一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于林產化工領域，具體涉及無患子總皂苷的提取純化方法，尤其涉及一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法。
【背景技術】
[0002]無患子，又稱洗手果或圓肥皂，分布東南亞各國等廣闊地域，資源豐富，在綠化、水土保持、環保等方面有廣泛的應用。隨著對無患子研宄的深入，其化學成分及藥理作用已逐漸被發現，引起人們越來越多的關注。無患子果皮的主要化學成分是無患子皂苷，是一個優良的天然表面活性劑，不僅因具有良好的乳化、分散、發泡、濕潤等功效，作為天然活性物質用于日常生活或化妝品行業，更因其特殊的殺菌、鎮痛、消炎、殺蟲及降血壓的藥理作用被用于細菌感染、農藥乳化劑以及高血壓藥物等領域。
[0003]無患子作為一種多功能植物，無論被用做藥用植物、經濟作物還是園林樹種，均具有巨大的開發潛力。具有特殊生物活性的無患子總皂苷及其苷元的研宄開發是關注的焦點。水提法和有機溶劑提取法是無患子皂苷的主要提取方法。直接水提法得率較高，但同時一些單糖、低聚糖、氨基酸、蛋白質、黏液質、果膠等溶解其中，導致提取物中皂苷純度降低，且水提法也存在用水量大，濃縮成本高、廢水排放多等缺點。此外，受植物細胞壁纖維組織的阻礙，水提法產品收率不高。超聲波產生的振動可以造成植物細胞壁的瞬間破壞，可以促進植物細胞內物質的釋放、擴散及溶解，從而提高提取率，降低水耗。酶具有高效性和特異性，可使植物細胞壁發生不同程度的改變，從而改變細胞壁的通透性，提高有效成分的提取率，但酶制劑的應用所引起的高成本也是亟待解決的問題。有機溶劑提取法雖提取率優于水提，但溶劑消耗量多，費用昂貴，在加上花時長且工藝繁瑣，此外，殘留的部分有機溶劑具有一定程度的毒性，將直接影響產品的質量，后處理對環境污染大。泡沫分離法提取過程中皂素有一定程度的分解，得率偏低；大孔樹脂吸附分離法及超濾法對無患子總皂苷進行分離純化，總皂純度雖然提高，但工業化生產成本居高不下，無法推廣應用。
[0004]微生物發酵是一種新型的無患子皂苷提取純化的方法，其特點在于微生物培養條件粗礦、營養要求不嚴格、繁殖迅速。專利201210211918.1提供一種乳酸菌發酵制備無患子皂素的方法，并利用無患子果皮提取物中的纖維二糖、甘露糖和少量蛋白，經過酶解糖化發酵轉化成乳酸，獲得皂素和乳酸的復配產物，而高濃度的果膠等其他雜質無法有效的去除。專利201010550993.1提供一種無患子總皂苷的提取純化的方法，利用酵母菌或米曲霉發酵對無患子皂苷進行分離純化，但皂苷純度并不高(只有45~60%)。同時，由于酵母菌有氧代謝只消耗葡萄糖，而水提液中的纖維素、果膠等成分無法降解；米曲霉代謝可生產淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等，經繼續反應又會產生糖類。該發明單獨利用兩種微生物菌株，并沒有發揮兩者的協調效應，技術比較單一，針對性不強。還有，提取后并沒有進行純化精制處理，產品的色澤深，呈黃棕色。
[0005]黑曲霉發酵可產生淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等酶類，是降解糖類、蛋白質、果膠、纖維素等物質的優良生物資源；酵母菌發酵糖類的代謝產物以氣體的形式放出，后續處理工藝簡便；兩種菌株先后接入提取液中，不僅專一性降解水提液中的營養成分，而且避免競爭性抑制作用，雜質去除率較高。黑曲霉和酵母菌生長速率快，呼吸作用消耗水提液中大量糖類和水份，一定程度上對皂苷起到了濃縮作用，在工業運用上不僅節約濃縮成本，而且節能環保。總的來說，系統地闡述微生物發酵提取無患子總皂苷的方法及其多種工藝的聯合運用較少報道，純度低、成本高或可操作性差等缺點仍是制約無患子皂苷規模化生產的關鍵因素。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于克服上述無患子總皂苷提取純化方法中存在的缺陷，提供一種成本低廉、操作簡便、健康無毒、純度較高且穩定的無患子總皂苷提取純化的新方法。
