千層紙素苷在制備抗腫瘤藥中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于抗腫瘤藥領域，涉及千層紙素苷在制備抗腫瘤藥中的應用。
【背景技術】
[0002] 抗腫瘤藥物通過不同的機制發揮抗腫瘤的作用，如有文獻將化療藥物按傳統分類 分為烷化劑、抗代謝藥、抗癌抗生素、植物藥、激素及雜類；有按作用機制分類為直接破壞 DNA藥物、插入DNA模板藥物、干擾核酸合成藥物、抑制微管裝配藥物、影響蛋白質合成藥 物、其他作用機制類藥物等等。了解抗腫瘤藥的作用機制更有利于在臨床治療腫瘤時根據 腫瘤與藥物的特征正確選擇相應藥物。
[0003] 千層紙素是黃芩的活性組分之一，具有明顯的抗腫瘤作用，是一個具有廣闊應用 前景的天然抗腫瘤藥物。然而，千層紙素藥理作用廣泛，其抗腫瘤作用的機制目前尚未完全 闡明。千層紙素 A-7-葡萄糖醛酸苷（千層紙素苷，Oroxyloside，OAG)也是黃芩的活性組 分之一，與千層紙素并非同一物質，目前對千層紙素苷的研宄較少，相關藥理作用的研宄尚 未見報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供千層紙素苷在制備抗腫瘤藥中的應用。
[0005] 本發明的目的是通過下列技術措施實現的：
[0006] 千層紙素苷在制備抗腫瘤藥中的應用，尤其是針對肝癌的抗腫瘤藥，其發揮抗腫 瘤作用的機制是千層紙素苷針對腫瘤細胞具有生長抑制和殺傷作用。其制劑可以是藥學上 允許的任意一種劑型，包括但不限于片劑、顆粒劑、丸劑、口服液、注射劑、膜劑、膠囊劑、月旨 質體等。千層紙素苷的用量可根據用藥途徑、患者年齡、體重、體表面積、所治療的疾病類型 和嚴重程度及療程安排等變化，其日劑量可以是200-8000mg，可以一次或多次施用。
[0007] 本發明有益效果：
[0008] 千層紙素苷通過對腫瘤細胞產生生長抑制及殺傷作用從而起到抗腫瘤作用，具有 較好的效果，可制備成各種劑型的抗腫瘤的藥物，為腫瘤病人提供了更好的選擇。
【附圖說明】
[0009] 圖1.千層紙素苷對H印G2的凋亡誘導作用。
[0010] 圖2.千層紙素苷對!fepG2的凋亡誘導作用的量化。
[0011] 圖3. OAG對人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤的生長抑制作用。
[0012] 圖4. OAG對人肝癌細胞H印G2裸鼠移植瘤瘤重的影響。
[0013] 圖5. OAG對人肝癌細胞H印G2裸鼠異種移植腫瘤實驗動物體重的影響。
【具體實施方式】
[0014] 以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
[0015] 藥效實施例1 :OAG對人肝癌細胞H印G2細胞的凋亡誘導作用
[0016] 1、實驗材料
[0017] ⑴藥物
[0018] 千層紙素 A-7-葡萄糖醛酸苷（千層紙素苷，Oroxyloside，OAG)從市場購得，淺黃 色粉末。含量：90%，用DMSO配成母液，置于-20°C保存。臨用前用RPMI-1640培養液配成 所需濃度。
[0019] ⑵細胞株
[0020] 人肝癌細胞H印G2來自中國科學院上海生命科學研宄所生物化學與細胞生物學 研宄所細胞庫，用含10%小牛血清的1640培養液培養。
[0021] ⑶試劑
[0022] 1)培養液：RPMI-1640培養基，美國GIBCO公司產品。取RPMI-1640粉末10. 4g溶 于1000 mL滅菌三蒸水中，用似!10)3調pH值至7. 3~7. 4,圓筒式過濾器過濾除菌、分裝，4°C 冰箱保存。使用前加入10%胎牛血清、lOOU/mL青霉素和100mg/L鏈霉素。
[0023] 2)小牛血清：杭州四季青生物工程公司產品。經56°C水浴滅活30min，分裝并保 存于-20 °C低溫冰箱中。
[0024] 3)PBS 緩沖液：稱取 NaCl 8. 0g、KCl 0· 20g、Na2HPCM · H2O I. 56g、KH2PO4 2. 0g，溶 于1000 mL三蒸水中，高壓滅菌，4°C冰箱保存。
[0025] 4) 0. 02% EDTA溶液：稱取EDTA 20mg，溶于IOOmL PBS緩沖液中，低速攪拌，調pH 值至7. 3~7. 4,圓筒式過濾器過濾除菌、分裝，4°C冰箱保存。
[0026] 5)0. 25%胰酶：稱取胰酶0. 25g，溶于IOOmL PBS緩沖液中，高壓滅菌。
[0027] 6)DMSO 溶液：美國 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo)公司產品
[0028] 7)Annexin-V/PI雙染試劑盒：購自凱基公司。
[0029] 2、實驗儀器：
[0030] I)YJ-875型醫用凈化工作臺：蘇州凈化設備廠生產。
