百藥煎在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應用

百藥煎在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及百藥煎在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 百藥煎屬于傳統(tǒng)中藥，其味酸甘，性平，由五倍子和茶葉等經(jīng)發(fā)酵制成，是世界上 最早制得的沒食子酸，始載于《丹溪心法》，具有較好的止咳止血作用。其炮制法最早見于 《本草蒙筌》："一新鮮五倍子十斤，搗爛，細磁缸盛，稻草蓋盒七晝夜，取出復搗，加桔梗、甘 草末各二兩，又盒一七，仍搗仍盒。務過七次，捏成餅，曬干任用。"《醫(yī)學入門》《本草綱目》 對其炮制方法也有記載。其中《本草綱目》更詳細的記載了歷代的制備方法，并首次以"細 茶…酒曲"為材料進行制備，其方法一直沿用至今。百藥煎具有潤肺化痰，生津止渴之功效， 臨床上普遍用于治療久咳痰多，咽喉腫痛，瘡瘍癰腫等病癥?！侗静菥V目》中李時珍曰"百藥 煎，功與五倍子不異。但經(jīng)釀造，其體輕虛，其性浮收，且味帶余甘，治上焦心肺咳嗽，痰飲熱 渴諸病，含噙尤為相宜。"目前國內(nèi)對百藥煎的研究還局限于炮制方法的優(yōu)化及其藥效學的 研究，但百藥煎對幽門螺桿菌a pylori的抗菌作用研究國內(nèi)外則未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供百藥煎的一種藥物新用途。
[0004] 本發(fā)明所提供的百藥煎的新用途是其在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應用。
[0005] 百藥煎在制備預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的疾病的藥物中的應用也屬于 本發(fā)明的保護范圍。
[0006] 百藥煎的體外實驗表明，百藥煎具有很強的抗幽門螺桿菌活性。百藥煎對幽 門螺桿菌的1個標準菌株（NCTC11637)和5個臨床耐藥株均具有顯著的抑菌效果，對 H. pyloriNCTC11637的最小抑菌濃度（MIC值）為4mg/ml，對H. pylori的臨床耐藥株的平 均MIC值為0. 9mg/ml，其有效劑量低于臨床用藥劑量。
[0007] 百藥煎對H. pylori具有顯著的殺菌作用，且其殺菌效能與藥物濃度成正相關，不 同濃度的百藥煎對a pylori NCTC11637具有顯著的殺菌效果，劑量越大，起效越快，效果則 越好。
[0008] 本研究結(jié)果顯示，百藥煎具有很強的抗幽門螺桿菌活性，說明對于與幽門螺桿菌 密切相關的急、慢性胃炎、胃、十二指腸潰瘍等疾病來講，百藥煎是一個極具開發(fā)潛力的藥 物。它可直接用于相應疾病的治療及其相關藥物的制備。
[0009] 本發(fā)明涉及的百藥煎在制備抗幽門螺桿菌藥物中的用途屬于首次公開，其對于幽 門螺桿菌具有意想不到的抑制活性，可用于幽門螺桿菌感染的防治。
【附圖說明】
[0010] 圖1為百藥煎的藥物濃度與各時間點的殺菌率的關系圖。
【具體實施方式】
[0011] 下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0012] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所 用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0013] 實施例
[0014] 1材料與方法
[0015] 1.1 材料
[0016] I. I. 1實驗菌株
[0017] 幽門螺桿菌（Helicobacterpylori,H.pylori)NCTC11637 標準菌株，臨床分離的 H.pylori菌株 5 株。
[0018] LL2實驗用藥與主要試劑
[0019] 百藥煎原藥購自杭州桐君堂醫(yī)藥藥材有限公司（批號：20140631);哥倫比亞瓊 脂（批號：CM0331)、腦心脊液（批號：CM0225)購自英國OXOID公司，布氏肉湯（批號： 3182288)購自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司，按說明書配制；脫纖維羊血購自北京寶特 醫(yī)療器械有限公司；胎牛血清（批號：20140623)購自北京飛默生物科技有限公司；幽門螺 桿菌選擇性培養(yǎng)瓊脂購自生物梅里埃中國有限公司；微需氧產(chǎn)氣袋（批號：CN0025A)購自 北京欣隆福醫(yī)藥銷售有限公司。
