一種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體及制備方法，屬于納微材料制備領域。
【背景技術】
[0002]傳統疫苗是滅活或低活性的病原體，在使用過程中存在安全隱患。新型疫苗(如DNA、蛋白質疫苗等)安全有效，但易被酶降解且免疫原性較弱，需要借助其他手段保護疫苗并刺激免疫應答。傳統疫苗佐劑對這些抗原無效，因此急待開發新型疫苗載體。
[0003]鋁鹽是第一個被批準可用于人的佐劑。鋁鹽佐劑(Al (OH)3)能有效刺激B細胞介導的體液免疫反應，但其具體作用機制尚不清楚。通常認為是氫氧化鋁溶膠對疫苗的緩釋作用以及氫氧化鋁本身對巨噬細胞的刺激作用。有研究者認為氫氧化鋁對巨噬細胞的刺激作用歸根于Al (III)。因此，基于Al (III)且具有抗原緩釋作用的疫苗載體將可能有效的刺激體液免疫反應。
[0004]然而，鋁鹽佐劑對細胞免疫無效，不能作為細胞病原體疫苗的佐劑，例如HIV、瘧疾和肺結核等疾病的疫苗。此外，鋁鹽佐劑與高純度蛋白質抗原使用時抗體應答反應較弱。因此，設計制備新型的疫苗佐劑，實現蛋白質疫苗體內高效呈遞仍是一項艱巨的任務。微顆粒型佐劑(0.1?ΙΟμπι)模仿了細菌和病毒的尺寸，能與樹突狀細胞相互作用，從而活化樹突狀細胞并提高抗原的細胞呈遞。目前，基于Al(III)與鞣酸的配位作用制備微囊型蛋白質疫苗載體的研究還未見報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體。
[0006]本發明的第二個目的是提供一種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的制備方法。
[0007]本發明的技術方案概述如下:
[0008]—種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0009](I)將蛋白質模擬抗原加入到10mL、0.2?0.5M碳酸鈉水溶液中，使模擬抗原濃度為0.5?5mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙稀磺酸鈉的濃度為I?6mg/mL，氯化I丐的濃度為0.2?0.5M，攪拌20?60s，離心，去離子水洗2?4次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；
[0010](2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入
0.5?1.5mL、8?24mM的鞣酸水溶液，振蕩使分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，振蕩使分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3-(N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調節pH為8.0，振蕩I?5min，離心，顆粒用去離子水洗2?4次，用20?40mL、pH =8.0的EDTA水溶液洗滌3?5次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體。
[0011]蛋白質模擬抗原優選雞卵清白蛋白。
[0012]上述方法制備的pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體。
[0013]本發明的pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體直徑4±0.5 μ m，厚度約17±2nm，雞卵清白蛋白包埋于微囊空腔內。由于Al(III)與鞣酸配位鍵受pH影響，使得微囊具有pH響應性。本發明制備過程在室溫水相下進行，條件溫和，保證了蛋白質疫苗的活性及載體的使用安全性；原料廉價易得，制備工藝簡單易行。
【附圖說明】
[0014]圖1為實施例1所制得的pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的掃描電子顯微鏡照片。
[0015]圖2為實施例1所制得的pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的透射電子顯微鏡照片。
[0016]圖3為實施例1所制得的pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的元素能譜圖。
[0017]圖4為實施例1所制得的pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的原子力顯微鏡照片及其高度差圖。其中A為原子力顯微鏡照片；B為高度差圖。
[0018]圖5為實施例2所制得的pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體在不同pH下雞卵清白蛋白的釋放曲線。
[0019]實施方式
[0020]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0021]實施例1
[0022]—種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0023](I)將10mL、0.33M碳酸鈉水溶液倒入等體積含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙烯磺酸鈉的濃度為2mg/mL，氯化鈣的濃度為0.33M，攪拌30s，離心，去離子水洗3次，得到碳酸鈣顆粒；
[0024](2)將步驟⑴獲得的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入lmL、24mM的鞣酸水溶液并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3- (N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調節PH為8.0，并在漩渦儀上振蕩lmin，離心，顆粒用去離子水洗3次，用40mL、pH = 8.0的EDTA水溶液洗滌3次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到一種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的制備方法。
[0025]見圖1、2、3 和 4。
[0026]實施例2
[0027]—種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0028](I)將蛋白質模擬抗原-雞卵清白蛋白加入到10mL、0.33M碳酸鈉水溶液中，使雞卵清白蛋白濃度為2mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙烯磺酸鈉的濃度為2mg/mL，氯化鈣的濃度為0.33M，攪拌30s，離心，去離子水洗3次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；
