高負載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物制備和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及納米藥物，具體涉及一種高負載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物及其制備方法，以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]癌癥嚴重危害著人類的生命健康，其發病率和死亡率在全世界范圍內僅次于心臟病和傳染疾病。目前，癌癥的主要治療手段有手術切除、放射療法和化學療法三種。如果腫瘤只在某個局部范圍內生長或發現時間較早，適合采用手術切除和放射療法這兩種治療手段。但是，通常病人發現腫瘤的時候己經處于癌癥中晚期，且常常伴隨著病灶轉移和擴散的跡象，這種情況下化學療法才是病人存活的唯一希望。傳統的化學療法是通過口服或靜脈注射抗癌藥物(如阿霉素、喜樹堿、紫杉醇、順鈾等，使這些抗癌藥物經血液循環系統到達腫瘤部位，以此殺死癌細胞。然而，這些臨床中使用的抗癌藥物通常具有很強的細胞毒性，并且缺乏特異識別性，在殺死癌細胞的同時，也會殺死正常的組織細胞。此外，化學療法還存在藥物生物利用率低的缺點，具體表現為癌細胞對藥物的攝入效率較低，藥物在血液循環過程中難以跨過生理障礙到達腫瘤部位。這些問題都不同程度地限制了抗癌藥物的使用劑量和應用范圍，阻礙了化學療法在癌癥治療中的應用，亟待人們的解決。
[0003]納米材料由于具有獨特的尺寸優勢，靶向功能，可跨越生理屏障，多功能性，能增溶疏水性藥物，可提高藥物的穩定性，對藥物的可控釋放，降低藥物的毒副作用等化學和物理特性，使其在藥物傳輸方面具有很多優越性，受到了材料科學家和臨床醫生的重視并得到了廣泛的研究。納米鉆石因其具有低毒性、高生物相容性和表面易修飾特性，將其作為載體制備納米藥物時受到了眾多研究者的青睞。PEG在水溶液和一些溶劑中具有極好的溶解性，無毒且具有低的免疫原性，這使其制備過程具有靈活性且在制備腫瘤藥物中得到了廣泛應用。基于此，本文以H2N-PEG-COOH修飾納米鉆石，在檸檬酸鈉或醋酸鈉作用下物理吸附化療藥物阿霉素制備得到高負載及PH控釋的納米藥物，并研究了該種藥物的抗腫瘤活性。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種高負載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物及其制備方法，以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0005]本發明提供的一種高負載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物的制備方法，包括如下步驟:
[0006](I)取真空干燥的羧基化納米鉆石，按每毫克羧基化納米鉆石加入1-1.5mL的濃度為0.1M、pH為5.8的MES緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，再按每毫克羧基化納米鉆石加入0.2mg EDC, 0.25mg NHS，室溫攪拌反應6h，反應完畢后以15000rpm高速離心5min棄除上清液，得到活化羧基的納米鉆石沉淀物；接著將活化羧基的納米鉆石沉淀物迅速分散到濃度為0.1Μ、ρΗ為8.4的硼酸緩沖溶液中，經過短暫超聲分散形成懸濁液，再按每毫克活化的羧基化納米鉆石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，繼續室溫攪拌反應12h，待反應結束，以15000rpm高速離心5min吸除上清液，并用0.1Μ、ρΗ 8.4的硼酸緩沖溶液高速離心洗滌三次，獲得納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)沉淀物；
[0007](2)取真空干燥的納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH) lmg,按每毫克ND-PEG-C00H加入l_1.5mL檸檬酸鈉(Na3Cit, 1.0M)溶液，超聲分散I小時形成懸濁液，再按每毫克ND-PEG-C00H加入0.1-0.2mg阿霉素(DOX)，避光于搖勻儀上反應6小時，待反應完畢，以15000rpm高速離心5min收集上清液，并用1.0M朽1檬酸鈉(Na3Cit)繼續以15000rpm高速離心5min洗滌三次，制得納米鉆石-聚乙二醇-阿霉素/檸檬酸鈉(ND-PEG-D0X/Na3Cit)納米藥物，真空干燥，冷藏，避光保存。
[0008]所述的檸檬酸鈉可以用醋酸鈉替代。
