鹽酸芐絲肼膽固醇逆轉運途徑的新用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，主要涉及鹽酸芐絲肼對逆膽固醇轉運途徑(RCT)兩個重要限速受體表達的影響，從而促進逆膽固醇轉運途徑(RCT)起到逆轉動脈粥樣硬化的作用。
【背景技術】
[0002]動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)已經成為人類死亡的重要原因，其中普遍認為高密度脂蛋白(HDL)具有抑制動脈粥樣硬化的作用，其主要通過其介導的逆膽固醇轉運途徑(RCT)來實現。
[0003]逆膽固醇轉運途徑(RCT)，主要通過由多種途徑促進巨噬細胞的膽固醇外流，并促進ApoA-1和HDL脂化，隨后成熟的HDL被轉運至肝臟進行排泄分泌進而阻礙動脈粥樣硬化。其中ATP結合盒轉運體Al (ABCAl)是主要負責巨噬泡沫細胞內膽固醇流出并形成HDL的途徑，但其他較低效率的外流途徑如被動流出也參與其中。ABCAl促進膽固醇和磷脂的單向流出成游離脂質或缺脂載脂蛋白，同時ABCAl也涉及在ApoA-1的脂化形成初期高密度脂蛋白(HDL)。ABCAl與細胞膽固醇外流至HDL聯系密切，其表達降低或突變將降低血漿HDL，膽固醇，膽固醇酯在細胞積聚從而導致高密度脂蛋白缺乏癥，同時在小鼠巨噬細胞超表達ABCAl發現主動脈動脈粥樣硬化斑塊發展被顯著抑制。
[0004]膽固醇外流成為游離膽固醇后再進行酯化，轉運最后成熟的HDL主要被肝臟SRBl攝取HDL中的膽固醇。大量數據表明SRBl是HDL代謝的一個具有決定性的調控因子，發現在SRBl基因敲除小鼠中SR-BI介導的肝臟攝取高密度脂蛋白膽固醇的攝取幾乎完全被阻塞，同時多篇文獻報道肝臟SRBl的表達對動脈粥樣硬化的抑制作用極有可能因為其作為逆膽固醇轉運最后一步的調控因子能夠潛在提高膽固醇流入肝臟。有實驗表明，在小鼠肝臟所表達的SRBl顯示了對調節RCT的重要的作用，肝臟SRBl的超表達可促進RCT的過程進而降低了動脈粥樣硬化，顯著的促進了肝臟攝取HDL膽固醇同時降低了血漿HDL膽固醇水平。
[0005]鹽酸芐絲肼為白色或類白色結晶粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮，其性質極不穩定，對溶劑PH、光線、溫度及濕度的變化極為敏感。鹽酸芐絲肼作為肼衍生物是一種氨基脲敏感的胺氧化酶(SSAO)抑制劑，它可在動脈，心臟脂肪組織及血液循環等中代謝芐胺從而可抑制SSAO活性。SSAO可將內源性胺及外源性物質轉換成更多的有毒代謝物，其參與發展內皮損傷、動脈斑塊形成等，與糖尿病、動脈粥樣硬化等心血管類疾病形成高度相關。
【發明內容】
[0006]本發明采用不同濃度的鹽酸芐絲肼作用于泡沫巨噬細胞及肝細胞模型，結果發現隨著鹽酸芐絲肼濃度變化，逆膽固醇轉運途徑(RCT)兩個關鍵限速受體ABCAl，SRBl表達均表現出濃度依賴性，尤其肝臟SRBl受體在鹽酸芐絲肼濃度為10 \ 10 8、10 9M時，表達量與模型組具有極顯著性差異，從而促進了逆膽固醇轉運途徑(RCT)最后一步。
[0007]下面是藥理學部分試驗及結果:
[0008]一、建立實驗細胞模型
[0009]取生長于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液的對數生長期人單核細胞THPl以I X 106細胞/孔的密度均勻接種于6孔培養板，經100ng/ml佛波酯(PMA)刺激72h后細胞貼壁并長出偽足即成功分化為人巨噬細胞，將細胞分別加入不同濃度oxLDL(0，25，50，100 μ g/ml)作用24h后進行油紅O染色及cell-based ELISA檢測。
[0010]取生長于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液的對數生長期正常肝細胞L02以I X 106細胞/孔的密度均勻接種于6孔培養板。培養24h細胞貼壁后，將細胞分別加入不同濃度 oxLDL (0，25，50，100 μ g/ml)作用 24h 后進行 cell-based ELISA 檢測。
[0011]二、給藥后巨噬細胞ABCAl進行cell-based ELISA檢測
[0012]取生長于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液的對數生長期人單核細胞THPl以I X 15細胞/孔的密度均勻接種于96孔培養板，經100ng/ml佛波酯(PMA)刺激72h后細胞貼壁并長出偽足即成功分化為人巨噬細胞，將細胞分為空白組、模型組、藥物組。除空白組外，其余組用100 μ g/ml濃度oxldl刺激作用24h后成為泡沫巨噬細胞，藥物組分別加入不同濃度鹽酸芐絲肼(10 6、10 1、10 8、10 9、10 10、10 11UO 12、10 13M)各100 μ 1，置于培養箱中培養。孵育24h后，棄培養液，洗滌干燥后進行cell-based ELISA檢測。
