溫陽化濁通絡方免疫抑制作用有效部位的提取篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥技術領域，特別是溫陽化濁通絡方治療系統性硬化病免疫抑制作 用有效部位的提取篩選方法。
【背景技術】
[0002] 系統性硬化病（systemic sclerosis, SSc)是一種以皮膚增厚和纖維化以及內臟 器官(包括心、肺、腎和消化道等）受累為特征的自身免疫性疾病，其病因尚不十分清楚，現 代臨床治療多采用結締組織形成抑制劑(如青霉胺、秋水仙堿等)、免疫抑制劑、糖皮質激素 及運用針對血管和改善微循環的藥物等。溫陽化濁通絡方由黃芪20~30份，黨參12~15 份，山藥12~15份，仙靈脾12~15份，熟地15~20份，桂枝9~12份，積雪草12~ 15份，白芥子6~10份，槌果藤15~20份，絲瓜絡9~12份組成，具有補肺健脾益腎、 化濁通絡之功效，臨床用于治療SSc效果顯著，且具有較高的安全性，但該方治療SSc的主 要藥效部位尚不清楚，且傳統的水煎煮法難免導致一些水不溶性成分的流失。有鑒于此，本 發明即以藥效評價為導向，通過體內、體外實驗探討溫陽化濁通絡方不同提取部位對免疫 功能和脾淋巴細胞增殖的影響，篩選其免疫抑制作用的有效部位，闡明其藥效物質基礎。
【發明內容】
[0003] 為篩選溫陽化濁通絡方免疫抑制作用的有效部位，闡明其藥效物質基礎。本發明 目的就是提供一種該方關于免疫抑制作用有效部位的提取篩選方法。
[0004] 該溫陽化濁通絡方免疫抑制作用有效部位的提取篩選方法，其特征在于按下述步 驟提取、篩選： 1. 將復方中槌果藤蒸制10~30min之后以水煎煮5~15min，棄去煎液，而后將槌果 藤瀝干備用； 2. 將復方中的藥材黃芪、黨參、山藥、淫羊藿、熟地、白芥子，按料液比1:10~1:30以 水合煎2~4次，每次30~90min，于最后一次煎煮時加入桂枝、積雪草、絲瓜絡，合并水煎 液，自然過濾或抽濾，回收藥渣，濾液備用； 3. 將步驟3中濾液以終醇濃度75~85%進行醇沉，并靜置8~16h，離心得沉淀即為 水溶性部位（I )，上清液備用； 4. 將步驟3中藥渣以及步驟2所得槌果藤以80%~100%乙醇回流提取2~3次，合 并濾液，分別以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，即得乙醚部位（II)、乙酸乙酯部位 (III)、正丁醇部位（IV);剩余乙醇液濃縮，備用； 5. 將步驟4中上清液與步驟5乙醇濃縮液合并，即得乙醇部位（V); 6. 觀察溫陽化濁通絡方不同提取部位對小鼠DTH反應的影響，以及對小鼠T、B淋巴 細胞增殖的影響，篩選出溫陽化濁通絡方水溶性部位和正丁醇部位能明顯抑制小鼠DTH反 應，抑制T、B淋巴細胞增殖，具有較好的免疫抑制活性，是其治療SSc的有效部位。
[0005] 該提取篩選工藝不同于傳統的單純水煎，旨在將溫陽化濁通絡方各個部位全部提 取出來，以全面確定該方關于免疫抑制作用的有效部位。
[0006] 本發明工藝中，黃芪主要成分黃芪多糖、皂苷類、黃酮類和氨基酸等，能提高免疫 功能，對淋巴細胞體外增殖具有抑制作用等；黨參主要含黨參苷、黨參堿、黃酮類及糖類等 成分，具有增強網狀內皮系統功能，增加皮質酮分泌、調節免疫等藥理作用；淫羊藿含有多 糖、黃酮類、生物堿、萜類、木脂素等多種活性物質，對于抑制血栓形成，降低全血粘度并抑 制經ConA刺激的T淋巴細胞早中期活化、增殖、鈣離子內流，阻滯細胞周期在G cZG1期有明 顯作用；熟地具有調節免疫、抗氧化等作用；槌果藤主要成分有揮發油類、黃酮及其苷類、 生物堿及酚酸類等，具有抗菌消炎、抗氧化保肝等作用；積雪草化學成分包括三萜皂苷、多 炔烯類和揮發油等，具有調節免疫、抵抗纖維化、抗炎鎮痛等作用；白芥子主要含芥子油苷， 抑制炎性滲出，抗炎鎮痛、抗前列腺增生等作用；桂枝有效成分為揮發油，具有擴張血管、解 熱鎮痛、抗過敏、抗炎等作用；絲瓜絡具有抗炎、鎮痛及利尿等作用。