[0029](2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入lmL、24mM的鞣酸水溶液，振蕩1s使其分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3- (N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調節PH為8.0，并在漩渦儀上振蕩lmin，離心，顆粒用去離子水洗3次，用40mL、pH = 8.0的EDTA水溶液洗滌3次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體。
[0030]實施例3
[0031]—種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0032](I)將蛋白質模擬抗原-雞卵清白蛋白加入到10mL、0.2M碳酸鈉水溶液中，使雞卵清白蛋白濃度為0.5mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙烯磺酸鈉的濃度為lmg/mL，氯化鈣的濃度為0.2M，攪拌20s，離心，去離子水洗2次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；
[0033](2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入
0.5mL、12mM的鞣酸水溶液，振蕩1s使其分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3- (N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調節PH為8.0，并在漩渦儀上振蕩3min，離心，顆粒用去離子水洗2次，用20mL、pH = 8.0的EDTA水溶液洗滌4次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體。
[0034]實施例4
[0035]—種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0036](I)將蛋白質模擬抗原-雞卵清白蛋白加入到10mL、0.5M碳酸鈉水溶液中，使雞卵清白蛋白濃度為5mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙稀磺酸鈉的濃度為6mg/mL，氯化I丐的濃度為0.5M，攪拌60s，離心，去離子水洗4次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；
[0037](2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入
1.5mL、8mM的鞣酸水溶液，振蕩1s使其分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3- (N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調節PH為8.0，并在漩渦儀上振蕩5min，離心，顆粒用去離子水洗4次，用30mL、pH = 8.0的EDTA水溶液洗滌5次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體。
[0038]實施例5
[0039]將實施例2制備的一種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體分散于10mL，pH分別為5.0、6.0、7.4且濃度為1mM的磷酸鹽緩沖溶液中，放置于37°C、200rpm的震蕩培養箱中并開始計時，每隔一定時間，將樣品離心并分別取出5mL的上清液，之后再分別加入5mL新鮮配置的不同PH的磷酸鹽緩沖溶液，并再次放置于37°C、200rpm的震蕩培養箱中。用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白濃度并計算出釋放了的蛋白總量，即蛋白累積釋放量，蛋白釋放率=(蛋白累積釋放量/載體中蛋白總量)*100%。
[0040]見圖5。
【主權項】
1.一種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體的制備方法，其特征在于包括如下步驟:(1)將蛋白質模擬抗原加入到10mL、0.2?0.5M碳酸鈉水溶液中，使模擬抗原濃度為0.5?5mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙稀磺酸鈉的濃度為I?6mg/mL，氯化I丐的濃度為0.2?0.5M，攪拌20?60s，離心，去離子水洗2?4次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒； (2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入0.5?1.5mL、8?24mM的鞣酸水溶液，振蕩使分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，振蕩使分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3-(N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調節pH為8.0，振蕩I?5min，離心，顆粒用去離子水洗2?4次，用20?40mL、pH =8.0的EDTA水溶液洗滌3?5次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體。2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述蛋白質模擬抗原為雞卵清白蛋白。3.權利要求1或2的方法制備的pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體。
【專利摘要】一種pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體及制備方法，制備方法為：(1)將蛋白質模擬抗原加入到碳酸鈉水溶液中，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，攪拌，離心，去離子水洗，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；(2)將含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于去離子水中，加入鞣酸水溶液，振蕩使分散均勻，加入氯化鋁水溶液，振蕩使分散均勻，加入3-(N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調節pH，振蕩，離心，顆粒用去離子水洗，用EDTA水溶液洗滌，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應性微囊型蛋白質疫苗載體。本發明制備過程在室溫水相下進行，條件溫和，保證了蛋白質疫苗的活性及載體使用安全性；原料廉價易得，制備工藝簡單。
【IPC分類】A61P37/04, A61K47/48, A61K39/39
【公開號】CN105214100
【申請號】CN201510785244
【發明人】王曉莉, 孫洪范, 張超, 繆丹丹
【申請人】中國醫學科學院生物醫學工程研究所
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年11月16日