基于白蛋白為載體材料的載姜黃素肝靶向納米粒的制備
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥領域，具體涉及一種基于白蛋白為載體材料載姜黃素的肝靶向納米粒的制備方法
【【背景技術】】
[0002]原發性肝癌是我國常見的嚴重威脅著人類健康的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率呈上升趨勢，所帶來的經濟負擔及對社會發展的危害日益凸顯。化療仍然是目前臨床上治療肝癌的主要手段，但由于常規化療藥物不能選擇性的運輸到病灶部位而產生嚴重的毒副作用。隨著肝靶向給藥系統研宄的不斷發展，國內外對甘草中的有效成分甘草酸、甘草次酸的研宄給予了廣泛的關注，尤其是對甘草次酸的共價修飾和構效關系之間的研宄。Negishi等已經證實肝細胞膜上存在大量甘草次酸特異性結位點，且該結合位點具有高度特異性和飽和性。近年來國內學者也對肝細胞膜上的甘草次酸特異結合位點進行了大量研宄，甘草次酸作為肝靶向配體表現出一定的潛力，通過甘草次酸介導有望增加藥物在肝臟分布，提高藥物的肝靶向性，提高肝臟相關疾病的治療效果。
[0003]基于白蛋白的納米給藥系統在醫藥領域引起了廣泛的關注，主要是由于其具有低免疫原性，可生物降解和良好的生物相容性。目前中國專利CN103054810A公開了一種高包封率姜黃素白蛋白納米藥物組合物。中國專利CN102336802A公開了甘草次酸修飾脂質、肝靶向脂質體、膠束及復合物和制法。中國專利CN102512369A公開了甘草次酸固體脂質納米粒及其制備方法。中國專利CN101254308公開了甘草次酸-聚乙二醇/殼聚糖肝靶向復合給藥系統及制備方法。經過專利及文獻查詢，具有主動靶向給藥系統的技術一一甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒未見報道。
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【發明內容】
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[0004]本發明所要解決的關鍵問題是制備一種具有肝靶向的納米粒一一甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒，提供一種具有緩釋作用，選擇性地作用于肝細胞，減少藥物毒副作用的主動肝靶向納米給藥系統的制備方法。
[0005]本發明的技術方案如下:
[0006]步驟1:將甘草次酸溶于20mL無水二甲基亞砜中，加入0.5mL的三乙胺，在攪拌的條件下分別加入0.94g N，N’ - 二環己基碳二亞胺(DCC)和0.52g的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫避光攪拌24h，得到淡黃色的混懸液。過濾，除去反應中的副產物二環己基脲，再攪拌條件下加入無水乙醚以析出固體并真空干燥，得到淡黃色固體粉末。
[0007]步驟2:稱取0.0095?0.0104g白蛋白粉末溶于1.0mL的超純水中，另稱取0.0035-0.0044g姜黃素6.0mL的無水乙醇，將藥物的乙醇溶液以0.1?5.0mL/min的速度滴加到白蛋白水溶液中，加入50.0 UL 0.5%戊二醛，攪拌固化4h，于35.0°C旋轉蒸發除去乙醇，即得載藥白蛋白納米粒混懸液。
[0008]步驟3:將步驟(I)中制備的甘草次酸活性酯溶于0.5mL的DMSO中以0.5-1.0mL/min的滴加到3.5mL步驟(2)中制備的姜黃素白蛋白納米粒中，室溫避光攪拌lh。
【附圖說明】
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[0009]圖1甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒的粒徑分布圖
[0010]圖2甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒的外觀圖[0011 ]圖3甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒透射電鏡
[0012]圖4體外釋放圖
[0013]圖5不同制劑作用24h的體外細胞毒性試驗【具體實施方式】:
[0014]以下通過實施例對本發明進一步詳細說明:
[0015]實施例:
[0016]1.甘草次酸活性酯的制備
[0017](a)稱取1.0g甘草次酸于50mL圓底燒瓶中，向其中加入20.0mL無水二甲基亞砜中，在加入0.5mL的三乙胺，磁力攪拌溶解。
[0018](b)在攪拌的條件下分別加入0.94g N，N’_ 二環己基碳二亞胺(DCC)和0.52g的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫避光攪拌24h，得到淡黃色的混懸液。過濾，除去反應中的副產物二環己基脲，再攪拌條件下加入無水乙醚以析出固體并真空干燥24h，得到淡黃色固體粉末。
[0019]2.姜黃素白蛋白納米粒的制備
[0020]稱取0.0095?0.0104g白蛋白粉末溶于ImL的超純水中，另稱取0.0035-0.0044g姜黃素于6mL的無水乙醇，將藥物的乙醇溶液以0.1?5mL/min的速度滴加到白蛋白水溶液中，加入50.0 UL 0.5%戊二醛，磁力攪拌固化4h，與35.0°C旋轉蒸發除去乙醇，即得載藥白蛋白納米粒混懸液。
