重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物免疫領域，涉及重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途。
【背景技術】
[0002] 雖然人、畜、禽在免疫學結構方面存在差異，但針對抗原發生免疫反應的生物模式 方面存在很多共同點，在人類疾病防控領域普遍應用的免疫佐劑，在禽、畜體內同樣發揮作 用。作為人類整體，其健康質量的提升、平均壽命的延長，很大部分得益于對各種可致流行 病的病原體的抵抗；而后者則依賴于針對各種病原體的疫苗的研發和免疫方法的建立。目 前在某些地區，病原體感染仍是威脅人類健康的重大殺手，如引起愛滋病的HIV感染、人畜 共患的SARS、禽流感、埃博拉病毒感染等，以及并非致命的感染如瘧疾等。同時，對于一些非 感染性疾病，若其發病機制與免疫失功相關，如腫瘤，則也可應用疫苗接種途徑，誘導機體 產生針對特定抗原(如腫瘤相關抗原）的免疫力，從而達到預防或治療疾病的目的。
[0003] 除增強人類自身健康狀況外，為人類提供足夠并健康的畜、禽制品，也是提升人 類整體生活質量的保障手段之一。因此，研發適用于畜、禽生產的疫苗以促進養殖業的健康 發展，同樣具有重大意義。
[0004] 決定疫苗成敗的三個主要因素包括特異性抗原、佐劑和免疫途徑，其中后兩者常 為領域內公共待解決的問題，因此具有更重大的研宄意義。即便針對同一種抗原，采用不同 的佐劑或應用不同的免疫途徑，都可能引起不同的免疫防治效果。目前公共衛生防治領域 常用的免疫途徑仍為皮下粘膜或肌肉注射。隨著生物醫學技術的發展，近二十年在經粘膜 免疫途徑方面開展了大量工作，被認為最終將取代傳統免疫途徑。與其對應的則是尋找新 型的免疫佐劑。目前被公認較有前景的粘膜免疫佐劑(也適合傳統免疫途徑)主要包括霍亂 毒素、大腸桿菌熱敏感腸毒素和人工合成的非甲基化的CpG類寡核苷酸。
[0005] 在相當長的時間里，鋁劑（以氫氧化鋁為主，還有硫酸鋁、氧化鋁凝膠等）是唯一被 批準在美國使用的免疫佐劑。隨后，在歐洲和加拿大上市的MF59,為角鯊烯squalene納米 油劑，用于流感；在防治16/18型乳頭狀瘤病毒引起的宮頸癌疫苗Cervarix中，使用的是氫 氧化鋁與單磷酸脂質A (MPL)的混合物（AS04)。2013年，為應對嚴重的禽流感威脅，美國FDA 緊急批準在H5N1疫苗中使用的佐劑AS03,是維生素 E、角鯊烯和polysorbate (聚山梨醇 酯，又稱吐溫80)的混合物；只是該疫苗未公開售用，但在衛生官員認為需要時可以使用。 目前世界上有上百種基于各種機制、具有各種結構、針對不同使用目的的佐劑候選制品，處 于研發的不同階段。在我國，國家食品藥品監督管理局于二〇〇五年十月十四日發布的"多 肽疫苗生產及質控技術指導原則"中也明確闡明："傳統佐劑是在礦物膠基礎上制成-氫氧 化鋁、磷酸鋁或磷酸鈣，到目前為止批準使用的佐劑鮮為他類"。為此，研發基于我國自主創 新發現的新型免疫佐劑，具有重要的意義。
[0006] -種良好的佐劑能增強機體對特異性抗原的免疫應答，但本身不引起不需要的作 用。目前使用或在研的多數佐劑，作用機制主要包括兩種方式：通過物理方法延長疫苗抗原 的作用時間，或通過刺激先天性免疫系統而放大機體針對抗原產生的特異性免疫反應。比 如動物實驗中應用最多的不完全弗氏佐劑即通過其內油脂類物質保護抗原不被迅速稀釋 降解，而完全弗氏佐劑中的菌體則刺激機體的免疫系統。雖然完全弗氏佐劑也可引起針對 其內菌體抗原的特異性免疫反應，但因為該佐劑內的細菌實為致病菌，所以針對其產生的 特異性抗體或細胞免疫效應細胞并不對宿主產生不良效果。現在已知弗氏佐劑中的菌體發 揮作用的主要機制是其各種結構成分如脂多糖、蛋白多糖、胞內DNA等病原體相關模式分 子（Pathogen-Associated Molec μ Lar Pattern)對宿主細胞上Toll樣受體的激活，引起 后續免疫刺激效應。近些年研宄較多的基于CpG免疫刺激現象的佐劑，通過激活Toll樣受 體9而活化抗原提呈細胞和B細胞，從而增強對抗原的反應。毒素類佐劑則通過刺激粘膜 局部的炎性反應，放大對抗原的免疫反應。目前基于CpG免疫刺激現象的佐劑研發比較引 人注目，主要由于以下原因：CpG免疫刺激現象較為明顯；CpG類寡核苷酸容易制備；當CpG 寡核苷酸長度控制在一定范圍內時，其免疫原性十分微弱；除了其核心部位的CpG序列不 能變更外，其側翼序列可有很多的變通方法，因此較易以新的序列研發自己的產品。
