一種中藥組合物在制備抑制心肌梗死后神經重構藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中藥領域，具體涉及一種中藥組合物的應用。
【背景技術】
[0002] 神經的再生對維持心衰及心肌梗死后的心功能及血流動力學的穩定起著重要作 用。當交感神經興奮時，通過心肌細胞表面的0受體，增加心肌細胞的收縮力，加快房室傳 導，增加心率等作用，最終增加心臟輸出量。有關的研究顯示，當敲出神經營養素的相關基 因時，其心功能明顯降低。而在對心臟移植后突發性死亡的病人研究發現，其神經纖維密度 顯著增加。進一步研究顯示，在心肌梗死后或完全性房室傳導阻止時，向左側交感神經節注 射神經生長因子，其神經密度顯著增加同時伴有心律失常的發生顯著增加，并且相比對照 組猝死的動物數量顯著增加。因此交感神經的過度再生可能打破原有的平衡，導致其QT間 期的延長、復極離散度的增加，最終增加猝死的風險。實驗證實心肌梗死后神經纖維密度的 密度顯著增加，并且增加的大部分為交感神經纖維。這可能對心肌梗死后心臟性猝死起著 重要作用。
[0003] 目前研究提示神經營養因子可能在神經再生過程中起著重要作用。而神經營養因 子主要包括神經生長因子、腦源神經生長因子、神經營養因子-3及神經營養因子_4。主要 的受體分為TrkA(tyrosinekinaseA,酪氨酸蛋白激酶A)、TrkB(tyrosinekinaseB,酪 氨酸蛋白激酶B)、TrkC(tyrosinekinaseC,酪氨酸蛋白激酶C)及低親和力受體p75-NTR。 而腦源神經生長因子主要作用于TrkB受體，對中樞神經元的存活起著重要支持作用。而目 前關于神經營養因子-3及神經營養因子-4的研究相對較少，其作用機制可能與TrkC受體 信號通路有關。NGF主要于兩種受體：一種是高親和力受體TrkA，另一種是低親和力受體 P75-NTR。當NGF作用于TrkA受體時導致其自身磷酸化，激活下游的Ras蛋白，活化的Ras 蛋白進一步激活MEK(絲裂原活化或細胞外信號調節激酶的激酶)家族蛋白激酶，最終使ERK (extracellularsibnal-regulatedkinase,細胞外信號調節激酶）蛋白分子上的酪氨酸 和絲氨酸磷酸化，活化的ERK蛋白激活轉錄因子調節相關基因的表達；另一方面通過TrkA 受體作用，激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinosit3kinase，PI3K)，激活蛋白激酶 B(ProteinKinaseB,Akt),抑制凋亡基因的活性。而作用于p75-NTR受體時，可能激活 兩個信號途徑：一個是NF-kB途徑，另一個是JNK(Junamio-terminalkinase,氨基酸末 端激酶）途徑。而JNK途徑主要是啟動凋亡的信號途徑收，但受到TrkA活化的抑制。因此 NGF的升高一方面啟動TrkA信號途徑促進了神經的再生，另一方面通過TrkA受體抑制其 P75-NTR介導的凋亡信號，并且激活NF-KB(主要能與多個啟動子的KB部位結合，促進相 關DNA的轉錄及蛋白的表達）途徑，促進神經纖維的生長。
[0004] 雖然以前相關研究顯示ET-I對心肌纖維化起著重要的作用，研究顯示ET-I可以 通過內皮素受體A(endothelin_Areceptor)、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)及細 胞外信號途徑，調節神經生長因子的表達。IL-IP主要由激活的巨噬細胞產生，具有廣泛 的生物學效應。其不僅可以通過激活核因子抑制蛋白激酶（IKK,Inhibitorofnuclear factorkBkinase),增強NF-KB途徑的效應，而且還可以調節神經生長因子表達，促進神 經細胞的修復。TNF-a可以由各種免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞及星形膠質細胞產生，同 樣可以增強NF-KB效應。并且在低溫條件下，TNF-a可以上調神經營養因子的表達，誘導神 經細胞軸突的生長。另一方面，NF-KB的激活可以上調TNF-a及IL-IP的表達，形成放大 效應。以前的研究認為，梗死區的心肌細胞釋放神經生長因子作用于遠處的神經節，導致非 梗死區及梗死周邊區的神經纖維再生。目前還沒有發現可以有效的抑制神經重構的藥物。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是提供一種中藥組合物在制備抑制心肌梗死后神經重構的藥物中的 應用，效果好，沒有明顯副作用。
[0006] 本發明所采用的技術方案是： 一種中藥組合物在制備抑制心肌梗死后神經重構藥物中的應用，所述中藥組合物由 下列重量份數的原料藥制成：人參45-180份、麥冬50-200份、山茱萸125-450份、丹參 125-450份、炒酸棗仁95-400份、桑寄生95-400份、赤芍45-200份、土鱉蟲35-150份、甘松 45-200份、黃連25-90份、南五味子35-150份、龍骨75-300份， 優選的，所述中藥組合物由下列重量份數的原料藥制成： 人參89份、麥冬112份、山茱萸224份、丹參224份、炒酸棗仁186份、桑寄生186份、 赤芍89份、土鱉蟲75份、甘松89份、黃連45份、南五味子67份、龍骨149份。
[0007] 或 人參180份、麥冬200份、山茱萸450份、丹參125份、炒酸棗仁95份、桑寄生95份、赤 芍45份、甘松45份、土鱉蟲35份、黃連25份、南五味子35份、龍骨75份。
