一種雞新城疫、禽流感二聯滅活苗的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種雞新城疫、禽流感二聯滅活苗的制備方法，為一種新型的病毒液 純化工藝。屬于獸用生物制品制造領域。
【背景技術】
[0002] 禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒所引起的禽類的感染和/或疾病 綜合征。該病1878年首次發生于意大利，當時稱之為"雞瘟"，現已幾乎遍布世界各地。AI 可引起大多數家禽、野禽及水禽的感染，其中以雞和火雞最為易感，水禽被認為是流感病毒 的自然宿主（Hinshaw et al.，1980)。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)最顯著 的生物學特征之一就是亞型眾多，不同亞型病毒之間可以通過交換某些基因片段發生基因 重排，出現具有新的生物學特征的病毒，而且其抗原變異頻繁，包括由點突變引起的抗原漂 移（Antigenic drift)和不同亞型毒株同源重組產生新亞型所引起的抗原轉變（Antigenic shift) (Wiley et al.，1981 ;Webster et al.，1981)，因此為禽流感的有效防制帶來了極 大的困難和挑戰。近年來，禽流感以越來越快的變異速度在我國甚至世界范圍內流行，給養 禽業帶來了不可估計的損失，在嚴重影響國內禽類產品市場的同時更制約著我國禽類的出 口。控制禽流感的蔓延，避免禽流感在人類社會的大流行成為科學界乃至各國政府關注并 急待解決的首要任務之一。
[0003]新城疫（Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV)引起的禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟。以 高熱、呼吸困難、下痢、神經紊亂、粘膜和漿膜出血為特征。該病死亡率高，對養雞業危害嚴 重，0IE將其列為A類疾病。
[0004] 我國防控禽流感和新城疫主要依靠疫苗免疫。目前，控制禽流感發病的主要手段 是接種滅活苗，控制新城疫發病的主要手段是接種滅活苗或弱毒苗，其生產主要依靠雞胚 法實現。提高疫苗抗原含量、純度，能夠有效提高疫苗的免疫原性。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為在疫苗制備過程中提高疫苗抗原的含量和純度，使之有效提高 疫苗的免疫效力和安全性。
[0006] 本發明的技術方案為：
[0007] 1.-種雞新城疫、禽流感二聯滅活苗的制備方法，其特征在于該方法包括以下步 驟：制苗用病毒液的制備，使用深層過濾裝置進行過濾，病毒液的濃縮與滅活，油佐劑滅活 苗的制備，分裝。
[0008] 2.如權利要求1所述的雞新城疫、禽流感二聯滅活苗的制備方法，其特征在于具 體包括以下步驟：
[0009] (1)病毒液的制備：將生產用種毒接種10日齡SPF雞胚，收獲雞胚液；
[0010] (2)病毒液經深層過濾裝置處理，即：雞胚液與深層過濾裝置接觸，以300L/m2/ hr~500L/m2/hr的流速過濾具有大粒徑分布的蛋殼碎片、殼膜和血液，分離目的抗原與雜 質；
[0011] (3)病毒液的濃縮與滅活：使用病毒超濾濃縮系統將病毒液濃縮至原體積的1/2， 加入10%甲醛滅活；
[0012] (4)油佐劑滅活苗的制備：白油、硬脂酸鋁和司本-80混合，加入兩種抗原等量混 合的抗原液，即得油佐劑疫苗。
[0013] 3.如權利要求1所述的一種雞新城疫、禽流感二聯滅活苗疫苗的制備方法，其特 征在于步驟（4)所述白油、硬脂酸鋁與司本-80的體積比為94:2:6,病毒液與油相體積比為 3:7〇
[0014] 4.如權利要求1和2所述的一種雞新城疫、禽流感二聯滅活苗的制備方法，其特征 在于其中的病毒經深層過濾裝置和病毒超濾濃縮系統處理方法在用禽蛋作為病毒復制原 料制備的滅活疫苗中的應用。
[0015] 本發明詳細描述
[0016] 為了完成上述技術方案，本發明提供了一種高效的禽病病毒液濃縮純化抗原工 藝，包括以下步驟：
[0017] 1.提供禽病病毒培養液和深層過濾裝置：分別使病毒培養液與深層過濾裝置接 觸，以300L/m2/hr~500L/m 2/hr的流速過濾具有大粒徑分布的蛋殼碎片、殼膜和血液，分離 目的抗原與雜質。