[0009]上述制備的高負載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物可以在制備抗腫瘤藥物中應用。
[0010]與現有技術相比本發明的有益效果:本發明選用的納米鉆石材料具有生物相容性好、無毒、化學性質穩定、表面易修飾等諸多優點；PEG因其在水溶液和一些溶劑中具有極好的溶解性、無毒且具有低的免疫原性等優勢，使制備過程具有靈活性。與本實驗室前期研究相比較，本文發明的納米藥物其載藥量比之高了 5-6倍，且在腫瘤環境中的釋藥率高達到80%，而在正常組織環境中卻相對穩定，釋藥率僅為7%，這均比前期研究略勝一籌。通過納米載體ND-PEG與人肝癌細胞0fepG2)、人宮頸癌細胞(HeLa)、人乳腺癌細胞(MCF-7)作用，表明ND-PEG載體具有生物兼容性；將納米載體納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG)在檸檬酸鈉或醋酸鈉作用下，物理吸附阿霉素，制備得到ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG_D0X/NaAc納米藥物，通過流式細胞儀檢測細胞攝取ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG_D0X/NaAc實驗，表明ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG_D0X/NaAc均可以進入細胞，從而誘導細胞凋亡，經MTT實驗檢測藥物對細胞的活性，表明該納米藥物不僅可以降低化療藥物對正常細胞的毒副作用，而且能提高化療藥物對腫瘤細胞的殺傷力，所以ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc可在制備抗腫瘤藥物中應用。
【附圖說明】
[0011]圖1各種納米顆粒的紅外光譜圖
[0012]圖2A不同pH對納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit體外釋藥的影響
[0013]圖2B不同pH對納米藥物ND-PEG-D0X/NaAc體外釋藥的影響
[0014]圖3A用流式細胞儀檢測MCF-7細胞的散點圖
[0015]圖3B用流式細胞儀檢測MCF-7細胞攝取ND_PEG_D0X/Na3Cit的散點圖
[0016]圖3C用流式細胞儀檢測MCF-7細胞攝取ND-PEG_D0X/NaAc的散點圖
[0017]圖4A用流式細胞儀檢測MCF-7細胞的熒光強度圖
[0018]圖4B用流式細胞儀檢測MCF-7細胞攝取ND_PEG_D0X/Na3Cit的熒光強度圖
[0019]圖4C用流式細胞儀檢測MCF-7細胞攝取ND-PEG_D0X/NaAc的熒光強度圖
[0020]圖5A不同濃度的納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對體外培養H印G2細胞活性的影響
[0021]圖5B不同濃度的納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對體外培養HeLa細胞活性的影響
[0022]圖5C不同濃度的納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對體外培養MCF-7細胞活性的影響
[0023]圖6A納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對體外培養不同時間HepG2細胞活性的影響
[0024]圖6B納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對體外培養不同時間HeLa細胞活性的影響
[0025]圖6C納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對體外培養不同時間MCF-7細胞活性的影響
[0026]圖7A納米藥物ND-PEG-DOX/NaAc對體外培養不同時間MCF-7細胞活性的影響
[0027]圖7B納米藥物ND-PEG-DOX/NaAc對體外培養不同時間HeLa細胞活性的影響
[0028]圖7C納米藥物ND-PEG-DOX/NaAc對體外培養不同時間MCF-7細胞活性的影響
【具體實施方式】
[0029]以下為實施例中使用的材料:
[0030]納米鉆石(ND，元素六，直徑大約140nm, Ireland)。
[0031]阿霉素(DOX)是鹽酸多柔比星，分子式為C27H29NO11.HCl，分子量為579.99，深圳萬樂藥業有限公司，規格按C27H29NO11.HCl計算為10mg。
[0032]聚乙二醇(H2N-PEG-COOH,分子量為2000)為上海西寶生物有限公司生產。
[0033]二水合檸檬酸鈉(C6H5Na3O7.2H20，分子量為294.10)為阿拉