一種獐芽菜苷鞘磷酸一胺醇受體拮抗劑的抗炎用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及獐芽菜苷對鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑的抗炎用途。
【背景技術】
[0002] S1P 受體（sphingosine-1-phosphate receptor，S1PR)是 G 蛋白偶聯受體家族成 員之一，包括S1P1~S1P5,主要與G蛋白α亞型偶聯發揮作用。
[0003] 炎癥是具有血管系統的活體組織對損傷因子所發生的防御反應為炎癥。血管反應 是炎癥過程的中心環節。炎癥是臨床常見的一個病理過程，可以生于機體各部位的組織和 各器官。急性炎癥平時具有紅、腫、熱、痛、機能掩藏等變化，同隨時常伴有發熱、白細胞增多 等全身反應。是機體對于刺激的一種防御反應。
[0004] 炎癥的產生實質上是機體與致炎因子進行抗爭的反映。這種分歧抗爭貫穿炎癥過 程的始終。致炎因子作用于機體后，一方面引發組織細胞的損壞，使局部組織細胞顯現變 性、壞死；另一方面，誘導機體抗病機能增加，以益于清除致炎因子，使受損組織得到修復， 從而使機體的內環境以及內環境和外環境之間達到新的均衡。S1PR通過激活多條細胞內信 號途徑發揮不同的生物學功能，包括調節細胞迀移、增殖、凋亡及細胞內鈣離子動員、炎癥 因子和黏附分子表達，以及調控血管發生、血管緊張度和通透性等，進而對心血管系統發揮 重要影響。S1P1廣泛表達于各種組織和細胞，在保持血管通透性等方面具有協調作用。
[0005] 目前研究認為鞘氨醇-1-磷酸受體拮抗劑與多種細胞表面相應受體結合，在免疫 調節方面具有促進淋巴細胞歸巢、抑制淋巴細胞外流，誘導淋巴細胞凋亡，并能影響樹突狀 細胞及調節性Τ細胞功能另小鼠實驗顯示S1P1在血管重建、神經形成、免疫細胞迀移、內皮 細胞屏障功能等方面發揮重要作用。所以建立S1P1拮抗劑篩選模型對治療炎癥和心血管 等疾病具有重要意義。
【發明內容】
[0006] 本發明在采用鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑高通量篩選模型，通過功能性驗證尋 找先導化合物，發現了一類二咖啡酰基奎尼酸類鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑，為新型的抗 炎藥開發提供先導化合物。本發明可為此類臨床抗炎治療藥物的開發提供先導化合物，為 新型抗炎藥物開發提供線索和實驗依據。
[0007] 本發明的技術方案為：在中國倉鼠卵巢癌細胞（CH0)內穩定轉染鞘氨醇-1-磷酸 1受體，建立鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑靶向激動劑高通量篩選模型，初篩，復篩，構效關 系分析，得到一類具有抗炎作用的候選藥物。具體步驟如下：
[0008] 步驟一：建立及培養穩定轉染鞘氨醇-1-磷酸1受體的CH0細胞株。
[0009] 步驟二：激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的ECS。。
[0010] 步驟三：拮抗劑模型建立及陽性性藥驗證。
[0011] 步驟四：采用穩轉細胞株和實驗確定的最佳檢測條件對化合物進行鞘氨醇-1-磷 酸1受體拮抗劑的高通量篩選，得到有明顯量效關系的化合物。
【附圖說明】：
[0012] 圖1 :激動劑量效曲線
[0013] 圖2 :詰抗劑量效曲線
[0014] 圖3 :先導化合物量效曲線
【具體實施方式】
[0015] 1.實驗材料
[0016] (1)完全培養：DMEM ;10% FBS ;100U/mL Penicillin ;100 μ g/mL Str印tomycin ; 1000 yg/mL G418〇
[0017] (2)Stimulation Buffer(SB):含 ImM IBMX 的 DMEM〇
[0018] (3)主要儀器：C02培養箱；384 孔板；Paradigm ? Detection Platform。
[0019] 2.建立及培養穩定轉染鞘氨醇-1-磷酸1受體的CH0鞘氨醇-1-磷酸1細胞株。
[0020] 3.最佳細胞數確定
[0021] (1)配制Forskolin梯度稀釋液：需要用Forskolin對細胞進行刺激，所以應將 Forskolin儲備液逐級稀釋為最終濃度的2倍。
[0022] (2)配制不同濃度的細胞稀釋液：用SB將1. (7)中重懸好的細胞分別稀釋為 200cells/yL、400cells/yL及 800cells/yL。
[0023] (3)加樣：將3. (1)中稀釋好的Forskolin溶液按每個濃度2個復孔，5 μ L每孔加 入384孔板中，再加入2孔每孔各5 yL的SB作為cell negative control (CNC)。接著向 不同濃度的Forskolin溶液及CNC中加入3. (2)配制好的不同濃度的細胞稀釋液各5 μ L。 將384孔板在500rpm下離心15s，使10 μ L試劑混合均勻以充分反應。為防止試劑蒸發造 成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育45min。
[0024] (4)終止試劑：用 Lysis buffer (LB)將 cAMP-d2 稀釋 40 倍，將 anti-cAMP 稀釋 20 倍。取適量LB與稀釋好的anti-cAMP溶液按1 : 1混合，向CNC中每孔各加入10 μ L ;將 剩余cAMP-d2溶液與anti-cAMP溶液按1 : 1混勻后加入到其余各孔，每孔10 μ L。將384 孔板在500rpm下離心15s，使20 μ L試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并 將板放于室溫下繼續孵育60min。
[0025] (5)檢測：孵育時間到達后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設定好程序的Paradigm? Detection Platform上檢測。處理數據，確定最佳細胞數及Forskolin的ECS。。