[0007]本發明所采用的技術方案為一種微生物發酵無患子制備總皂苷的方法，技術解決方案如下:
將干燥后的無患子果皮粉碎到1~20目，以料液比1:1~10加入去離子水，在25~80°C的恒溫條件下浸提l~24h，重復提取1~5次，濾除不容物后合并提取液；
將馴化后黑曲霉和酵母菌分別接種于YPD培養基中，在20~37°C的條件下培養1~3天，獲得對數期的種子液；
皂苷上清液中添加濃度為0.05-0.1%磷酸氫二鉀和濃度為0.01-0.05%硫酸鎂，接種含量為1% ~10%經馴化后的黑曲霉種子液，在25~37°C的條件下培養2~20天；
再于上清液中接種含量為1% ~10%經馴化后的酵母菌種子液，在20~30°C的條件下培養2-30天；
離心，取無患子皂苷上清液進行濃縮處理，得皂苷質量分數約為50%的濃縮液，在濃縮液中加入一定量的濃度為30%的H2O2，在60°C恒溫環境下脫色處理約2~4h ;
脫色后的濃縮液經噴霧干燥得淡黃色的皂苷粉末，純度大于50%，干燥的環境下密封保存。
[0008]所述的黑曲霉和酵母菌的培養基成分為:1g酵母粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，水1L，若制固體培養基，加入15g瓊脂粉，調節pH值為5。
[0009]本發明與現有技術相比，具有以下明顯的優勢和有益效果:
微生物本身具有生長速度快、生長條件簡單和代謝過程特殊等特點，經生長條件(接種量、接種齡、發酵溫度、發酵時間)的優化，馴化后的微生物菌株在提取液中可大量繁殖，不僅抑制皂苷提取液中其他雜菌的生長，而且專一性并最大程度地降解水提液中的營養成分，從而提高無患子總皂苷的純度。除去雜質的皂苷濃縮液經過脫色處理，干燥后所得皂苷可以直接用于各種洗護用品和化妝品中。
[0010]【具體實施方式】實施例1
無患子果皮于60°c烘箱中烘干，粉碎過20目篩，取無患子果皮粉1Kg放入100L萃取器中，加20L去離子水，常壓、30°C恒溫浸提兩次，每次4h，合并提取液并離心，得低純度提取液。在YPD培養基中逐步加入無患子果皮水提液，讓兩種菌株循序漸進的適應該發酵環境，馴化出對水提液具有耐受性的微生物菌株。在皂苷上清液中添加0.05-0.1%磷酸氫二鉀和0.01-0.05%硫酸鎂，先接種3%馴化后的黑曲霉種子液，28°C下恒溫培養7天，再接種3%馴化后的酵母菌種子液于上清液中，25°C下恒溫培養10天，離心分離得到上清液。上清液進行濃縮，得皂苷質量分數約為50%的濃縮液，在濃縮液中加入一定量的30%的H2O2,60°C的恒溫環境下脫色處理約2h。用噴霧干燥器對上清液進行脫水，得到無患子總皂苷粉末產品4 Kg，總皂苷提取率為18%，總皂苷純度50%。
[0011]實施例2
無患子果皮于60°C烘箱中烘干，粉碎過20目篩，取無患子果皮粉10 Kg放入100L萃取器中，加40 L去離子水，常壓、40°C恒溫浸提兩次，每次6h，合并提取液并離心，得低純度提取液。在YPD培養基中逐步加入無患子果皮水提液，讓兩種菌株循序漸進的適應該發酵環境，馴化出對水提液具有耐受性的微生物菌株。皂苷上清液中添加0.05-0.1%磷酸氫二鉀和0.01-0.05%硫酸鎂，先接種5%對數期的黑曲霉種子液于水提液中，300C下恒溫培養10天，再接種5%對數期的酵母菌種子液于上清液中，30°C下恒溫培養15天，離心分離得到上清液。將無患子皂苷上清液進行濃縮，得皂苷質量分數約為50%的濃縮液；在濃縮液中加入一定量的30%的H2O2,60°C的恒溫環境下脫色處理約3h。用噴霧干燥器對上清液進行脫水，得到無患子總皂苷粉末產品4 Kg,總皂苷提取率為20%，總皂苷純度60%。
[0012]實施例3