[0007] 由于溫陽化濁通絡方中成分紛繁復雜，且各種化合物極性大小相差甚大，單純采 取水煎的傳統方式不可能全面利用復方有效成分，故而有本發明之工藝。
【附圖說明】
[0008] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0009] 圖1為溫陽化濁通絡方不同提取部位對ConA誘導的T淋巴細胞增殖的影響； 圖2溫陽化濁通絡方不同提取部位對LPS誘導的B淋巴細胞增殖的影響。
【具體實施方式】
[0010] 以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作詳細說明，但本發明的內容不僅限于 此。
[0011] 實施例1 溫陽化濁通絡方由黃芪30g，黨參15g，山藥15g，淫羊藿15g，熟地20g，桂枝12g，積雪 草15g，白芥子10g，槌果藤20g，絲瓜絡12g。
[0012] 1.該復方免疫抑制作用有效部位的提取 (1) 將復方中槌果藤蒸制20min之后以水煎煮5min，棄去煎液，而后將槌果藤瀝干備 用； (2) 將復方中的藥材黃芪、黨參、山藥、淫羊藿、熟地、白芥子，按料液比1:25以水合煎 4次，每次90min，于最后一次煎煮時加入桂枝、積雪草、絲瓜絡，合并水煎液，自然過濾或抽 濾，回收藥渣，濾液備用； (3) 將步驟2中濾液以終醇濃度85%進行醇沉，并靜置16h，離心得沉淀即為水溶性部 位（I)，上清液備用； (4) 將步驟2中藥渣以及步驟1所得槌果藤以100%乙醇回流提取2次，合并濾液，分別 以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，即得乙醚部位（II)、乙酸乙酯部位（III)、正丁 醇部位（IV);剩余乙醇液濃縮，備用； (5) 將步驟3中上清液與步驟4乙醇濃縮液合并，即得乙醇部位（V)。
[0013] 2.該復方免疫抑制作用有效部位的篩選 (1)方法 ①DTH反應測定 取80只ICR小鼠，按體質量分層隨機分出10只作為空白對照組，其余小鼠參照相關實 驗方法建立DTH小鼠模型：實驗開始日（dl)和d2在小鼠腹部固定部位脫毛，面積約3cm2， 于去毛部位涂0. 5% DNFB (以丙酮：橄欖油4:1的比例配置）40 μ 1致敏，d7于左耳內外側 涂0.3% DNFB 20 μ 1激發。按體質量隨機將造模小鼠分為7組：模型組、Dex組（1.5mg/ kg)、水溶性部位組（982 mg/kg)、乙醚部位組（136mg/kg)、乙酸乙醋部位組（35 mg/kg)、正 丁醇部位組（315mg/kg)、乙醇部位組（72lmg/kg)。自致敏前2d開始，按上述劑量每天灌胃 實驗藥物0.2ml/10g，空白對照組、模型對照組灌胃等量蒸餾水，1次/d，連續8d。激發48h 后頸椎脫臼法處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器在相同部位取直徑8 mm耳片，以游標卡 尺測量厚度并以分析天平稱量重量，同時取小鼠胸腺及脾臟稱重。以左右耳片厚度、重量之 差為腫脹度；以每IOg小鼠的脾重和胸腺重作為脾指數和胸腺指數脾。（胸腺）指數=[脾 (胸腺）質量（mg) /體質量（g)] X 10。
[0014] ②脾細胞懸液的制備將處死的小鼠放入75%乙醇中浸泡消毒1分鐘，無菌條件 下取脾臟并去掉被膜，于200目篩網上輕捻脾組織，使細胞經篩網過濾至離心管中，離心 (1500r/min，IOmin)后棄上清。用紅細胞裂解液除去紅細胞，用PBS沖洗2~4次。最后加 入10% FCS-RPMI-1640培養液調節小鼠脾淋巴細胞濃度為3 X IO6個/ml備用。
