一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因技術領域，尤其是涉及一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑在Joubert 綜合征中的應用。
【背景技術】
[0002] Joubert綜合征是一種多基因常染色體隱性遺傳疾病，是一類由于纖毛缺陷 導致的"纖毛缺陷疾病"（ciliopathies)，其發病率約為1/1，000,000。臨床表現主 要有小腦蚓部發育不良、視網膜萎縮、腎囊腫、多指（趾）畸形等。inpp5e(In〇Sit〇l polyphosphate5-phosphataseE)是2009年被確定的Joubert綜合征的致病基因 之一，其蛋白產物INPP5E是一種磷酸肌醇的水解酶。體外酶活性主要表現為分別將 PI(3, 4, 5)P3 (phosphoinositol-3, 4, 5-triphosphate)和PI(4, 5)P2(phosphoinositol -4,5-triphosphate)水解為PI(3,4)P2(phosphoinositol-3,4_biphosphate)和PI(4) P(phosphoinositol-4_phosphate)，體內可能只水解PI(3, 4, 5)P3。Joubert綜合征病人相 關染色體研宄發現，如果突變導致INPP5E在細胞內的定位改變或者酶活性缺失，其病人均 可出現Joubert綜合征表型。由于發病機制尚不清楚，臨床上Joubert綜合征目前無特效 治療方法，主要靠康復治療。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種磷脂酰肌醇 3-激酶抑制劑的應用。
[0004] 本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：
[0005] 利用Morpholino-寡核苷酸反義技術在斑馬魚胚胎中抑制inpp5e的表達，3天 (daypostfertilization,dpf)的胚胎中觀察到腎管膨大和腎囊腫的表型，其結果與 Joubert綜合征的臨床表現一致。免疫熒光標記顯示在腎囊腫表型的胚胎中腎管表皮細胞 中的基體（basalbodies)存在定位缺陷。PI(4, 5)PjPPI(3, 4, 5)P3可通過影響細胞極性 從而影響纖維型肌動蛋白（F-Actin,FibrousActin)以及基體的定位。進一步研宄表明， 通過應用磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol-3_Kinase，PI3K)抑制劑或顯性失活 PI3K(dominantnegativePI3K)抑制PI3K的活性可以緩解由于inpp5e缺失造成的纖毛缺 陷和多囊腎等表型。
[0006] Joubert綜合征的藥物靶點為細胞內PI3K酶。因此本發明提供一種磷脂酰肌醇 3-激酶抑制劑在Joubert綜合征中的應用。
[0007] -種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應用，用于制備治療Joubert綜合征的藥物。
[0008] 所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，緩解由于 inpp5e缺失造成的Joubert綜合征表型。
[0009] 所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑為小分子化合物及其衍生化合物，中藥、植物藥 提取物、有效部位或有效成分，核酸類、多肽類或蛋白質類藥物。可以單獨使用或聯合其他 藥物使用。
[0010] 作為優選，所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑為LY294002。
[0011] 作為另一種實施方式，還可以通過過表達dnPI3K來顯性抑制磷脂酰肌醇3-激酶 活性，所述的dnPI3K為磷脂酰肌醇3-激酶的顯性抑制突變形式。
[0012] 與現有技術相比，本發明的有益效果是，利用磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑，可有效 地改善Joubert綜合征模式動物的多囊腎等表型，對改善Joubert綜合征病人的預后具有 潛在的臨床應用價值。本發明既進一步闡明了Joubert綜合征的發病機制，又為Joubert 綜合征的治療提供了新的治療靶點。
【附圖說明】
[0013] 圖1為抑制inpp5e導致多囊腎生成及纖毛發生缺陷結果；
[0014] 圖2為LY294002緩解因inpp5e缺失而形成的多囊腎和纖毛缺陷統計結果；
[0015] 圖3為過表達dnPI3K抑制inpp5emorphant的囊腫發生統計結果。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0017] 實施例
[0018] LY294002和dnPI3K用于挽救下調inpp5e導致的多囊腎表型的研宄
[0019] 第一步：注射inpp5e嗎啉寡聚核苷酸導致斑馬魚胚胎產生多囊腎表型
[0020] 在發育時期處于1 一 2個細胞期的斑馬魚胚胎中分別注射由GeneTools公司合成 的inpp5emorpholinob' -GCTCACTCATCCTAITGGCGGGCTT-3'，序列如SEQIDN0.1 所 示）6pg和對照組Ctrl嗎啉寡聚核苷酸CCCTCTTACCTCAGTTACAAITTATA-3 ^，序列如 SEQIDNO. 2 所示）6pg。在 72 小時（hourpostfertilization,hpf)時，相比于正常的 ctrl組，在注射了inpp5emorpholino的胚胎中（inpp5emorphant)有70%左右產生腎囊 腫。在inpp5emorphant中共注inpp5e的mRNA可以挽救腎囊腫的表型。Dent's固定胚 胎后進行免疫熒光染色發現inpp5emorphant胚胎的中段腎管出現腫大并且多纖毛和單纖 毛都缺失，見圖1。
