一種復合式牙科種植體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及牙科種植體，具體涉及一種復合式牙科種植體.
【背景技術】
[0002] 隨著種植技術發展，牙科種植體已廣泛應用于臨床的牙列缺損及缺失病人的修 復。但是對于一些骨質疏松癥、糖尿病、以及放療之后的患者，由于存在成骨活性下降，血供 較差，破骨活躍等一系列問題，因此這些疾病往往伴隨著種植術后的骨愈合不良、失敗率較 高等問題。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的一方面是提供一種復合式種植體，該復合式種植體包括中心種植 體，所述的中心種植體外包覆有antimiR-138修飾的BMSC膜片。
[0004] 可選的，所述中心種植體為微弧氧化純鈦種植體、酸蝕+噴砂種純鈦植體或羥基 磷灰石等離子噴涂純鈦種植體。
[0005] 可選的，所述微弧氧化的電解液溶質包括P _甘油磷酸鈉和醋酸鈣。
[0006] 本發明的復合種植體不但具有成骨效應，而且發明人意外發現其同時具有顯著的 成血管效應，即該復合種植體在植入體內后可協同發揮促成骨和成血管效應。
【附圖說明】
[0007] 圖1為微弧氧化鈦種植體及BMSC膜片/種植體復合物的掃描電鏡觀察；其 中：antimiR-138為實驗組：antimiR-138修飾的BMSC膜片/微弧氧化鈦種植體復合物； antimiR-control為陰性對照組：antimiR_control修飾的BMSC膜片/種植體復合物；No agent為空白對照組：未經轉染修飾的BMSC膜片/種植體復合物。
[0008] 圖2為體外成骨誘導3天，7天后對各組膜片種植體復合物中內源性miR-138 含量的miRNA-PCR檢測，林，林*p〈0. 01，0? 001表示與空白對照組比有統計學差異； #，###p〈〇. 05, 0. 001表示與陰性對照組比有統計學差異。
[0009] 圖3為體外成骨誘導7天后，各組成骨相關蛋白ALP, OCN和RUNX2的westernblot 分析，***p〈0. 001表示與空白對照組比有統計學差異。
[0010] 圖4為體外成骨誘導7天后，各組成血管相關蛋白OSX和VEGF的westernblot分 析，**，***p〈〇. 01，0. 001表示與空白對照組比有統計學差異。
[0011] 圖5為antimiR-138修飾的BMSC膜片/微弧氧化鈦種植體復合物裸鼠體內移植8 周的HE，MT染色觀察，其中NB代表新生骨，CT代表纖維結締組織，黑色箭頭指示骨細胞， 黃色箭頭指示成骨細胞，紅色星號代表新生血管。
[0012] 圖6為antimiR-138修飾的BMSC膜片/微弧氧化鈦種植體復合物裸鼠體內移植 8周后，各組成骨和成血管相關蛋白的免疫熒光染色分析。
【具體實施方式】
[0013] 以下是發明人提供的具體實施例，以對本發明的技術方案作進一步解釋說明。
[0014] 實施例1 :
[0015] 步驟一，微弧氧化（MO)純鈦種植體的制備
[0016] 純鈦種植體基體拋光后依次經丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗并干燥；
[0017] 采用微弧氧化工藝在種植體基體表面制備微弧氧化涂層，再依次用丙酮、無水乙 醇和去離子水超聲清洗并吹干，最后將試樣密封包裝后，c〇60輻照消毒；其中微弧氧化工 藝中，電解液溶質由〇. 02-0. 04M P -甘油磷酸鈉和0. 2M醋酸鈣配制，溶劑為去離子水；反應 條件為300-450V電壓、100-120HZ電源頻率，20% -25%占空比，處理時間為5-10min。
[0018] 步驟二，antimiR-138修飾的BMSC膜片的構建
[0019] 具體方法可參見公開發表的文章 Feasibility of non-viral oligonucleotide delivery to the cell sheets and enhanced osteogenesis of the mesenchymal stem cell sheets by antimiR-138. Biomaterials, 2014；35:7734-7749.