[0007] 在來源于細菌的佐劑候選制劑中，基于鞭毛成分者也值得關注。首先，曾有文 獻表明完整鞭毛具有佐劑效應（Ruiz AM, et al. Immunoprotection of mice against Trypanosoma cruzi with a lyophilized flagellar fraction of the parasite plus adjuvant. Immunol Lett 1986; 12:1-4)。至 1997 年 Toll 樣受體系列被發現（Medzhitov R, et al. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 1997; 388:394-397)后，于 2001 年證實鞭毛的佐劑效應 是通過鞭毛體的主要部分（即鞭毛纖維）所含鞭毛蛋白FliC作用于Toll樣受體5 (TLR5) 而實現的（Hayashi F, et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 2001; 410:1099-1103)。目前國內外均 有部分專利對FliC相關制劑的佐劑性應用進行保護。以"鞭毛蛋白and佐劑"搜索國家 專利局的專利公布公告數據庫，返回四條記錄（圖2)，申請人分別來自中國和法國，專利對 鞭毛蛋白在人或禽疫苗中的應用進行保護。必須指出的是，目前已有的國內外所有應用鞭 毛蛋白作為佐劑或者其他方面應用的專利（比如腫瘤治療等）中所指的"鞭毛蛋白"，無一例 外均指由基因FliC編碼的flagellin type B，因其對應于鞭毛體纖維部分，因此傳統被稱 為filament C (FliC)，與本專利所保護的FlgE是由不同基因編碼的不同蛋白（表1)。采 用Pubmed的BLAST程序和SimGene的CLUSTALW2程序分別對二者進行同源比較，顯示FliC 和FlgE在蛋白序列方面同源性極低。
[0008] 表1.綠膿桿菌PAOl菌株中，"鞭毛蛋白"與"鞭毛鉤蛋白"的對比
【主權項】
1. 重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的用途為重組綠膿桿菌鞭 毛鉤蛋白FlgE在制備免疫佐劑或疫苗中的用途。
2. 根據權利要求1所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的 免疫佐劑為用于預防或治療腫瘤、感染性疾病的免疫佐劑。
3. 根據權利要求1所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的 疫苗為用于預防腫瘤或感染性疾病的疫苗。
4. 根據權利要求3所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的 疫苗為禽類或畜類疫苗。
5. 根據權利要求2或3所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所 述的感染性疾病包括病毒感染性疾病、細菌感染性疾病或寄生蟲感染性疾病。
6. 根據權利要求2或3所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所 述的感染性疾病包括肺炎、腦膜炎、腸炎、禽流感或艾滋病。
7. 根據權利要求2或3所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所 述的腫瘤包括基底細胞癌、移行細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、惡性血管外皮瘤、惡性血管外皮 瘤、B細胞性惡性淋巴瘤、T細胞性惡性淋巴瘤或造釉細胞癌。
【專利摘要】本發明屬于生物免疫領域，本發明公開了重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，所述的用途為重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE在制備免疫佐劑或疫苗中的用途；尤其是免疫佐劑用于預防或治療腫瘤或感染性疾病的用途。本發明提供了以綠膿桿菌PAO1株為模型菌株，證明重組表達的FlgE單體，可以刺激人角膜上皮細胞或小鼠肺組織發生炎性反應，并能表現出顯著的佐劑效應，為其應用于免疫佐劑奠定了基礎。
【IPC分類】A61P35-00, A61K39-39, A61K39-00, A61P31-00, A61P33-00, A61P31-04, A61P37-04
【公開號】CN104784687
【申請號】CN201510201954
【發明人】王宜強, 沈瑩, 唐華, 邵聯波
【申請人】蘇州大學附屬第一醫院, 泰山醫學院
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月27日