無患子果皮于60°C烘箱中烘干，粉碎過20目篩，取無患子果皮粉10 Kg放入100L萃取器中，加30 L去離子水，常壓、50°C恒溫浸提三次，每次8h，合并提取液并離心，得低純度提取液。在YPD培養基中逐步加入無患子果皮水提液，讓兩種菌株循序漸進的適應該發酵環境，馴化出對水提液具有耐受性的微生物菌株。皂苷上清液中添加0.05-0.1%磷酸氫二鉀和0.01-0.05%硫酸鎂，先接種7%對數期的黑曲霉種子液于水提液中，370C下恒溫培養15天，再接種7%對數期的酵母菌種子液于上清液中，30°C下恒溫培養25天，離心分離得到上清液。將無患子皂苷上清液進行濃縮，得皂苷質量分數約為50%的濃縮液；在濃縮液中加入一定量的30%的H2O2,60°C的恒溫環境下脫色處理約4h。用噴霧干燥器對上清液進行脫水得到無患子總皂苷粉末產品4 Kg,總皂苷得率為24%，總皂苷純度65%。
【主權項】
1.一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法，其特征在于本發明包括以下步驟: (O將干燥后的無患子果皮粉碎到1~20目，以料液比加入去離子水，在25~80°C的恒溫條件下浸提l~24h，重復提取1~5次，濾除不容物后合并提取液； (2)黑曲霉和酵母菌分別接種于YPD培養基，在20~37°C的條件下培養1~3天，獲得種子培養液；(3)接種含量為1%~10%的黑曲霉于提取液中，在25~37°C的條件下培養2~20天； (4)再接種含量為1%~10%的酵母菌于上清液中，在20~30°C的條件下培養2~30天，離心取上清液； (5)將無患子皂苷上清液進行濃縮，得皂苷質量分數約為50%的濃縮液，在濃縮液中加入一定量的H2O2進行恒溫脫色處理； (6)脫色后的濃縮液經噴霧干燥得皂苷粉末，干燥環境下密封保存。
2.根據權利要求1所述的一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法，其特征在于所述的培養過程中先后加入黑曲霉和酵母菌兩種微生物進行發酵。
3.根據權利要求1所述的一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法，其特征在于所述的接種于水提液中的黑曲霉和酵母菌是經過馴化的，對無患子水提液有一定耐性。
4.根據權利要求1所述的一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法，其特征在于所述的皂苷上清液中添加濃度為0.05-0.1%磷酸氫二鉀和濃度為0.01-0.05%硫酸鎂。
5.根據權利要求1所述的一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法，其特征在于所述的濃縮液中加入H2O2脫色處理。
6.根據權利要求1所述的一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法，其特征在于所述的皂苷粉末經噴霧干燥得到。
7.根據權利要求6所述的一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法，其特征在于所述的H2O2濃度為30%，脫色溫度為60 °C，脫色時間為2~4h。
【專利摘要】本發明涉及無患子總皂苷的提取純化方法，尤其涉及一種微生物發酵制備無患子總皂苷的方法，主要工藝步驟為：將干燥后的無患子果皮粉碎后，在25~80℃的溫度下加水浸提l~24h。先后接種含量為1％~10％的經馴化后的黑曲霉和酵母菌，在20~37℃的溫度下發酵2~30d，利用微生物發酵水提液中的糖類、蛋白質等營養成分，皂苷含量保持基本不變，上清液濃縮后用H2O2進行脫色處理，離心、噴霧干燥得皂苷粉(純度大于50%)，本發明為無患子總皂苷提取純化提供一種成本低廉、工藝便捷、綠色環保、純度較高且穩定的新方法，所得皂苷可直接用于各種洗護用品和化妝品中。
【IPC分類】A61K8-97, A61K36-77
【公開號】CN104800110
【申請號】CN201510085953
【發明人】王珊珊, 陳登龍, 李敏, 黃秀萍, 劉金玲, 王勇
【申請人】福建師范大學泉港石化研究院
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年2月23日