一種具有抗腫瘤轉移作用的中藥有效成分組合物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥領域，具體的，本發明涉及中藥有效成分組合物及其在制備抗腫瘤轉移藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是當前危害人類健康的重要疾病，自20世紀70年代以來，我國惡性腫瘤的發病率和死亡率一直呈上升趨勢。轉移是腫瘤惡性生物學行為的特征性表現，也是惡性腫瘤治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，抗腫瘤轉移是腫瘤綜合治療的重點。
[0003]腫瘤轉移是一個多步驟、多途徑、涉及多基因變化的一系列復雜過程，其中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedpro-tein kinase，MAPK)家族的異常激活與腫瘤轉移相關，細胞外信號調節激酶 1/2 (extracellular regulatedkinase 1/2, ERK1/2)是 MAPK 家族的主要成員之一，是細胞信號傳導的重要途徑，能將多種細胞外信號(如生長因子、細胞因子、腫瘤啟動因子等)通過磷酸化活化逐級傳遞至細胞核，并激活多種核轉錄因子，參與細胞增殖與分化、細胞形態維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡和細胞的惡變等多種生物學反應，研宄表明，ERK1/2及其磷酸化狀態(p-ERKl/2)的表達異常與腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移密切相關。
[0004]腫瘤治療藥物發展至今，雖然取得了很大成就，但由于非特異毒性、缺乏腫瘤選擇性以及腫瘤的多藥耐藥性等，大多數抗腫瘤藥物并不像預期那樣有效，其對正常組織的毒副作用更是困擾藥物治療的主要問題。目前仍缺少確能達到高效低毒目標的藥物，其中能抑制腫瘤轉移的更少。因此，開發高效低毒、特異選擇性、有明確靶向的抗腫瘤轉移藥物意義重大。
[0005]我國的中醫藥資源是一個寶庫，為新型抗腫瘤藥物提供了豐富的物質基礎，從中藥中發現抗腫瘤有效藥物具有獨特的優勢和廣寬的前景。然而，由于傳統中藥及復方成分不明，機制不清，質量難以控制，臨床療效無法評價等諸多不足與局限，制約了中醫藥在腫瘤治療中作用的發揮。中藥有效成分的組分配伍是傳統中藥配合伍創新，具有較高的安全性、臨床適應證明確且針對性好、成分及作用機理相對清楚、質量穩定可控的優勢。
[0006]我們前期研宄中發現了丹參與人參有效成分的組分配伍，與傳統丹參一人參藥對配伍比較，具有療效優越、組分成分清楚的特點，對腫瘤細胞具廣泛的生物學作用；在與部分臨床一線抗腫瘤藥物的比較研宄中，發現丹參與人參組分配伍在安全有效和腫瘤細胞特異選擇性方面具有優勢，尤其能明顯抑制腫瘤細胞轉移，對彌補目前抗腫瘤藥物欠缺有重要意義。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的問題是克服已有技術的不足之處，提出一種具有抗腫瘤轉移作用的中藥有效成分組合物，及其在制備抗腫瘤轉移藥物中的應用，具體涉及有效量的丹參總酚酸、人參總皂苷和人參多糖，以及藥學上可接受的載體在制備抗腫瘤轉移藥物中的應用。
[0008]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
[0009]I)上述中藥有效成分組合物在制備抗腫瘤轉移藥物中的應用。
[0010]2)上述腫瘤包括但不限于肺癌。
[0011]3)上述中藥有效成分組合物配伍劑量重量比，丹參總酚酸、人參總皂苷和人參多糖分別為0.5-2: 2-4: 1-3，更佳的為1: 2:1。
