP的構建
[0012] 提取C57BL/6小鼠海馬組織總RNA，用TaKaRa反轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為 模板。以F:5'-GTGAATTCATGTCTTCAGAGGTGGAGACC(EcoRI)-3'（SEQIDN0·l)，R:5'-TAGG ATCCCATGTAGTACCAGGCCAATAG(BamH I)-3'（SEQ ID N0. 2)為上下游引物擴增 H0-2 的 848bp 片段，擴增條件：94°C 4min，94°C 40s，60°C 40s，72°C 40s，72°C 10min，30 個循環。擴增 產物1%瓊脂糖凝膠電泳，以確定擴增產物大小，然后將HO-2的PCR產物經過回收純化后與 載體pEFl a -IRES-AcGFP (購買于Clontech公司）同時用EcoR I和BamH I雙酶切，酶切 后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并經過凝膠回收純化試劑盒回收兩者的酶切產物，將兩者酶切 純化的產物按照3 :1的摩爾比混合，用T4DNA連接酶37°C連接24h，轉化DH5d感受態細胞 中，然后進行陽性克隆的篩選，用質粒提取試劑盒提取陽性菌質粒進行酶切鑒定，送生工生 物工程（上海）股份有限公司測序。
[0013] 實施例2 :H0-2轉基因動物模型的建立
[0014] 通過顯微注射技術制備H0-2的轉基因小鼠（由廣州賽業生物公司協助完成）。
[0015] 實施例3 :小鼠皮膚移植實驗
[0016] 應用成年的H0-2轉基因 FVB小鼠及野生型FVB小鼠皮膚分別移植到成年BALB/c 小鼠背部，每個時間段各取10只陽性鼠與野生型鼠觀察皮膚的存活率，如圖1所示，2d時 H0-2轉基因（Tg)移植皮膚與野生型（W)比較（A1，A2)，A1皮膚存活率較A2皮膚存活率差 別不顯著；第4d時，B1皮膚較B2皮膚，B1皮膚存活率為70%，B2皮膚存活率為40%，兩者 存活率差異達到顯著水平；第8d，C1皮膚較C22皮膚，C1皮膚存活率為50%，B2皮膚存活 率為20%，兩者存活率差異達到顯著水平。并對2d，4d，8d d的陽性皮膚和陰性皮膚進行 免疫組化實驗，觀察二者的炎癥反應，如圖2所示，第2d，轉基因（Tg)小鼠移植皮膚較野生 型（W)小鼠無顯著性差異；第4d，轉基因小鼠移植皮膚的炎癥細胞數顯著小于野生型移植 小鼠皮膚炎癥細胞數；第8d，炎癥細胞數明顯增加，但轉基因小鼠移植皮膚的炎癥細胞數 顯著小于野生型移植小鼠皮膚炎癥細胞數。結果顯示，H0-2轉基因小鼠的皮膚存活率顯著 高于對照組，并且皮膚炎癥細胞數顯著低于對照組。
【主權項】
1. 血紅素氧化酶-2在制備抑制器官移植免疫排斥反應制劑中的應用。2. 血紅素氧化酶-2基因在制備抑制器官移植免疫排斥反應制劑中的應用。3. 血紅素氧化酶-2的真核表達載體在制備抑制器官移植免疫排斥反應制劑中的應 用。
【專利摘要】本發明涉及血紅素氧化酶-2在制備抑制器官移植免疫排斥制劑中的應用。本發明公開了血紅素氧化酶-2及其基因在制備抑制器官移植免疫排斥反應制劑中的應用。本發明的制劑可用于抑制器官移植免疫排斥反應，提高器官移植的存活率，為治療肝臟、腎臟和心臟等慢性終末期疾病提供了有效方法。
【IPC分類】A61K48/00, A61K38/44, A61P37/06
【公開號】CN105288599
【申請號】CN201510697954
【發明人】陳仁金, 王珍珍, 陳全剛, 袁紅花, 吳連連
【申請人】徐州醫學院
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年10月22日