[0015] ③T、B淋巴細胞增殖活性分析分別檢測ConA刺激的T淋巴細胞增殖和LPS刺 激的B淋巴細胞增殖。將上述脾細胞懸液接種于96孔培養板，每孔100 μ 1。實驗分組如下： 空白本底組(只加RPMI-1640培養基)、對照組(加入終濃度為5 μ g/ml的ConA或10 μ g/ml 的LPS)、不同濃度溫陽化濁通絡方各部位提取物干預下的實驗組(分別加入終濃度為5 μ g /ml、15yg /ml、25yg /ml、35yg /ml的各部位提取物)、Dex組(加入Dex，終濃度同上)，每 組設10個復孔。將培養板于37°C、5% CO2溫箱中培養48h。之后每孔分別加入10 μ I MTT 溶液再繼續培養4h，然后加入100 μ 1/孔酸化的SDS，震蕩3min，溫箱培養3h。用酶標儀于 波長490nm處測吸光度（A值)，計算T、B淋巴細胞的抑制率。抑制率％=(對照組A均值-實 驗組A均值）/(對照組A均值-空白本底組A均值）X 100%。
[0016] ④統計學方法采用SPSS16. 0軟件進行統計分析，計量資料以均數土標準差（ 土s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P < 0. 05為差異有統計學意義。
[0017] (2)結果 ①溫陽化濁通絡方不同提取部位對DTH小鼠耳殼腫脹度的影響見表1。與空白組比 較，DTH模型組耳殼增重、增厚顯著（P < 0. 01)。與模型組比較，溫陽化濁通絡方水溶性部 位和正丁醇部位組均能顯著抑制小鼠耳殼的腫脹（P < 0. 01)，同時溫陽化濁通絡方乙醇部 位組亦能抑制小鼠耳殼的腫脹（P < 0. 05)。
[0018] 表1 溫陽化濁通絡方不同提取部位對DTH小鼠耳殼腫脹度的影響（
【主權項】
1.溫陽化濁通絡方免疫抑制作用有效部位的提取篩選方法，其特征在于按下述步驟提 取、篩選： (1) 將復方中槌果藤蒸制10~30min之后以水煎煮5~15min，棄去煎液，而后將槌果 藤瀝干備用； (2) 將復方中的藥材黃芪、黨參、山藥、淫羊藿、熟地、白芥子，按料液比1:10~1:30以 水合煎2~4次，每次30~90min，于最后一次煎煮時加入桂枝、積雪草、絲瓜絡，合并水煎 液，自然過濾或抽濾，回收藥渣，濾液備用； (3) 將步驟（3)中濾液以終醇濃度75~85%進行醇沉，并靜置8~16h，離心得沉淀即 為水溶性部位（I)，上清液備用； (4) 將步驟（3)中藥渣以及步驟（2)所得槌果藤以80%~100%乙醇回流提取2~3次， 合并濾液，分別以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，即得乙醚部位（II)、乙酸乙酯部 位（III)、正丁醇部位（IV);剩余乙醇液濃縮，備用； (5) 將步驟（4)中上清液與步驟（5)乙醇濃縮液合并，即得乙醇部位（V); (6) 觀察溫陽化濁通絡方不同提取部位對小鼠DTH反應的影響，以及對小鼠T、B淋巴 細胞增殖的影響，篩選出溫陽化濁通絡方水溶性部位和正丁醇部位能明顯抑制小鼠DTH反 應，抑制T、B淋巴細胞增殖，具有較好的免疫抑制活性，是其治療SSc的有效部位。
【專利摘要】本發明公開了溫陽化濁通絡方治療系統性硬化病免疫抑制作用有效部位的提取工藝與篩選方法，特征在于制備出該復方水溶性部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和乙醇部位，篩選出該復方治療系統性硬化病免疫抑制作用的主要有效部位——水溶性部位和正丁醇部位，為進一步開發出治療系統性硬化病的新藥提供了實驗依據。
【IPC分類】A61P37-06, A61K36-8945
【公開號】CN104840672
【申請號】CN201510171429
【發明人】卞華, 呂芹, 郝鵬飛, 張鵬, 付衛云, 張超云
【申請人】南陽理工學院
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月13日