聚透明質酸或者寡聚透明質酸鹽的用途及其組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發明是申請號為201210497017. 3的母案的分案申請，該母案的申請日為2012 年11月29日，發明名稱為"一種芽孢桿菌、一種透明質酸酶及其制備方法和用途"。
技術領域
[0002] 本發明屬于酶學和藥物化學領域，涉及聚透明質酸或者寡聚透明質酸鹽的用途， 以及含有聚透明質酸和/或寡聚透明質酸鹽的組合物。
【背景技術】
[0003] 透明質酸（hyaluronicacid，HA)是一種酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡 糖醛酸雙糖重復單位構成的無分支高分子糖胺聚糖，存在于動物組織細胞間質和某些細菌 的莢膜中。透明質酸廣泛用于醫藥、化妝品、食品等領域，分子量一般為1〇 5 - 10 7Da(道爾 頓）。
[0004] 寡聚透明質酸是指分子量小于10kDa的透明質酸。研究表明，分子量對透明質酸 的活性有很大影響，不同分子量的透明質酸甚至表現出截然相反的活性（郭學平等，低分 子量及寡聚玻璃酸，中國生化藥物雜志，2003, 24 (3) : 148-150)。
[0005] 研究表明，寡聚透明質酸在體內具有促血管生成作用，在體外可促進內皮細 胞的增生，促進創傷愈合（WestDC,KumarS.Theeffectofhyaluronateandits oligosaccharidesonendothelialcellproliferationandmonolayerintegrity.Exp CellRes. 1989, 183(1) : 179-96)。寡聚透明質酸鹽具有促血管生成、促進創傷愈合等生物 活性，在醫藥領域具有良好的應用前景。
[0006] 在炎癥過程中，寡聚透明質酸對樹突細胞和巨噬細胞等免疫活性細胞具 有強力活化作用（TermeerC，BenedixF，SleemanJ，etal.Oligosaccharides ofHyaluronanactivatedendriticcellsviatoll-likereceptor4.JExp Med. 2002, 195(1) : 99-111)。
[0007] 寡聚透明質酸在體外可抑制小鼠TA3/St乳腺癌細胞、大鼠CG神經膠質瘤細胞、 人HCT克隆瘤細胞及人LXI肺癌細胞的生長，具有抗腫瘤作用（GhatakS，MisraS，Toole BP.HyaluronanconstitutivelyregulatesErbB2phosphorylationandsignaling complexformationincarcinomacells.JBiolChem. 2005,280(10):8875-83)〇
[0008] 此外，寡聚透明質酸鹽分子中的羥基、羧基和其他極性基團可與水分子形成氫鍵 而結合大量的水分，保水效果明顯，因此寡聚透明質酸鹽可用于防曬、抗衰老、保濕化妝品 中。
[0009]目前，透明質酸降解的方法主要有物理降解、化學降解、生物降解三大類，物理降 解法很難將透明質酸降至10kDa以下，化學降解法和酶法可以制備寡聚透明質酸，但化學 降解法制備寡聚透明質酸，需要較劇烈的反應條件（如較高的酸堿濃度等）才能達到最大 程度的降解。此時，不但糖鏈上的糖苷鍵斷裂，而且單糖（葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖）殘基 的結構也遭到破壞，如乙酰基被水解掉，單糖六元環斷裂等（表現在紅外圖譜上是與歐洲 藥典標準圖譜不一致），對制得的寡聚透明質酸的生物活性產生一定影響（郭學平等，低分 子量及寡聚玻璃酸，中國生化藥物雜志，2003,24(3) :148-150)。化學降解法制備的寡聚透 明質酸還容易發生褐變（中國專利申請號201110008110. 9)，生產過程會污染環境。而酶解 法降解透明質酸時，只斷裂單糖分子間的糖苷鍵，不會對其他結構造成破壞，而且酶解法反 應條件溫和，不用強酸強堿，制備的寡聚透明質酸不會發生褐變，不會造成環境污染，并且 酶解法制備的寡聚透明質酸的雙糖結構完整，紅外圖譜與歐洲藥典圖譜一致，因此酶解法 最適合制備寡聚透明質酸。