[0026] 4.激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的ECS。：
[0027] (1)S1P1激動劑CS 2100使用DMS0配制成5mM儲備液，因 S1P1偶聯Ga i，需加入 Forskolin刺激cAMP產生。首先根據3. (5)中Forskolin的ECS。配制FSB，再用FSB逐級 稀釋為最終濃度的2倍。
[0028] (2)配制含最佳細胞數的溶液：用SB將細胞稀釋為3. (5)中得到的最佳細胞濃 度。
[0029] (3)加樣：將4. (1)中稀釋好的CS 2100溶液按每個濃度2個復孔，5 μ L每孔加入 384孔板中，再加入4孔每孔各5 μ L的SB，其中2孔作為CNC，另2孔作為non-stimulated contro 1 (NSC)。將4. (2)配制的細胞溶液按每孔5 μ L加入384孔板中。將384孔板在500rpm 下離心15s，使10 μ L試劑混合均勾以充分反應。為防止試劑蒸發造成損失，將TopSeal-A 膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育45min。
[0030] (4)按3.⑷配制終止試劑。向CNC中每孔加入10 μ L LB/anti-cAMP溶液（1 : 1)， 向NSC及其余各孔每孔加入10yL cAMP-d2/anti-cAMP溶液（1 : 1)。將384孔板在500rpm 下離心15s使20 μ L試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下 繼續孵育60min。
[0031 ] (5)孵育時間到達后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設定好程序的Beckman Paradigm上檢測。處理數據，確定CS 2100的EC5。及EC s。。
[0032] 5.拮抗劑驗證
[0033] (1) S1P1拮抗劑W146使用1Μ NaOH溶液配制成10mM儲備液，以SB逐級稀釋為最 終濃度的4倍。
[0034] (2)配制含最佳細胞數的溶液：用SB將細胞稀釋為3. (5)中得到的最佳細胞濃 度。
[0035] (3)加樣：將5. (1)中稀釋好的W146溶液按每個濃度2個復孔，2. 5 μ L每孔加入 384孔板中，再加入4孔每孔各5 μ L的SB，其中2孔作為CNC，另2孔作為NSC，再加入2孔 每孔各2.5 yL的SB，作為cell positive control (CPC)。將5. (2)配制的細胞溶液按每 孔5 μ L加入384孔板中。將384孔板在500rpm下離心15s，使7. 5 μ L試劑（CNC及NSC為 10 μ L)混合均勻以充分反應。為防止試劑蒸發造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板 放于室溫下使之孵育30min。
[0036] (4)根據 3. (5)中 Forskolin 的 ECS。配制 FSB，用 FSB 按 4. (5)中 CS 2100 的 EC 80配制CS 2100溶液。向CPC中加入FSB，每孔2.5 yL;其余各孔加入CS 2100溶液，每孔 2. 5 μ L ;CNC及NSC不加操作。將384孔板在500rpm下離心15s，使10 μ L試劑混合均勾以 充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續孵育45min。
[0037] (5)按3.⑷配制終止試劑。向CNC中每孔加入10 μ L LB/anti-cAMP溶液（1 : 1)， 向吧(：、0?(：及其余各孔每孔加入1(^1^〇41^-(12/^1^1-〇41^溶液（1:1)。將384孔板在 500rpm下離心15s使20 μ L試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于 室溫下繼續孵育60min。
[0038] (6)孵育時間到達后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設定好程序的Paradigm? Detection Platform上檢測。處理數據，確定詰抗劑的IC5。。
[0039] 6.采用摸索的最佳檢測條件在穩轉細胞中對鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑進行初 篩與復篩。處理數據，計算所篩選化合物IC5。。對篩選出的有效的化合物進行構效關系分 析。
[0040] 鞘氨醇-1-磷酸1受體活性篩選實驗結果
[0041 ] 篩選得到的鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑為獐芽菜苷化合物，其結構式與1(：5。如 下：
[0042]
[0043] 先導化合物對鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗活性：
【主權項】
1. 式（I)的化合物或其藥學上可以接受的鹽用于制備鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑的 用途；2. 按照權利要求1的用途，作為鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑，用于治療炎癥的用途。
【專利摘要】本發明涉及式(I)的鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑或其藥學上可接受的鹽。此類化合物可以拮抗鞘氨醇-1-磷酸1受體，有效地產生抗炎作用。
【IPC分類】A61K31/7048, A61P29/00
【公開號】CN105287615
【申請號】CN201510828310
【發明人】嚴明, 汪豪, 高鵬, 張陸勇
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月20日