[0013]三、給藥后肝細胞SRBl進行cell-based ELISA檢測
[0014]取生長于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液的對數生長期正常肝細胞L02以I X 15細胞/孔的密度均勻接種于96孔培養板。培養24h細胞貼壁后，將細胞分為空白組、模型組、藥物組。除空白組外，其余組用100 μ g/ml濃度oxldl刺激作用24h后即成功建立動脈粥樣硬化肝細胞模型，藥物組分別加入不同濃度鹽酸芐絲肼(10 6、10 7UO 8UO 9、10 10、10 n、10 12、10 13M)各100 μ I，置于培養箱中培養。孵育24h后，棄培養液，洗滌干燥后進行 cell-based ELISA 檢測。
【附圖說明】
[0015]圖1是THPI細胞空白組油紅O染色圖。
[0016]圖2是THPl細胞加25 μ g/ml的oxLDL作用組油紅O染色圖。
[0017]圖3是THPl細胞加50 μ g/ml的oxLDL作用組油紅O染色圖。
[0018]圖4是THPl細胞加100 μ g/ml的oxLDL作用組油紅O染色圖。
[0019]圖 5 是 THPl 細胞分別加 0、25、50、100yg/ml 的 oxLDL 作用的 cell-based ELISA結果。
[0020]圖6是11)2細胞分別加0、25、50、10(^8/1111的 oxLDL 作用的 cell-based ELISA結果。
[0021]圖7是THPl細胞在100 μ g/ml的oxLDL作用造模后加不同濃度鹽酸芐絲肼(10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 n、10 12、10 13M)的 cell-based ELISA 結果。
[0022]圖8是L02細胞在100 μ g/ml的oxLDL作用造模后加不同濃度鹽酸芐絲肼(10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 n、10 12、10 13M)的 cell-based ELISA 結果。
【具體實施方式】
[0023]I)油紅O染色細胞經PBS洗滌一4%多聚甲醛固定10?20min_ — PBS洗滌一油紅O染色15min —水洗脫色一顯微鏡觀察
[0024]2) cell-based ELISA 檢測
[0025]細胞孵育24h后，棄培養液，洗滌干燥后4%多聚甲醛固定細胞20-30min，PBS/Triton X-100 漂洗 5minX 3 次，0.6% H202/PBS/Triton χ-100 孵育 20_30min 阻斷內源性過氧化物酶，PBS/Triton X-100 漂洗 5minX 3 次，10% BSA 于 37°C封閉 lh40min, 50ul5% BSA稀釋SRBl —抗4°C孵育過夜，PBS/Triton X-100漂洗5minX 3次，50ul5% BSA稀釋辣根過氧化物酶標記二抗于37°C孵育lh，PBS/Triton X-100漂洗5minX3次，PBS漂洗5minX3次，每孔加入200ulTMB顯色液于37°C避光顯色30min，加入50ul終止液IM稀H2SO4溶液終止反應，溶液顏色由藍變黃，加入終止液15min內用酶標儀在450nm波長處測定OD值。
【主權項】
1.鹽酸芐絲肼用于促進逆膽固醇轉運途徑的藥物用途。
【專利摘要】本發明公開了鹽酸芐絲肼促進了逆膽固醇轉運途徑(RCT)過程從而起到防治動脈粥樣硬化的作用。本發明通過建立泡沫巨噬細胞及動脈粥樣硬化條件下的肝細胞模型研究了鹽酸芐絲肼的對逆膽固醇轉運(RCT)過程中兩個至關重要的限速受體(ATP結合盒轉運體A1，清道夫受體B1)表達的影響，尤其對肝臟SRB1具有極顯著促進作用，進而促進了逆膽固醇轉運(RCT)最后一步，于動脈粥樣硬化疾病的防治作用具有極其重要的意義，此研究符合我國藥物現代化的發展方向，在基礎研究領域和應用研究領域內具有重要的社會意義和潛在的經濟效益。
【IPC分類】A61P9/10, A61K31/165
【公開號】CN105267192
【申請號】CN201510648410
【發明人】何書英, 方婷歡, 余新超
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年9月29日