[0010] 降解透明質酸所用的酶主要是透明質酸酶（又稱為玻璃酸酶），根據作用機制的 不同，可以分為3類：（1)內切-e-N-乙酰氨基葡糖苷酶，為水解酶，作用于0 -1，4糖苷鍵， 終產物主要為四糖，也可作用于軟骨素或硫酸軟骨素，并有轉糖苷酶活性。哺乳動物來源的 以及動物毒液來源的屬于此類。（2)水蛭、十二指腸蟲來源的透明質酸酶，為內切-0-葡 糖苷酸酶，作用于0-1，3糖苷鍵，也是水解酶，主要降解產物是四糖，特異性降解透明質 酸；（3)細菌透明質酸酶，也稱為透明質酸裂解酶（hyaluronatelyase)，作用于0 -1，4糖 苷鍵，通過0 -消去機制得到4, 5-不飽和雙糖（Kreil,G,Hyaluronidases-agroupof neglectedenzymes,ProteinSci, 1995,4(9):1666-1669)〇
[0011] 目前工業生產寡聚透明質酸或其鹽的方法是化學降解法，由于含透明質酸酶 的動物組織來源有限，有文獻報道的微生物來源透明質酸酶發酵液單位酶活較低，發 酵液最高酶活是 1.3X102IU/mL(W02010130810Al;EileenIngham,K.T.Holland,G. Gowlandandff.J.Cunliffe,PurificationandPartialCharacterizationof HyaluronateLyase(EC4. 2. 2. 1)fromPropionibacteriumacnes,JournalofGeneral Microbiology(1979)，115, 411-418)，其余文獻報導的酶活均低于100IU/mL，不可能大規模 制備透明質酸酶，也就不可能用酶法大規模生產寡聚透明質酸或其鹽。
[0012] 此外，目前一般將分子量在l〇4Da- 106Da的透明質酸稱為低分子透明質酸 (LMW-HA) 〇分子量為2萬一6萬的LMW-HA可刺激體外培養的骨細胞的增生，增加培養基 中骨細胞集落的數目和單個集落的面積（US5646129)。使用含有妥布霉素和分子量為50 萬的HA的滴眼液治療細菌性角膜潰瘍，與只含妥布霉素的滴眼液相比，可顯著縮短愈合 時間（GandolfiSA,MassariA,OrsoniJG.Low-molecular-weightsodiumhyaluronate inthetreatmentofbacterialcornealulcerss[J].GraefesArchClinExp Ophthalmol, 1992, 230(1) :20-23)。韓國專利（KR20080087941)提供了一種含分子量小于 10萬的HA的組合物，該組合物易于被人體吸收，口服可有效改善皮膚皺紋、提高皮膚彈性。 日本專利（JP2000-103723)提供了 一種含分子量20萬一 40萬HA的組合物，該組合物可促 進毛發生長。但是，與寡聚透明質酸或其鹽的情形類似，酶解法制備的低分子透明質酸或其 鹽在結構上比化學法制備的要完整，化學法制備的低分子透明質酸或其鹽的結構會發生開 環、脫乙酰基等。
[0013] LMW-HA因其相對分子質量較小，外用時可被皮膚更好的吸收，促進皮膚營養的供 給和廢物排泄，從而防止皮膚老化，達到深層保濕和美容養顏的效果，而且還可促進表皮細 胞的增殖和分化，清除氧自由基，修復日光或紫外線傷害的皮膚。口服LMW-HA易于吸收，不 僅可以活化皮膚細胞，保持表皮濕潤，同時具有良好的增強免疫功能和抗衰老功能。因此化 妝品用及保健食品用HA多為LMW-HA。另外，LMW-HA還具有促血管生成、細胞免疫活化和促 進骨生成的作用，對治療細菌性角膜潰瘍具也有良好的療效，在醫藥領域應用廣泛。