[0020] I. 1. 3實驗設備
[0021] 超凈工作臺（上海銳聰實驗室設備有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公 司），微需氧培養(yǎng)罐（北京玻璃廠），恒溫振搖床（上海一恒儀器有限公司），液體培養(yǎng)罐購 自英國OXOID公司，混合氣體（85% N2UO% C02、5% O2)。
[0022] 1. 2 方法
[0023] I. 2. 1H. pylori培養(yǎng)方法及菌株鑒定方法
[0024] 將H. pylori NCTC11637均勻接種于含有8%脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng) 基中，采用抽氣換氣法，于37°C微需氧環(huán)境下培養(yǎng)2-3d，陽性者進行傳代培養(yǎng)；通過觀察菌 落形態(tài)，革蘭染色，以及快速尿素酶、過氧化氫、氧化酶試驗對菌株進行鑒定。
[0025] 臨床菌株的分離培養(yǎng)：取慢性胃炎或消化性潰瘍患者胃鏡檢查下活檢胃黏膜組 織，充分均漿，均勻涂布于a pylori選擇性培養(yǎng)基，于37°C微需氧環(huán)境下培養(yǎng)3-5d，培養(yǎng) 陽性者接種環(huán)挑取a pylori菌落，再次涂布于含有8%脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng) 基，37°C微需氧環(huán)境下培養(yǎng)2-3d，傳代增菌。
[0026] I. 2. 2E_test 藥敏試驗
[0027] 收取培養(yǎng)48_72h的新鮮H.pylori于腦心脊液中，稀釋至3X 10scfu/ml(1麥氏池 度），取稀釋后菌液IOOul接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中，用L棒均勻涂開，放置含抗生素 的E-test試紙條，于37°C微需氧環(huán)境下培養(yǎng)72h，根據(jù)E試紙說明書讀取H.pylori對不同 抗生素的MIC值，判定耐藥情況。
[0028] 1. 2. 3藥物抑菌試驗
[0029] 瓊脂稀釋法：收取培養(yǎng)48_72h的新鮮H. pylori于腦心脊液中，將其稀釋至 3 X 10scfu/ml，用I y 1接種環(huán)將細菌接種于含藥瓊脂（藥物梯度從8, 4, 2*" 0? 25mg/ml)平 皿，并同時接種于無藥培養(yǎng)基作為對照。接種后置于37°C微需氧環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)72h后觀 察結(jié)果，不出現(xiàn)菌落的瓊脂平皿上的最低有效濃度為其最低抑菌濃度（MIC)。
[0030] 1. 2. 4藥物殺菌試驗
[0031] 實驗共設置4組，分別為空白對照組、1/2MIC藥物濃度組、MIC藥物濃度組、2MIC 藥物濃度組。取90mm玻璃平皿4個，分別加入布氏肉湯與胎牛血清（培養(yǎng)液10%的量） 混合液9. 5ml，將不同濃度的3種藥液各0. 5ml加入對應的液體培養(yǎng)基。收取新鮮培養(yǎng)的 H. pylori NCTC11637于布氏肉湯與胎牛血清混合液中制成菌懸液，使其濃度為IX IO6Cfu/ ml，各組均加入菌懸液IOOul。將各平皿液體培養(yǎng)液混勻，于恒溫振搖床37°C微需氧環(huán)境下 振搖培養(yǎng)。準備0. 9ml布氏肉湯稀釋試管若干，于0、4、8、24h分別取各組菌液的母液IOOul 經(jīng)數(shù)倍稀釋后，取IOOul混合稀釋液接種于90mm哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng) 箱，于37°C微需氧環(huán)境下培養(yǎng)72h后做菌落計數(shù)并按照稀釋倍數(shù)折算后取其平均值。統(tǒng)計 各個時間點的平均菌落數(shù)，計算不同藥物濃度下不同時間點的殺菌率，殺菌率=(對照菌 落數(shù)-處理菌落數(shù)）/對照菌落數(shù)X 100%。取各個時間點菌落計數(shù)的對數(shù)，繪制時間-殺 菌曲線圖。