[0008] 或 人參45份、麥冬50份、山茱萸125份、丹參450份、炒酸棗仁400份、桑寄生400份、赤 芍200份、甘松200份、土鱉蟲150份、黃連90份、南五味子150份、龍骨300份。
[0009] 為實現上述技術方案，將中藥組合物的制成膠囊劑、片劑、散劑或丸劑。
[0010] 所述中藥組合物的活性成分由以下步驟制成： a) 人參用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，濾過，回收乙醇，濃縮，烘干，粉碎成細 粉，備用； b) 南五味子、山茱萸、丹參、黃連、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，濾過，回 收乙醇，濃縮得浸膏，備用； c) 土鱉蟲粉碎成細粉，備用； d) 麥冬、炒酸棗仁、桑寄生、赤芍、龍骨加水煎煮二次，合并提取液，濾過，濃縮得浸膏， 備用； e) 將步驟b)與d)所得浸膏合并，加入步驟c)所得的藥物細粉烘干，粉碎成細粉，加入 步驟a)所得藥物細粉，混勻，即得該中藥組合物活性成分。
[0011] 所述中藥組合物的膠囊劑由以下步驟制成： a)人參用70%乙醇回流提取三次，第一次3小時，以后每次2小時，合并提取液，濾過， 回收乙醇，濃縮，烘干，粉碎成細粉，備用； b) 南五味子、山茱萸、丹參、黃連、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，濾過，回 收乙醇，濃縮得浸膏，備用； c) 土鱉蟲粉碎成細粉，備用； d) 麥冬、炒酸棗仁、桑寄生、赤芍、龍骨加水煎煮二次，合并提取液，濾過，濃縮得浸膏， 備用； e) 將步驟b)與d)所得浸膏合并，加入步驟c)所得的藥物細粉烘干，粉碎成細粉，加入 步驟a)所得藥物細粉，混勻，裝入膠囊。
[0012] 所述中藥組合物在制備降低神經纖維密度藥物中的應用。
[0013] 所述中藥組合物在制備抑制TNF-a、IL-IP、NF-KB、ET-I及NGFmRNA表達藥物 中的應用。
[0014] 為驗證本發明組合物的效果，按實施例1制得的膠囊劑做了以下實驗 1材料和方法 主要試劑及儀器 ReverTraAce、RT-PCR試劑盒（T0Y0B0 公司），引物（InvitrogenBiotechnology&).1^1>中國公司合成)，64?43(神經生長相關蛋白43)多克隆抗體（413(^111公司），1'11(酪氨 酸輕化酶)多克隆抗體（Abeam公司），p75-NTR多克隆抗體（MiIlipore公司），本發明藥物組 合物(石家莊以嶺藥業股份有限公司），實時熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司）， 多導電生理義，計算機圖像分析系統。
[0015] 動物模型的制作及分組 新西蘭大耳白兔(武漢生物研究所提供)共30只，體重2. 2kg~2. 5kg。隨機分為假手術 組、心梗組及治療組，以戊巴比妥40mg/kg耳緣靜脈麻醉，并經前胸暴露心臟，結扎管狀動 脈前降支。以心電監護顯示I、II、avL導聯ST段抬高0. 2mV為手術成功的標準，術后注釋 40萬單位青霉素。分別以普食(假手術組、心肌梗死組）及普食+該組合物原粉喂養8周。
[0016] 免疫組化 以GAP43及TH為標志物，采用免疫組化的方法研究心肌梗死后的神經纖維密度。首先 取心肌梗死周邊區的組織標本，4%多聚甲醛固定。常規石蠟切片，脫蠟，封閉，修復及分別 滴加GAP43 (1:500)及TH(1:600)多克隆抗體。37°C孵育過夜，最后滴加生物素化二抗，DAB 顯色，封片。神經密度的測量采用顯微鏡組成的計算機圖像處理系統及image-proplus軟 件，以陽性纖維(棕黃色）所占的面積（Mffl2) /圖片的面積（_2)為標準。
[0017] 取勻楽器，加入Iml的TrizolReagent至冰山預冷，再取IOOmg的心肌組織至勻 漿器中充分研磨，提取RNA。提取RNA后，分別加入Buffer，dNTPs，RNA抑制酶及反轉錄酶， 以42 °C保溫30min。按照RT-PCR試劑盒說明，以95 °C預變性Imin后進入PCR循環，95 °C變 性15s，58°C退火20s，72°C延伸20s，循環40次。計算標準為AACT法：A=CT(目的基因， 待測樣本）_CT(內標基因，待測樣本），B=CT(目的基因，對照樣本）-CT(內標基因，對照 樣本），K=A-B,表達倍數=2_K。CT值定義為：每個反映管內的熒光信號達到設定的閾值所 經歷的循環次數。
[0018] 引物序列相關信息見表1。
[0019] 表1各目的基因及引物的相關信息表
Westernblot分析 取少量心肌組織放入勻漿中，用眼科剪將其剪碎，加入400沿的裂解液，離心，取上清 液，提取胞漿蛋白。經上樣，電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉后，在4°C溫度下，以1:1000稀釋的 P75-NTR抗體孵育過夜。經TBST洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:1500) 37°C避光孵育lh，TBST洗膜3次，最后曝光、顯影、定影。
[0020] 統計學處理 應用SPSS13. 0軟件進行統計學處理，采用獨立樣本T檢驗，以/^ < 0. 05表示差異具有 統計學意義。
[0021] 結果