[0014]LMW-HA是由高分子量HA降解得到的，降解的方法主要有物理降解、化學降解、生 物降解三大類。物理降解法中的超聲降解法雖然不添加化學試劑和酶，但很難將高分子量 HA降解至分子量200kDa以下（覃彩鳳，王淼，陳曉峰.透明質酸的降解方法及工藝條件 研究[J]. 2007, 4:32-36)。機械研磨法也是一種有效降低HA相對分子量的方法，有專利 報道在室溫下研磨時間為0. 5h- 12h，振蕩頻率為10Hz- 30Hz，但不適用于大規模生產 (CN101942037A)。化學降解法會造成結構破壞，這時不但糖鏈上的糖苷鍵斷裂，而且單糖 (葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖）殘基的結構也可能遭到破壞，如乙酰基被水解掉、單糖六元環 斷裂等。
[0015] 有報道酶解法生產低分子HA的制備過程，先將HA從發酵液中分離純化出來， 然后再添加入透明質酸酶進行酶解，再經過膜過濾、乙醇沉淀、脫水干燥得到低分子 HA(CN101020724A)，上述制備工藝所用的透明質酸酶為透明質酸酶成品，價格很高，很難實 現工業化生產。目前，有文獻報道的微生物來源透明質酸酶發酵液單位酶活較低，發酵液最 高酶活是1. 3X102IU/mL(W02010130810Al)，其余文獻報道的酶活均低于102IU/mL，因此應 用酶切法大規模生產低分子HA目前很難實現。
【發明內容】
[0016] 本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，得到了一種芽孢桿菌和一種透明質酸 酶。該透明質酸酶活性高，可達10 5IU/mL(發酵液），純化后可以達到8X106 - 1. 5X10 7IU/ mg，遠高于目前文獻中報道的最高酶活。該透明質酸酶的分子量為123KDa，最適作用溫度 及pH分別為42 °C、6. 5,熱穩定性和pH穩定性高。該酶可催化裂解透明質酸和硫酸軟骨素， 但是不能降解海藻酸鈉，肝素鈉，殼聚糖，幾丁質和羥甲基纖維素鈉。利用該透明質酸酶降 解高分子透明質酸，反應速度快、反應條件溫和、環境污染小，可大規模工業化生產低分子 透明質酸及寡聚透明質酸，還可生產低分子硫酸軟骨素（本發明中是指分子量為1，〇〇〇 - 10, 〇〇〇的硫酸軟骨素，也稱為低分子量硫酸軟骨素）。本發明采用芽孢桿菌發酵得到的透 明質酸酶對高分子量透明質酸或其鹽進行降解，酶活高、條件溫和、操作簡單、無環境污染。 由此提供了下述發明：
[0017] 本發明的一個方面涉及一種芽孢桿菌，其保藏編號為CGMCCNo. 5744,保藏日期為 2012年2月8日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)。
[0018] 針對現今生物降解透明質酸或其鹽所需降解酶活性低、來源有限、成本高的缺點， 發明人從空氣中分離得到了一種產透明質酸酶的芽孢桿菌（Bacillussp.)A50,該菌種 已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)進行了保藏，保藏號為 CGMCCNo. 5744,保藏時間為2012年2月8日。
[0019] 本發明的另一方面涉及一種制備透明質酸酶的方法，包括使用本發明的芽孢桿菌 的步驟。
[0020] 根據本發明的制備透明質酸酶的方法，其包括下述步驟：將本發明的芽孢桿菌斜 面培養、種子培養、發酵培養、離心、硫酸銨分級沉淀、超濾，制得透明質酸酶。
[0021] 根據本發明任一項所述的制備透明質酸酶的方法，其包括如下步驟：
[0022] (1)將本發明的芽孢桿菌進行斜面培養，得斜面菌種；
[0023] (2)取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25-40°C、100-200rpm的條 件下培養10-24h，得種子液；