[0020] 步驟三，antimiR-138修飾的BMSC膜片/微弧氧化鈦種植體復合物的構建
[0021] 待膜片成熟后，利用antimiR-138修飾的BMSC膜片包覆微弧氧化鈦種植體構建 antimiR-138修飾的BMSC膜片/種植體復合體。
[0022] 發明人對該實施例的復合式種植體進行了以下相關實驗：
[0023] (1)膜片/種植體復合物的掃描電鏡觀察
[0024] 將膜片/種植體復合物繼續培養48小時，常規脫水后噴金，場發射掃描電鏡觀察 膜片/種植體復合物的微觀形態。
[0025] (2) antimiR-138修飾的BMSC膜片/種植體復合物的miRNA基因沉默的鑒定
[0026] 膜片與種植體復合后體外成骨誘導3天、7天，并采用miRNA-qPCR的方法對各組內 源性miR-138的沉默效應進行檢測。
[0027] (3)成骨、成血管相關蛋白的westernblot檢測
[0028] 膜片成骨誘導7d后終止培養，PBS清洗3次后進行總蛋白的提取，采用Western blot方法分析成骨、成血管相關蛋白（RUNX2，ALP，0CN，0SX，VEGF)的表達。
[0029] (4) antimiR-138修飾的BMSC膜片/微弧氧化鈦種植體復合物的體內成骨實驗
[0030] 將三組BMSC膜片/種植體復合體植入裸鼠體內，8周后取材，并對移植 復合物進行常規組織切片，和Masson三色染色，以及成骨、成血管相關蛋白 (RUNX2, 0CN，0SX，VEGF，CD31)的免疫熒光分析。
[0031] 實驗結果：
[0032] (1)種植體試樣以及BMSC膜片/種植體復合物的掃描電鏡觀察
[0033] 圖1所示，種植體試樣經過微弧氧化（MO)處理后，其表面可形成如火山口樣，均 勻分布的多孔狀結構。膜片與種植體復合后48h的掃描電鏡觀察顯示：大量膠原纖維與富 含胞外基質的細胞相互連接形成一層網狀結構，并緊密貼附在種植體微弧氧化的多孔結構 表面。高倍可見細胞形態伸展，并有大量的偽足伸出嵌合在豐富的胞外基質中。且實驗組 與對照組膜片/種植體復合物形態結構無明顯差異。
[0034] (2) BMSC膜片/微弧氧化鈦種植體復合物內源性miR-138的基因沉默的鑒定
[0035] 圖2所示，膜片與種植體復合后體外成骨誘導3天、7天，并對其內源性miR-138的 含量應進行檢測，結果如圖2.所示，成骨誘導3天時，相對與空白對照組，轉染復合物對實 驗組膜片中miR-138的抑制率為94. 7%，成骨誘導7天時其抑制率仍保持在53. 5%，即轉 染復合物對膜片種植體復合物中內源性miR-138的抑制具有長時的效應。
[0036] (3)成骨、成血管相關蛋白的表達
[0037] 成骨誘導7天后，對各組成骨、成血管相關蛋白的表達進行westernblot分析，得 到圖3、圖4的結果，實驗組成骨、成血管相關蛋白（冊似2，1^，0^03乂和￥￡6?)的表達顯 著高于兩對照組。
[0038] (4) antimiR-138修飾的BMSC膜片/微弧氧化鈦種植體復合物的體內移植結果
[0039] 如圖5所示，8周時，三組的種植體表面均可見血管組織再生，且未見明顯的炎癥 反應。實驗組種植體周圍可觀察到廣泛致密且礦化良好的成熟骨組織（如圖5中的MT染 色），新骨內可觀察到典型的骨陷窩、骨細胞和骨襯里細胞并伴有血管生成，其骨生成方式 主要以軟骨內骨化為主。而對照兩組種植體周圍的新骨生成量明顯少于實驗組，且新骨礦 化程度不高，同時仍伴有一些纖維結締組織修復。
[0040] 對8周取材的移植物的成骨、成血管相關蛋白RUNX2, OCN，OSX，VEGF，⑶31進行免 疫熒光染色，結果如圖6所示，在新骨形成區域，實驗組成骨相關蛋白OCN、RUNX2、OSX和成 血管相關蛋白VEGF，CD31均為強陽性表達，而空白對照組和陰性對照組表達較弱或為陰性 表達。
[0041] 實施例2:
[0042] 該實施例與實施例1不同的是中心種植體是酸蝕+噴砂種純鈦植體，該種植體市 售型號為ITI⑩，Swiss。
[0043] 實施例3 :
[0044] 該實施例與實施例1不同的是中心種植體是羥基磷灰石等離子噴涂純鈦種植體， 該種植體市售型號為H:1?，Swiss;BEG0SEMADOS?，Germany。
【主權項】
1. 一種復合式牙科種植體，其特征在于，該復合式種植體包括中心種植體，所述的中心 種植體外包覆有antimiR-138修飾的BMSC膜片。2. 如權利要求1所述的復合式牙科種植體，其特征在于，所述中心種植體為微弧氧化 純鈦種植體、酸蝕噴砂種純鈦植體或羥基磷灰石等離子噴涂純鈦種植體。3. 如權利要求2所述的復合式牙科種植體，其特征在于，所述微弧氧化的電解液溶質 包括(6-甘油磷酸鈉和醋酸鈣。
【專利摘要】本發明涉及一種復合式牙科種植體。所涉及的復合式種植體包括中心種植體，所述的中心種植體外包覆有antimiR-138修飾的BMSC膜片。可選的，所述中心種植體為微弧氧化純鈦種植體、酸蝕噴砂種純鈦植體或羥基磷灰石等離子噴涂純鈦種植體。本發明的復合種植體不但具有成骨效應，而且發明人意外發現其同時具有顯著的成血管效應，即該復合種植體在植入體內后可協同發揮促成骨和成血管效應。
【IPC分類】A61K6/04, A61K6/02, A61K6/033
【公開號】CN105193633
【申請號】CN201510555713
【發明人】閆鈞, 張玉梅, 趙領洲, 常蓓, 宋文
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫大學
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月2日