Deacetylpurpurin在制備治療人神經膠質瘤藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及化合物Deacetylpurpurin的新用途，具體涉及Deacetylpurpurin在 制備治療人神經膠質瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] Lynette Bueno Perez等人首次分離純化出化合物Deacetylpurpurin，并將成果 發表在著名天然產物雜志 Journal of Natural Product 上（Bioactive Constituents of Indigofera spicata，J. Nat. Prod.，2013, 76,1498-1504)〇
[0003] 目前尚未有該化合物關于人神經膠質瘤的活性報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種Deacetylpurpurin的醫藥用途。
[0005] 上述目的是通過如下技術方案實現的：
[0006] Deacetylpurpurin在制備治療人神經膠質瘤藥物中的應用，所述 Deacetylpurpurin化學結構式如下，
·'〇
[0008] 進一步地，所述人神經膠質瘤為U251人神經膠質瘤。
【具體實施方式】
[0009] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容。
[0010] 實施例1 :Deacetylpurpurin的分離制備及結構確證
[0011] Deacetylpurpurin的制備方法同文獻報道的制備方法（Bioactive Constituents of Indigofera spicata，J. Nat. Prod·，2013, 76,1498-1504) 〇
[0012] 結構確證：黃色無定形粉末，HR-ES頂S顯示[M+Na]+為m/z 375. 1197,結合核磁 特征可得分子式為C21H2qO5，不飽和度為12。核磁共振氫譜數據δ H(ppm，DMS0-d6,600MHz): Η-2 (5· 59, dd，J = 12. 8, 3· 0)，Η-3 (2· 94, dd，J = 16. 9, 3. I)，Η-3 (2· 98, dd，J = 16. 9， 12. 9)，Η-5(7· 91，d，J = 8· 5)，Η-6(6· 60, d，J = 8· 5)，H-2' 一6'（7· 41，m)，H-2"（6· 53， d，J = 6·4)，Η-5"（4. 19，s)，H-6"（3.91，m)，4"-Me(L09，s)，4"-Me(1.35，s);核磁共振碳 譜數據 Sc(ppm，DMS0-d6,600Hz) :79.8(CH，2-C)，44. 1(CH2,3-C)，189.7(C，4-C)，114.3(C， 4a-C)，129. 8 (CH，5-C)，106. I (CH，6-C)，165. 3 (C，7-C)，114. I (C，8-C)，158. I (C，8a-C)， 139. 2(C，Γ -C)，126. 2(CH，2'，6' -C)，129. 0(CH，3'，5' -C)，129. 3(CH，4' -C)，112. 4(CH， 2" -C)，87. 8 (C，4" -C)，80. 5 (CH，5" -C)，55. I (CH，6 '，-C)，22. 8 (CH3, 4" -Me)，27. I (CH3， 4"-Me)。結構確證數據與文獻報道一致，因此可以確定本發明制備的化合物即為文獻報道 的 Deacetylpurpurin。
[0013] 實施例2 :Deacetylpurpurin的藥理作用試驗
[0014] -、材料和儀器
[0015] 人神經膠質瘤細胞株U251購自于上海麥莎生物科技有限公司。實驗動物裸鼠，購 自南方醫科大學實驗動物中心，為4~6周齡的雄性BALB/c，nu/nu小鼠，體質量12~15g。 Deacetylpurpurin自制（含量98%以上）。5-氟尿啼啶購于南通制藥廠。胰蛋白酶購于 美國Amresco公司。不完全DMEM培養基購于GibeoBRL公司。胎牛血清購于杭州四季青公 司。十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、過硫酸胺、甘油、二甲基亞礬購于Sigma公司。蛋白酶 K(Merka公司）。P-琉基乙醇（廣州威佳公司）。苯甲基磺酞氟（廣州威佳公司）。亮抑酶 膚（廣州威佳公司）。抑蛋白酶膚（廣州威佳公司）。