[0024] (3)將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25 - 40°C、100 - 300rpm的條件 下培養12 - 24h，得透明質酸酶發酵液；
[0025] (4)離心分離發酵液，取上清液；
[0026] (5)將上清液用硫酸銨分級沉淀，過濾（例如采用0.65ym的微孔濾膜進行過 濾），得到粗制的透明質酸酶；
[0027] (6)將步驟（5)沉淀出來的粗制透明質酸酶溶于磷酸鹽緩沖液中，超濾除去小分 子雜質，得純化的透明質酸酶。
[0028] 可選地，步驟（6)也可以采用如下的步驟（6 - 1)至（6 - 3):
[0029] (6 - 1):將步驟（5)中的粗制透明質酸酶溶于pH4. 5 - 8. 0的緩沖溶液中，得粗 酶液；將粗酶液裝入截留分子量為3.OX103 - 1. 4X10 4Da的透析袋，放入pH4. 5 - 8. 0的 緩沖溶液中，4°C下透析過夜；
[0030] (6-2):將透析后的粗酶液進行離子交換色譜分離，色譜柱填料是DEAE瓊脂糖凝 膠FF介質，用0-0. 5MNaCl溶液進行梯度洗脫，并收集洗脫峰；
[0031] (6 - 3):將步驟（6 - 2)得到的透明質酸酶樣品進行冷凍真空干燥，得到白色粉 末，即為透明質酸酶。
[0032] 步驟6 - 1至6 - 3是對透明質酸酶的進一步純化。
[0033] 上述分離純化透明質酸酶的方法中，SDS-PAGE電泳檢測步驟（6-2)得到的透明質 酸酶純度達到97%以上。
[0034] 上述步驟⑴中，每100mL斜面培養基中含有以下成分：蛋白胨0.2 - 2. 0g，酵 母粉 0? 2 - 2. 0g，K2HP04 ? 3H20 0? 05 - 0? 15g，MgS04 ? 7H20 0? 05 - 0? 15g，葡萄糖 0? 5 - 1. 5g，瓊脂粉2. 0g，pH調至6. 0 - 8. 0,斜面培養的溫度為25 - 40°C。
[0035] 上述步驟⑵中，每100mL種子培養基中含有以下成分：蛋白胨0.2 - 2. 0g，酵 母粉 0? 2 - 2. 0g，K2HP04 ? 3H20 0? 05 - 0? 15g，MgS04 ? 7H20 0? 05 - 0? 15g，葡萄糖 0? 5 - 1. 5g，pH調至 6. 0 - 8. 0。
[0036] 上述步驟⑶中，每lOOmL發酵培養基中含有以下成分：蛋白胨0.2 - 2.0g，酵 母粉 0? 2 - 2. 0g，K2HP04 ? 3H20 0? 05 - 0? 15g,MgS04 ? 7H20 0? 05 - 0? 15g，葡萄糖 0? 5 - 1. 5g，吐溫 800. 05mL，pH調至 6. 0 - 8. 0。
[0037] 可采用鹽酸、硫酸或磷酸中的一種或一種以上調節斜面培養基、種子培養基和發 酵培養基pH。
[0038] 斜面種子培養和發酵培養的接種量可以通過現有技術得到，不需付出創造性的勞 動。種子培養基的接種量能夠達到發酵培養所需接種量的種子液即可，發酵培養基的接種 量一般在3 - 15%即可。
[0039] 上述步驟⑷中，發酵液離心的轉速為10000 - 15000rpm，離心時間為10 - 20min〇
[0040] 上述步驟（5)中，硫酸銨分級沉淀的步驟是：將上清液中加入硫酸銨，使其質量體 積濃度為20 % - 25 %，過濾除去產生的沉淀，然后繼續加入硫酸銨，至其質量體積濃度為 35% -40%為止，得到的沉淀即為透明質酸酶。本發明中所述的質量體積濃度的意思是：每 mL上清液中含有硫酸銨的質量（g)。
[0041] 上述步驟（6)中，磷酸鹽緩沖液的pH優選為6. 0,濃度優選為50mmol/L，在實際應 用中可酌情變動。超濾所用的為超濾膜。超濾膜的截留分子量為3X104Da。
[0042] 本發明的再一方面涉及一種透明質酸酶，其由上面任一項所述的制備透明質酸酶 的方法制得。
