大鯢皮膚黏液提取物在制備抗肺癌藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，大鯢皮膚黏液提取物在制備抗肺癌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]據世界衛生組織公布，受空氣污染，抽煙等因素影響，肺癌發病率和死亡率在世界各國均呈明顯上升的趨勢。目前，對肺癌的治療以外科治為主，內科治療為副，中西醫結合，放化療控制，但許多藥物和放化療副作用大。從動物進化過程中形成特殊殊活性成分中發掘抗肺癌新藥，是研發抗肺癌藥物的新途徑。大鯛(Andrias davidianus Blanchard)屬大型兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，有“活化石”之稱，在自然進化過程中為防御病原微生物及天敵的侵害，大鯢皮膚黏液細胞釋放黏液，覆蓋在皮膚上形成了一道天然的防護屏障。大鯢皮膚黏液物中含有豐富具有特殊的生物活性分子，具有廣普抗菌、抗腫瘤作用。
【發明內容】
[0003]本發明的目是在于提供一種具有抗肺癌活性成分，來源于大鯢皮膚分泌黏液的提取物，并在制備抗抗癌藥物中應用。
[0004]實現上述目的的技術方案:人工養殖的健康3齡以上的大鯢，通過無菌水清洗后，機械刺激刮取黏液，按質量分數，用0.4moINaoH水溶液按20: I比例加入黏液中，在45°C條件下，超聲波振蕩提取2h，過濾液濃縮為原體積為五分之一，濃縮液中加入食用酒精至乙醇濃度75 %醇沉，在0-4 °C條件靜置I O-12h，離心去上清液，用SAVEG法脫蛋白三至四次，用無水乙醇洗滌3次，真空冷凍干燥大鯢皮膚黏液提取物。黏液提物經過DEAE-52離子交換層析，再經G-100葡聚糖凝膠層析純化，以280nm為檢測波長，收集出峰樣濃縮，真空冷凍干燥。黏液提取純化物通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，在28KD分子量有明顯蛋白條帶。經高效液相和氨基酸分析儀檢測，提取純化物含有6種單糖MaN、GlcUA、GalUA、GlcN、Glc、Gal，其分子摩爾數比為63: 152: 40: 57: 37: 77，總糖含量為33-35.0%，蛋白質含量為67-65.0 %，大鯢皮膚黏液提取物為糖蛋白。大鯢黏液提取純化物用PBS緩沖液溶解成1、10、20、40ug/mL，同lug/ml紫杉醇作陽性對照，加入5% C02培養的對數期A549肺癌細胞中，培養48h，加入20ulMTT，繼續培養4h，棄去培養液，加入150ul 二甲基亞風溶解，37°C低速震蕩lOmin，用紫外分光光度計，在570nm處檢測其吸光度，對數期A549肺癌細胞抑制率分別為86.30%，91.91 %，92.32%陽性對照物的抑制率59.6%，大鯢黏液提取物對A549肺癌細胞的抑制率明顯高于陽性對照組，且提取物濃度低于陽性藥物。大鯢黏液提取物處理A549肺癌細胞48h后，通過光學顯微鏡觀察形態，外形態皺縮、變園、脫落。
[0005]結合以下實施例對本發明作進一步的說明，本發明所述的大鯢皮膚黏液提取物的提取方法和抑制肺癌細胞試驗。
[0006]I)將人工養殖的健康3齡以上的大鯢，用無菌水清洗后，用機械刺激大鯢產生白色黏液刮取黏液，用0.4moINaoH水溶液按20: I比例加入黏液中，在45°C條件下，超聲波振蕩提取2h，過濾液濃縮為原體積為五分之一，濃縮液中加入食用酒精至乙醇濃度75%醇沉，在0-4 °C條件靜置I O-12h，離心去上清液，用SAVEG法脫蛋白三至四次，用無水乙醇洗滌3次，真空冷凍于燥大鯢皮膚黏液提取物。
[0007]2)再經過DEAE-52離子交換層析，用0.2mol/NacL溶液洗脫，用280nm為檢測波長，收集出峰樣，大于7000D透析袋脫鹽，濃縮真空冷凍干燥。
[0008]3)經SePhadexG-100凝膠層析純化，以蒸餾水為流動相，以280nm為檢測波長，收集出峰樣濃縮，真空冷凍干燥成粉。
[0009]4)大鯢皮膚黏液提取物，以質量分數計，總糖含量為33-35%，蛋白質含量為67-65%，提取物中含有MaN、GlcUA、GalUA、GlcN、Glc、Gal6種單糖，蛋白分子量為28.0KD。
[0010]5)采用MTT法研宄了大鯢皮膚黏液提取物對肺癌細胞A549的抑制作用，分別以1、10、20、40ug/mL對大鯢皮膚黏液提取物對肺癌細胞A549處理48h，對肺癌細胞抑制率分別為86.3%,91.91% 92.3%,顯示大鯢皮膚黏液提取物對肺癌細胞有極強的抑制作用。
[0011]6)通過光學顯微鏡對提取物處理A549肺癌細胞48h后，觀察形態，結果肺癌細胞體積變小，細胞群體數量稀疏，貼壁細胞數量減少，出現皺縮、變圓，表明大鯢皮膚黏液提取物具有良好的抗肺癌細胞作用。
【主權項】
1.大鯢皮膚黏液提取物在制備抗肺癌藥物中的應用。其特征在于大鯢皮膚黏液通過堿液提取，脫蛋白，離子交換和凝膠層析純化后的真空干燥提取物，以質量分數計，多糖含量為33-35%，蛋白質含量為67-65%，多糖中含有MaN、GlcUA、GalUA、GlcN、Glc、Gal6種單糖，蛋白分子量為30KD，大鯢皮膚黏液提取物對肺癌細胞A549試驗有抑制作用。
2.按照權利要求1所述的大鯢皮膚黏液提取物在制備抗肺癌藥物中的應用，其特征在于:大鯢皮膚黏液提取物溶于PBS緩沖液，以質量分數計，40ug/ml提取物濃度，對肺癌細胞A549處理48h后，其抑制率達92.3%。
3.按照權利要求1所述的大鯢皮膚黏液提取物在制備抗肺癌藥物中的應用，其特征在于:大鯢皮膚黏液提取物制成針劑、膠囊劑抗肺癌藥物。
【專利摘要】本發明公開了一種大鯢皮膚黏液提取物在制備抗肺癌藥物中的應用。其特征在于：大鯢皮膚黏液通過堿液提取，脫蛋白，離子交換和凝膠層析純化后的真空干燥提取物，以質量分數計，多糖含量為33-35％，蛋白質含量為67-65％，多糖中含有MaN、GlcUA、GalUA、GlcN、Glc、Gal6種單糖，蛋白分子量為30KD。采用MTT法對大鯢皮膚黏液提取物抗肺癌細胞A549抑制試驗，以質量分數計，濃度為40ug/ml提取物，對肺癌細胞A549處理48h后，其抑制率達92.3％。
【IPC分類】A61P35-00, A61K35-65
【公開號】CN104840489
【申請號】CN201510280060
【發明人】陳德經, 徐偉良, 張建強
【申請人】漢中領維生物科技發展有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月23日