[0018] (1)本發明提供一種深層過濾裝置（瑞士 FILTR0X公司），AF09深層過濾濾濾膜， 包括具有30~10 y m多個分級的深層濾器介質，用于初步澄清和去除聚集的殼膜和血液團 塊，提高未澄清的進料流的通量而沒有不期望的濾餅過濾效應；
[0019] (2)AF09濾膜有非常高的深度以分散尿囊液中的雜質，防止會導致介質中的內部 濾餅過濾的內部絮狀物橋接，在介質的外部或內部以避免壓力的濃度降低引起絮狀物分 解；
[0020] (3)具有各向異性深層濾器層，即孔徑逐步減少，匹配料液中絮狀物大小的群體；
[0021] (4)對于平均粒徑大于10 ym的目標抗原的初步澄清（通常是采用絮凝劑和化學 處理的料液的初步澄清）；
[0022] (5) AF09濾膜具有開放標稱孔徑評級的非織造纖維和纖維素/硅藻土 (diamatoceous earth)的復合分級層，能夠過濾具有大量固體的聚合物絮凝劑處理的進料 流；
[0023] (6) AF09濾膜具有較大通透性，但對于聚合物絮凝劑處理的進料流有較好的保持 特性。
[0024] 2.對經AF09濾膜過濾處理后的抗原液再用截留分子量為100kd的膜包進行病毒 超濾濃縮（購自德國默克密理博），對過濾的抗原液進行純化。
[0025] 3.用10%甲醛分別處理制苗用抗原液進行滅活；滅活后的兩種抗原等量混合。
[0026] 4.經以上濃縮純化處理、并經滅活的病毒抗原液按（V/V)96:4與吐溫-80混合制 成水相；水相與油相再按（V/V)3:7的比例混合乳化制成（滅活）油乳劑疫苗（單價）。
[0027] 使用兩種或以上病毒抗原液制備多價疫苗，是根據禽流感病毒型的種類，可分別 制備不同亞型禽流感病毒株的雞胚培養液經以上濃縮純化處理、滅活后病毒抗原液按相同 等體積混合，再將混合后病毒抗原液按（v/v)96:4與吐溫-80混合制成水相；水相與油相按 (V/V) 3:7的比例混合乳化制成（滅活）油乳劑疫苗（多價）。
[0028] 本發明使用微生物資源信息
[0029] 本發明疫苗生產用禽流感病毒為A型流感病毒（AIV)A/Chicken/Hebei/ WD/98(H9N2)株（以下稱禽流感病毒WD株），生產用新城疫病毒（(Newcastle disease virus，NDV)為La Sota株，均購自北京市農林科學院畜牧獸醫研究所；禽產蛋下降綜合癥 病毒CVCC AV70,中國獸醫微生物菌種保藏管理中心保藏。
[0030] 本發明積極意義
[0031] 本發明提供了一種雞新城疫、禽流感二聯滅活苗的制備方法。該方法包括以下步 驟：（1)制苗用毒液的制備。（2)病毒的雞胚液使用深層過濾裝置以300L/m 2/hr~500L/ m2/hr的流速進行過濾；（3)使用超濾系統進行抗原液的超濾濃縮；(4)使用10%甲醛滅活； (5)油佐劑滅活苗的制備，分裝。此方法制備的疫苗產量和安全性得到提高且具有良好的免 疫效果。
【具體實施方式】
[0032] 下面通過實施例對本發明進行進一步說明。
[0033] 實施例1
[0034] 一一禽流感、新城疫二聯滅活疫苗制備
[0035] 將SPF雞胚分別接種禽流感病毒WD株、新城疫病毒La Sota株，經以下方法濃縮純 化處理、并經滅活后的抗原液稀釋，再加入油佐劑混合乳化制成疫苗，用于禽流感H9亞型、 新城疫的預防。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。
[0036] 1.提供禽流感、新城疫病毒液和深層過濾裝置。
[0037] (1)本發明疫苗生產用禽流感病毒為WD株，系北京市農林科學院畜牧獸醫研究所 動物免疫與預防研究室1998年從河北省望都分離；新城疫病毒為La Sota株，來自北京市 農林科學院畜牧獸醫研究所。兩種毒株分別接種10日齡SPF雞胚培養獲得抗原液。
[0038] (2)用于深層過濾的裝置使用硅藻土作助濾劑，病毒抗原液與深層過濾裝置接觸， 以300L/m2/hr~500L/m 2/hr的流速過濾具有大粒徑分布的蛋殼碎片、殼膜和血液，分離目 的抗原與雜質。本實施例所用的深層過濾裝置適用病毒抗原液最佳流速為300L/m 2/hr。
[0039] 2.用截留分子量為100kd的膜包（購自德國默克密理博）處理步驟以上深層過濾