[0043] 本發明芽孢桿菌生產的透明質酸酶在發酵液中的酶活可達到1X105- 3X10 5IU/ mL，大大高于文獻報道中的最高酶活（1. 3X102IU/mL)，且該酶熱穩定性和pH穩定性高，用 其降解高分子透明質酸，用來制備寡聚或低分子透明質酸，成本顯著降低，可用于大規模生 產，解決了動物來源的透明質酸酶成本高的問題，在生化研究領域及寡聚或低分子透明質 酸的生產方面有廣闊的應用前景。
[0044] 本發明還涉及一種分離的多肽（或蛋白），其氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示；具 體地，所述多肽（或蛋白）為透明質酸酶。
[0045] 在本發明的一個實施方案中，所述透明質酸酶由本發明的芽孢桿菌制得。
[0046] 本發明還涉及一種透明質酸酶，其氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0047] -種分離的多肽（或蛋白），其氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示；具體地，所述多 肽（或蛋白）為透明質酸酶。
[0048] -種分離的多核苷酸，其編碼SEQIDN0 :2所示所示的氨基酸序列；具體地，所述 多核苷酸的序列為SEQIDN0 :3所示的序列或SEQIDN0 :3的互補序列。
[0049] -種重組載體，其含有本發明的多核苷酸。
[0050] -種重組宿主細胞，其含有本發明的重組載體。
[0051 ] 本發明的再一方面涉及一種制備寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽的方法，包括使 用本發明中任一項所述的透明質酸酶或者含有本發明中任一項所述的透明質酸酶的發酵 液對分子量大于l〇kDa的透明質酸或其鹽進行降解的步驟。
[0052] 根據本發明制備寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽的方法，其包含如下步驟：
[0053] 1)配制透明質酸或其鹽溶液：向純化水中加入分子量大于10kDa的透明質酸或其 鹽，配制成質量體積濃度為1 一 30%的溶液；
[0054] 2)酶解：調節步驟1)中溶液的溫度為20 - 48°C、pH為4 - 9,然后向其中加入芽 孢桿菌透明質酸酶，將透明質酸或其鹽酶解至所需分子量，得酶解液；
[0055] 3)滅活：將酶解液在50 - 90°C下保持10 - 60min，對芽孢桿菌透明質酸酶進行 滅活；
[0056] 優選地，還包括如下步驟：
[0057] 4)過濾：向滅活后的酶解液中加入易溶性無機鹽，攪拌至完全溶解，然后用孔徑 為0. 45ym的濾膜過濾，得濾液，每100mL酶解液中加入0. 1 - 10g的易溶性無機鹽；
[0058] 5)沉淀：將步驟4)的濾液與濾液體積3 - 20倍的醇或酮混合均勻，析出寡聚透 明質酸鹽沉淀；
[0059] 6)脫水干燥：將步驟5)中的寡聚透明質酸鹽沉淀分離出來，用有機溶劑脫水，然 后真空干燥，得寡聚透明質酸鹽。
[0060] 根據本發明制備寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽的方法，其中，步驟1)中，每lkg 透明質酸或其鹽加2X107- 5X10 7IU的芽孢桿菌透明質酸酶。
[0061] 根據本發明的制備寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽的方法，其中，步驟2)中，酶 解溫度為35 - 45 °C，酶解pH為5. 5 - 7. 5,將透明質酸酶解至分子量為大于或等于3000Da， 并且小于l〇4Da。
[0062] 根據本發明的制備寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽的方法，其滿足如下的A-F 中的任一項或多項：
[0063] A.步驟1)中，透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