[0016] 光學顯微鏡（OLYMPUSBxsl，日本）。Olympus數碼相機（Olympus D70,日本）。顯 微攝影系統（CoolSNAP-Pro of monoehrome，美國）。PL 303型電子天平（梅特勒-托利 多儀器有限公司）。6219型電子pH計（上海任氏電子有限公司）。3K30高速低溫離心機 (sigma 公司）。HoferMiniVE 型 western 電泳印記系統（美國 Amersham 公司）。SYC_2101 水平搖床（南京暢翔儀器設備有限責任公司）。。高速臺式離心機（珠海黑馬醫學儀器有 限公司）。微型電泳及電轉移系統（美國BIO-RAD公司）。三氣細胞培養箱1750型（法國 Jouan公司）。M0DEL5410純水器Milli-Q plus型（法國Millipore公司）。隔水式電熱恒 溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）。SHff-I型恒溫磁力攪拌器（杭州儀表電機廠）。YG-875B 超凈工作臺（蘇州醫療設備廠）。連續波長酶標儀（Benchnlark Plus TM，Bio-RAD公司）。 倒置顯微鏡（日本Nicon公司）。全自動滅菌鍋（日本sanyo公司）。臺式低溫高速離心機 (Bechman公司）。電泳儀（PowerPAL3000, Bio-RAD公司）。DU640型紫外分光光度計（美 國 Beeklllan 公司）。
[0017] 二、試驗方法
[0018] 1、細胞培養
[0019] 人神經膠質瘤U251細胞以常規方法復蘇后使用DMEM培養基（含10% FBS)培養。 細胞以60_的培養皿培養，加入3mLDMEM完全培養基。細胞長至80 %融合時，以HankS平 衡鹽溶液（HBSS)沖洗兩遍，改以不含血清的DMEM培養至藥物處理前。
[0020] 2、Deacetylpurpurin 的處理
[0021] Deacetylpurpurin先以DMSO 0· ImL溶解后均勾分散于DMEM不完全培養基中。最 終處理細胞的Deacetylpurpurin濃度為100, 500,1500 μ mol/L，處理Ih后繼續予以缺氧培 養。
[0022] 3、Deacetylpurpurin體外抑制細胞增殖實驗
[0023] 文獻報道Deacetylpurpurin在50 μ mol/L濃度范圍內，對SMMe7721細胞既無顯 著的生長抑制，也不顯著增加流式細胞儀檢測中的凋亡率。本研究選擇0-200 ymol/L濃度 的Deacetylpurpurin進行實驗。在96孔板中分別加入不同濃度DeacetylpurpurinlOO μ L， 使藥物終濃度為 5 μ mol/L、10 μ mol/L、25 μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、200 μ mol/L，每 濃度設6個復孔，陽性藥對照組加入5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU) 10 μ g/ml，對照孔 加入等體積DMEM培養液。細胞株常規培養后取指數生長期細胞用完全DMEM培養基調整至 (1-2) X IO5個/mL，每孔接種細胞懸液100 μ L。培養48h后，以MTT法檢測細胞增殖程度，每 孔加入2. 5mg/mLMTT20 μ L，繼續培養4h，離心后小心棄去培養液，每孔加入150 μ L DMS0， 在震蕩器上震蕩IOmin后于酶標儀中以570nm波長檢測，測定各孔的光密度值（OD)，抑制率 按下列公式計算：抑制率（％) = (1-加藥孔平均OD值/對照孔平均OD值）X 100%。
[0024] 4、Deacetylpurpurin體內抑制裸小鼠 U251移植性肉瘤生長實驗