[0032] 2?結(jié)果
[0033] 2. IE-test藥敏試驗篩選耐藥菌株情況
[0034] 經(jīng)E-test藥敏試驗篩選MZ或克拉霉素CH耐藥的臨床菌株5株，對臨床上常見抗 生素的耐藥情況見表1。
[0035] 表I.H.pylori臨床菌株耐藥情況
[0037] AC:阿莫西林CH:克拉霉素TC:四環(huán)素LE :左氧氟沙星MZ :甲硝銼MX :莫西沙星.* 對該抗生素耐藥
[0038] 2. 2百藥煎對H.pylori標準菌株及臨床耐藥株的MIC值
[0039] 百藥煎對標準菌株NCTC11637和臨床耐藥株均具有顯著的抑菌效果，對 H.pyloriNCTCl1637的MIC值為4mg/ml，對H.pylori的臨床耐藥株的平均MIC值為0? 9mg/ ml，其有效劑量低于臨床用藥劑量（見表2)。
[0040] 表2.百藥煎對H.pylori標準菌株及部分臨床耐藥株的MIC值（mg/ml)
[0042] 2. 3藥物不同濃度殺菌率及殺菌曲線
[0043] 百藥煎對H.pylori具有顯著的殺菌作用，且各時間點的殺菌率與藥物濃度成正 比。當藥物濃度為1/2MIC值時，24h菌落計數(shù)為0,殺菌率可以達到100% ;當藥物濃度為 MIC值時，8h菌落計數(shù)為100,殺菌率已經(jīng)接近100% ;當藥物濃度為2MIC值時，4h菌落計 數(shù)即為〇,殺菌率已經(jīng)達到100% (菌落計數(shù)見表3,殺菌率見表4)。
[0044] 表3?不同時間點平均菌落數(shù)（個）
[0048] 圖1為不同藥物濃度在各時間點的菌落計數(shù)的對數(shù)值。
[0049] 圖1結(jié)果顯示，在1/2MIC濃度的百藥煎作用下，培養(yǎng)0-8h時菌落計數(shù)較Oh有顯著 的降低，明顯低于空白對照組，24h已經(jīng)檢測不到菌落出現(xiàn)。當藥物濃度為MIC值時，0-24h 菌落計數(shù)較空白對照顯著降低，當藥物濃度為2MIC值時，培養(yǎng)4h已經(jīng)檢測不到有菌落生 長。
[0050] 3?結(jié)論
[0051] 采用瓊脂稀釋法測定百藥煎對H. pylori的MIC，研究其在體外對H. pylori是否具 有抑菌作用。結(jié)果顯示百藥煎對標準菌株NCTCl 1637和5株臨床耐藥株均具有顯著的抑菌 效果，平均MIC值為I. 4mg/ml，其有效劑量低于臨床用藥劑量。在不同藥物濃度條件下百藥 煎對H. pyloriNCTC11637具有明確的殺菌作用，殺菌率逐漸升高，且其殺菌效能與藥物濃 度成正相關。實驗結(jié)果顯示不同濃度的百藥煎均對H. pyloriNCTC11637具有顯著的殺菌效 果，劑量越大，起效越快，效果則越好。
【主權(quán)項】
1. 百藥煎在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應用。2. 百藥煎在制備預防由幽門螺桿菌引起的疾病的藥物中的應用。3. 百藥煎在制備治療由幽門螺桿菌引起的疾病的藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及百藥煎在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應用。百藥煎的體外實驗表明，百藥煎具有很強的抗幽門螺桿菌活性。百藥煎對幽門螺桿菌的1個標準菌株(NCTC11637)和5個臨床耐藥株均具有顯著的抑菌效果，對H.pyloriNCTC11637的最小抑菌濃度(MIC值)為4mg/ml，對H.pylori的臨床耐藥株的平均MIC值為0.9mg/ml，其有效劑量低于臨床用藥劑量。說明對于與幽門螺桿菌密切相關的急、慢性胃炎、胃、十二指腸潰瘍等疾病來講，百藥煎是一個極具開發(fā)潛力的藥物。它可直接用于相應疾病的治療及其相關藥物的制備。
【IPC分類】A61K36/82, A61K31/192, A61P1/04, A61P31/04, A61K35/64
【公開號】CN105079289
【申請?zhí)枴緾N201510564755
【發(fā)明人】張學智, 葉暉, 于靖
【申請人】北京大學第一醫(yī)院
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月7日