[0021]3.甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒的制備:
[0022]將(I)中制備的甘草次酸活性酯溶于0.5mL的DMSO中，以0.5-1.0mL/min的滴加到3.5mL(2)中制備的姜黃素白蛋白納米粒中，室溫避光攪拌lh。采用凝膠色譜柱法(Sephadex G_50柱)分離甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒和未偶聯的甘草次酸。所得納米粒的粒徑分布，見圖1 ;外觀圖，見圖2 ;透射電鏡照片，見圖3。
[0023]4.體外釋放行為的考察
[0024]本發明采用透析袋法，甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒在PBS(pH7.4)中釋藥的特性，見圖4。結果表明，甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒的藥物釋放具有一定的緩釋性。
[0025]5.MTT法檢測甘草次酸修飾的姜黃素白蛋白納米粒對人肝癌H印G2細胞的抑制作用
[0026]取對數期生長的H印G2細胞，棄去培養液，用0.25%胰蛋白酶消化l_2min，再用含血清的培養液終止消化，于100rpm離心5min，棄去上清液，加入新鮮含血清的培養液，制成單細胞懸液，調整細胞密度至5 X 13個/mL,輕輕吹勻后接種于96孔板，每孔100 μ L，置于37°C，5% 0)2的培養箱中培養24h后，分別加入含不同濃度的姜黃素原料藥，姜黃素白蛋白納米粒以及甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒的培養液，每孔100 μ L，使藥物終濃度分別為27.15，81.44，135.73 μ mol/L，其中以加細胞懸液，不加含藥物的培養液為對照組，以不加細胞懸液，不加含藥物的培養液為空白組。每組6個復孔，繼續置于37°C，5% CO2的培養箱中培養24h，再每孔加入5mg/mL MTT液20 μ L于培養箱中繼續培養4h，經濾紙吸去上清液，每孔加入150 μ L DMS0，振搖lOmin，待藍紫色的甲瓚充分溶解混勻，用酶標儀于570nm處檢測每孔的OD值。計算每組細胞存活率，見圖5。結果表明，與姜黃素混懸液和姜黃素白蛋白納米粒相比，甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒作用的H印G2細胞存活率顯著下降，并且具有濃度依賴性。說明白蛋白納米粒表面修飾甘草次酸之后，在甘草次酸介導作用下，能更有效的將藥物遞送于人肝癌HepG2細胞內。
【主權項】
1.一種肝靶向的納米粒一一甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒，其特征在于:該載藥納米粒包括姜黃素、白蛋白和甘草次酸。該肝靶向納米粒主要是由甘草次酸的羧基與二環己基碳二亞胺(DCC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應制得甘草次酸活性酯，再與白蛋白表面的氨基反應得到。
2.根據權利要求1所述，其特征在于:甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒各組分配比關系如下:姜黃素和白蛋白的質量比為1:1?40。
3.根據權利要求1所述，其特征在于:白蛋白載體材料可以是人血清白蛋白，牛血清白蛋白，卵清蛋白或其他種類的白蛋白。
4.根據權利要求1所述甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒，其特征在于:所述肝靶向納米粒的粒徑50nm?500nm，載藥量為5%?50%。
5.根據權利要求1所述的一種甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒的制備方法，包括以下步驟: 步驟(I):制備甘草次酸活性酯。 步驟(2):采用去溶劑法制備載姜黃素白蛋白納米粒。 步驟(3):將步驟(I)中制備的甘草次酸活性酯溶于0.5mL的DMSO中以0.5-lmL/min的滴加到3.5mL步驟(2)中制備的姜黃素白蛋白納米粒中，室溫避光攪拌lh，再采用凝膠過濾法去除未反應完的原料和副產物，得到甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒。
【專利摘要】本發明公開了一種基于白蛋白為載體材料載姜黃素的肝靶向納米粒的制備方法，屬于醫藥領域。具體的說是通過共價結合制備了一種肝靶向納米粒——甘草次酸修飾姜黃素白蛋白納米粒。該載藥納米粒包括姜黃素、白蛋白和甘草次酸。該肝靶向納米粒主要是由甘草次酸通過共價結合到載藥白蛋白納米粒表面構成。本發明制備的肝靶向納米粒具有緩釋的效果，可通過甘草次酸介導姜黃素白蛋白納米粒靶向到肝細胞，降低藥物的毒副作用，提高藥物的療效，制備工藝簡單且生產成本低，具有廣泛的應用前景。
【IPC分類】A61K47-42, A61K31-12, A61K9-14, A61P35-00, A61P1-16, A61K47-28
【公開號】CN104758251
【申請號】CN201510217357
【發明人】張良珂, 李靜靜, 鄧鳳, 李圳
【申請人】重慶醫科大學
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月30日