[0012]4)上述中藥有效成分組合物，其制劑形式為液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、滴丸劑、口崩制劑、注射劑。
[0013]本發明的有益效果:
[0014]I)上述中藥有效成分組合物能抑制腫瘤細胞侵襲。
[0015]2)上述中藥有效成分組合物能抑制腫瘤細胞迀移。
[0016]3)上述中藥有效成分組合物能顯著降低腫瘤細胞ERK1/2磷酸化水平，是一種潛在的具有靶向性的抗腫瘤轉移藥。
【附圖說明】
[0017]圖1中藥有效成分組合物對肺癌A549細胞劃痕實驗的影響。
[0018]圖2中藥有效成分組合物對肺癌A549細胞劃痕實驗影響的柱狀圖。
[0019]圖3中藥有效成分組合物對肺癌A549細胞迀移的影響。
[0020]圖4中藥有效成分組合物對肺癌A549細胞迀移影響的柱狀圖。
[0021]圖5中藥有效成分組合物對肺癌A549細胞侵襲的影響。
[0022]圖6中藥有效成分組合物對肺癌A549細胞侵襲影響的柱狀圖。
[0023]圖7中藥有效成分組合物對肺癌A549細胞ERK1/2磷酸化水平的影響。
[0024]圖8中藥有效成分組合物對肺癌A549細胞ERK1/2磷酸化水平影響的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0025]以下通過實施例對本發明作進一步闡述，但不對本發明作任何限制。
[0026]以下實施例所用的丹參總酚酸(80%，批號ZL20130112)、人參總皂苷(80%，批號ZL20130211)和人參總多糖(60%，批號ZL20130203)均購于南京澤朗醫藥科技有限公司，人肺癌細胞株A549購自于中國科學院上海生命科學研宄院細胞資源中心。
[0027]實施例1:細胞迀移劃痕實驗取培養至對數期的A549細胞，用0.25%胰酶消化，用滴管吹打至單細胞懸液，調整細胞密度為IX 105個/mL，接種于6孔板上，每孔lmL，置于37°C，5% C02及飽和濕度條件下細胞培養箱中培養24h至細胞基本融合。用100 μ L微量移液頭在6孔板內垂直劃痕，PBS液沖洗兩次后加入組分配伍溶液，每孔lmL，陰性對照組加入等體積的細胞培養液。將培養板置入37°C，5% C02培養箱中培養24h和48h分別用倒置相差顯微鏡觀察并拍照，采用Image J軟件隨機選取3個并計算100X視野內劃痕空白區域的距離。
[0028]結果:組分配伍對肺癌A549細胞劃痕實驗結果見附圖1和2所示，與陰性對照組比較，組分配伍顯著增加劃痕空白區域的距離(P < 0.01)，提示，組分配伍能夠顯著抑制肺癌A549的迀移，且呈一定的時間依賴性。
[0029]實施例2:高內涵細胞成像系統細胞迀移實驗取藍色熒光微球混懸液到96孔板中，于37°C避光孵育lh。用200 yL IXffash Buffer清洗5次，將細胞消化懸浮于含無血清的培養液中，吹打均勻調整細胞密度為I X 104個/mL，接種每孔50 μ L細胞懸液，然后置于37°C，5% C02及飽和濕度條件下細胞培養箱中培養24h后給藥，陰性對照組加入等體積的細胞培養液，給藥加入組分配伍供試品溶液，每孔100 μ L，每組設3個復孔。將培養板置入37°C,5% C02培養箱中培養48h。取培養48h的96孔板，棄去細胞培養上清，每孔加入200 μ L的5.5%預熱的固定液，于室溫孵育60min，然后加入穿透液室溫孵育30min，清洗后加入羅丹明-鬼筆環肽染色液，室溫孵育30min后清洗3遍，于高內涵細胞成像系統檢測。
[0030]結果:組分配伍對肺癌A549細胞迀移實驗結果見附圖3和4所示，與陰性對照組比較，組分配伍顯著降低細胞迀移的面積(P < 0.01)，提示，組分配伍能夠顯著抑制肺癌A549的迀移，且呈一定的劑量依賴性。