[0025] 體外培養的U251細胞擴大培養后，選擇生長最佳狀態的細胞培養體系，離心，用 生理鹽水按體積比1:3(腫瘤細胞：生理鹽水）稀釋混勻。用ImL-次性注射器吸取上 述細胞懸液〇. 15mL，穿過小鼠右后肢大腿肌肉接種于腹股溝皮下，然后隨機分為空白組 (Untreated，等容積 NS)、溶劑對照組（vehide，等容積 NS+DMS0)、Deacetylpurpurin L 0， 2. Ommol/kg腹腔注射組，每組6只，按0· lmL/10g體重給藥，環磷酞胺（Cyelophosphamide， CTX)陽性對照組為0.02g/kg體重腹腔注射給藥。一天一次，連續給藥IOd后處死小鼠，分 離腫瘤稱重。抑瘤率（％) = (1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重）X 100%。
[0026] 5、統計分析
[0027] 采用SPSS13. 0統計分析軟件，數據以?± 5表示，經one-way ANOVA (多重比較用 LSD法）、t-test進行統計學檢驗，具體見各數據表格和圖表，以P < 0. 05定為差異有統計 學意義。
[0028] 三、結果及結論
[0029] 1、Deacetylpurpurin單藥處理對U251細胞增殖的影響
[0030] 用MTT檢測法檢測各孔在570nm下的吸光度值（optieal density，0D57。），以此反 映 U251細胞增殖的活性。各組OD57。值經方差齊性檢驗，P = 0. 460,說明方差齊性；經單向 方差分析，F = 57. 577，P = 0· 121，說明組間差異沒有統計學意義。提示Deacetylpurpurin 體外在< 200 μ mol/L給藥濃度下對U251細胞的增殖沒有抑制作用。結果見表1 (one-way AN0VA:P = 0. 121 ^ 0. 05) 〇
[0031] 2、Deacetylpurpurin單藥處理對荷瘤小鼠的抑瘤作用
[0032] 各組瘤重值經方差齊性檢驗，F = 1.903, P = 0. 141，說明方差齊性；經單向 方差分析，F = 17. 931，P = 0. 000,說明組間差異有統計意義，需進一步用LSD檢驗法 比較。Deacetylpurpurin劑量為I. 0,2. 0mmol/kg腹腔注射組的處理組與溶劑對照組 (Vehiele)比較，P值分別為：0.000,0.000,說明差異有統計學意義，提示通過腹腔注射給 藥，Deacetylpurpurin對荷U251作用，抑瘤作用有隨劑量增加而增強的趨勢。結果見表 2 (LSD test :*P^i0.05vs Vehicle group)。
[0033] 結論，Deacetylpurpurin單藥處理對U251細胞增殖作用的實驗結果表明， Deacety lpurpur in體外對U251細胞的增殖沒有抑制作用，說明在一定劑量范圍內的 Deacetylpurpurin處理對腫瘤細胞的生長沒有明顯的影響，提示Deacetylpurpurin對 U251細胞沒有直接的細胞毒或誘導細胞凋亡作用。而在Deacetylpurpurin對荷U251實體 瘤裸小鼠的抑瘤作用實驗中，發現Deacetylpurpurin劑量為1.0 ，2. Ommol/kg時，對荷U251 實體瘤裸小鼠表現出一定的抑瘤作用，且抑瘤作用隨劑量增加而增強。結合上述實驗結果， 說明Deacetylpurpurin具有一定的抗U251腫瘤作用，其作用是通過細胞毒或者誘導凋亡 以外的某種機制來實現的。
[0034] 表1 Deacetylpurpurin對U251人神經膠質瘤細胞體外增殖的作用（η = 6，：x±s)
【主權項】
1. Deacetylpurpurin在制備治療人神經膠質瘤藥物中的應用，所述 Deacetylpurpurin化學結構式如下，2. 根據權利要求1所述的Deacetylpurpurin在制備治療人神經膠質瘤藥物中的應用， 其特征在于：所述人神經膠質瘤為U251人神經膠質瘤。
【專利摘要】本發明公開了Deacetylpurpurin在制備治療人神經膠質瘤藥物中的應用，屬于藥物領域。體外試驗證明，Deacetylpurpurin具有一定的抗U251腫瘤作用，其作用是通過細胞毒或者誘導凋亡以外的某種機制來實現的。Deacetylpurpurin可以進一步研究開發成制備治療人神經膠質瘤的藥物。
【IPC分類】A61K31/352, A61P35/00
【公開號】CN105125534
【申請號】CN201510540890
【發明人】林天樣
【申請人】林天樣
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月28日