[0021] 圖1表示抑制inpp5e導致多囊腎生成及纖毛發生缺陷結果。在72hpf時，相比于 正常的對照組（見圖a)，在注射了inpp5e嗎啉寡聚核苷酸的胚胎中（inpp5e嗎啡啉突變 體）有70 %左右產生腎囊腫（見圖b右上放大圖，c的實驗組）。在inpp5e嗎啡啉突變體 中共注inpp5e的mRNA可以挽救腎囊腫的表型（見圖c的挽救組）。Dent's固定胚胎后進 行免疫熒光染色發現inpp5e嗎啡啉突變體胚胎的中段腎管出現腫大（圖e)并且多纖毛和 單纖毛都存在缺失（見圖e，g'）。aPKC染腎管內徑，acetub染纖毛。比例尺為10納米， ***，p〈0.OOl0
[0022] 第二步：LY294002能夠緩解inpp5e缺失造成的多囊腎
[0023] LY294002,CAS#154447-36-6,SelleckChemicals公司，溶于DMSO配成I. 5mM溶 液。
[0024] 待inpp5emorphant和ctrlmorphant發育至胚盾期，每種morphant分為兩組， 將培養液分別替換為含15M的LY294002的培養液和含1%DMSO的培養液，在第3天觀察胚 胎發現，Ctrlmorphant組中分別加I%DMSO和LY294002的胚胎都能正常發育且無異常表 型。在inpp5emorphant中加1%DMSO培養液的胚胎中發現有76%胚胎存在腎囊腫，但在 加有LY294002的inpp5emorphant組胚胎中只存在35 %的胚胎仍存在腎囊腫，3次重復操 作后統計見圖2。
[0025]inpp5e嗎啡啉突變體用LY294002處理后與DMSO組相比腎囊腫發生比例由75% 下降至35% (圖2左列）。纖毛畸形比例也由85%下調至40% (圖2右列）。*#，p〈0. 001。
[0026] 第三步：dnPI3K挽救實驗
[0027] dnPI3K是PI3K的dominantnegative形式，在胚胎中過表達dnPI3K能起到顯性 抑dnPI3K是PI3K的顯性抑制突變形式，在胚胎中過表達dnPI3K能起到顯性抑制PI3K活 性的作用。
[0028] 取400枚1細胞期的胚胎注射inpp5e嗎啉寡聚核苷酸后，從中隨機取200枚胚胎 加注250pg的dnPI3K。第三天觀察表型時發現，單注inpp5e嗎啉寡聚核苷酸的胚胎中有 80%都存在腎囊腫，但在加注dnPI3K的胚胎中只含有38%的胚胎存在腎囊腫，3次重復操 作后統計見圖3。單注inpp5e嗎啉寡聚核苷酸的胚胎中有80%都存在腎囊腫（柱3)，加注 dnPI3K的胚胎腎囊腫發生率小降至38% (柱4)。*#，p〈0. 001。
[0029] 過表達dnPI3K或者LY294002藥物處理后的inpp5e嗎啡啉突變體胚胎都存在 40 %左右的腎囊腫表型降低，證明通過PI3K酶活性的抑制可有效地改善Joubert綜合征模 式動物的多囊腎表型。
[0030] 上述的對實施例的描述是為便于該技術領域的普通技術人員能理解和使用發明。 熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般 原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限于上述實施例，本領 域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明范疇所做出的改進和修改都應該在本發明的 保護范圍之內。
[0031]
【主權項】
1. 一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應用，用于制備治療Joubert綜合征的藥物。
2. 根據權利要求1所述的一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應用，其特征在于，所述的 磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，緩解由于inpp5e缺失造成的 Joubert綜合征表型。
3. 根據權利要求1所述的一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應用，其特征在于，所述的 磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑為小分子化合物及其衍生化合物，中藥、植物藥提取物、有效部 位或有效成分，核酸類、多肽類或蛋白質類藥物。
4. 根據權利要求1所述的一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應用，其特征在于，所述的 磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑為LY294002。
5. 根據權利要求1所述的一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應用，其特征在于，通過過 表達dnPI3K來顯性抑制磷脂酰肌醇3-激酶活性，所述的dnPI3K為磷脂酰肌醇3-激酶的 顯性抑制突變形式。
【專利摘要】本發明涉及一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應用，用于制備治療Joubert綜合征的藥物，所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，緩解由于inpp5e缺失造成的Joubert綜合征表型。與現有技術相比，本發明利用磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑，可有效地改善Joubert綜合征模式動物的多囊腎等表型，對改善Joubert綜合征病人的預后具有潛在的臨床應用價值。
【IPC分類】A61K45-00, A61P13-12, A61K31-5377, A61P43-00
【公開號】CN104800849
【申請號】CN201510171337
【發明人】曹瑩, 王宏, 許紋衍
【申請人】同濟大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月13日