[0031]實施例3:實時細胞傳感電阻儀Transwell實驗在CIM-plate細胞迀移浸潤檢測板上室中加入一層Matrigel凝膠，下室加入含胎牛血清的培養液600 μ L。然后在上室中加入細胞懸液，調整細胞密度為I X 106個/mL，每孔200 μ L，置于37°C，5% C02及飽和濕度條件下細胞培養箱中培養24h。設組分配伍組和陰性對照組，每組3個復孔，在細胞傳感電阻儀動態檢測48h。
[0032]結果:組分配伍對肺癌A549細胞侵襲實驗結果見圖5和6所示，與陰性對照組比較，組分配伍顯著降低細胞侵襲的數目(P < 0.01)，提示，組分配伍能夠顯著抑制肺癌A549的侵襲，且呈一定的時間依賴性。
[0033]實施例4:納米級超微量蛋白質分析系統檢測ERK1/2磷酸化將細胞消化懸浮培養液中，吹打均勻接種到培養皿中培養24h，分為陰性對照組和組分配伍組，陰性對照組加入等體積的細胞培養液，給藥加入組分有效配伍供試品溶液，作用12h后去除培養上清，用5mL cell wash buffer清洗細胞3次，每孔加入100 μ L的裂解液(含蛋白磷酸酶和磷酸酶抑制劑)，用細胞刮破碎細胞裂解30min，收集裂解液置于1.5mL離心管中，于1，2000rpm4°C離心20min，收集裂解上清，定量后按照Nanopro試劑盒說明書操作，用Nanopro 1000納米級超微量蛋白質分析系統檢測ERK1/2磷酸化。
[0034]結果:組分配伍對肺癌A549細胞ERK1/2磷酸化的影響結果見圖7和8所示，與陰性對照組比較，組分配伍顯著降低A549細胞pp-ERKl、p-ERK1、pp-ERK2和p_ERK2的峰面積(P <0.01),并且顯著增加非磷酸化ERKl和ERK2的峰面積(P < 0.01)，提示，組分配伍能夠顯著降低肺癌A549細胞ERK1/2磷酸化水平。
【主權項】
1.一種中藥有效成分組合物，其特征在于，所述的組合物包括丹參總酚酸、人參總皂苷和人參多糖，以及藥學上可接受的載體制備成制劑。2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，丹參總酚酸、人參總皂苷和人參多糖配伍劑量重量比為0.5-2: 2-4: 1-3，更佳的為1: 2:1。3.如權利要求1所述的組合物，其特征在于丹參總酚酸含量大于80%、人參總皂苷含量大于80%、人參總多糖含量大于60%。4.如權利要求1所述的中藥有效成分組合物在制備抑制腫瘤轉移藥物中的應用。5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于該組合物能有效抑制腫瘤細胞侵襲、迀移，并顯著降低腫瘤細胞ERK1/2磷酸化水平。6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述腫瘤為肺癌。7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述的抑制腫瘤轉移藥物的制劑形式為液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、滴丸劑、口崩制劑或注射劑。
【專利摘要】本發明公開了一種中藥有效成分組合物及其在制備抗腫瘤轉移藥物中的應用。所述的中藥有效成分組合物包括有效量的丹參總酚酸、人參總皂苷和人參多糖，以及藥學上可接受的載體。本發明的重要之處是發現了所述的組合物能有效抑制腫瘤細胞侵襲、遷移，并顯著降低腫瘤細胞ERK1/2磷酸化水平，在本發明的配比范圍制備制劑能獲得更佳的療效，克服了傳統中藥配伍有效成分不清楚、質量無法控制而導致治療效果不明確的缺陷。因此，該中藥有效成分組合物具有制備抗腫瘤轉移藥物的應用前景。
【IPC分類】A61K36/537, A61P35/04, A61K31/715
【公開號】CN104940287
【申請號】CN201510433512
【發明人】畢蕾, 陳衛平, 楊燁
【申請人】南京中醫藥大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月20日