[0031] 2)3111型水套式CO2培養箱：美國Thermo electron公司產品。
[0032] 3)電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司產品。
[0033] 4)LD4-2普通離心機：北京醫用離心機廠產品。
[0034] 5) Centrifuge 5810R 型離心機：德國 Eppendorf 公司產品。
[0035] 6)FACSCalibur 流式細胞儀：美國 Becton Dickinson(BD)公司產。
[0036] 3、實驗方法：
[0037] (1)流式細胞儀檢測細胞凋亡率
[0038] 將H印G2細胞以濃度為5X105個/L接種于6孔培養板，置于37°C、5% CO2培養 箱內培養24h后，加入終濃度為25、50和100 ymol/L的千層紙素苷處理細胞48h。消化收 集細胞，l〇〇〇r/min離心5min，PBS液洗絳1次，離心去PBS，加入冰預冷的500 μ I Binding Buffer重懸，然后分別加入5 μ Annexin V和PI染料，常溫染色20min，染色后經流式細胞 儀（Becton-Dickinson FACSCalibur)檢測，實驗數據由 CellQuest 軟件分析。〇
[0039] 4、實驗結果：
[0040] 實驗結果顯示，如圖1及圖2,千層紙素苷（25, 50,100 μ M)作用于人肝癌H印G2細 胞24h后，能誘導其發生凋亡，凋亡率分別為18. 68%，30. 63%，48. 3%，具有劑量依賴性。
[0041] 藥效實施例2 :OAG對人肝癌細胞H印G2裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用
[0042] 1、實驗材料
[0043] (1)受試藥物：千層紙素 A-葡萄糖醛酸苷從市場購得，純度為99%以上，制成凍干 粉末，使用前用注射用生理鹽水將藥物配成所需濃度。
[0044] (2)對照藥物：氟尿嘧啶注射液，購自天津金耀藥業有些公司，批號：140929,規 格：10ml/支。配制方法：給藥前精密吸取氟尿嘧啶注射液0. 12ml，溶解于0. 9%氯化鈉注 射液（生產廠家：辰欣藥業股份有限公司；批號：1303207021 ;規格：500ml*0· 9% )0· 88ml 配制成濃度為3mg/ml的液體，給藥體積為0. 2ml/20g，即給藥劑量為30mg/kg。
[0045] ⑶實驗動物
[0046] 來源、種系、品系：BALB/c裸小鼠，由中國軍事醫學科學院實驗動物研宄中心提供 (實驗動物生產許可證：SCXK (軍）2007-004)。日齡：35-40天，體重：18-24g，性別：雌性。
[0047] 2、實驗方法：
[0048] (1)實驗動物分組
[0049] 陰性對照組（空白對照） 12只 陽性對照組（5-FU 30mg/kgi.v.三天一次） 6只 藥物治療組（OAG90mg/kg Lv.三天一次） 6只 藥物治療組（〇AG45mg/kg i.v.三天一次） 6只
[0050] (2)造模方法
[0051] 取對數生長期的人肝癌細胞H印G2細胞株，在無菌條件下后制備成2 X IO8Ail細 胞懸液，以0.1 ml接種于裸小鼠右側腋窩皮下。裸小鼠移植瘤用游標卡尺測量移植瘤直徑， 待腫瘤生長至100~300mm3后將動物隨機分組。使用測量瘤徑的方法，動態觀察被試物抗 腫瘤的效應。腫瘤直徑的測量次數為每2-3天測1次，。給藥體積為0. 2ml/20g。19天后， 小鼠處死，手術剝取瘤塊稱重。腫瘤體積（tumor volume，TV)的計算公式為：
[0052] TV =1/2 XaXb2
[0053] 其中a、b分別表示長寬。
[0054] 根據測量的結果計算出相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV)，計算公式 為：RTV = VtZiVtl。其中Vtl為分籠給藥時（即(I tl)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的 腫瘤體積。抗腫瘤活性的評價指標為相對腫瘤增殖率T/C(%)，計算公式如下：
[0055] T/C(% ) = Tetv/CetvX100%
[0056] Tktv:治療組RTV ;C κτν:陰性對照組RTVo
[0057] 抑瘤率計算公式如下：
[0058] 抑瘤率（％ ) = (l-Tweight/Cweight) Χ100%
[0059] Tweight:治療組平均瘤重；C weight:陰性對照組平均瘤重。
[0060] 3、結果：
[0061] 千層紙素苷對人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤的實驗性治療結果見表1，2和圖3,4， 5。實驗結果如下，OAG分別以90mg/kg，45mg/kg尾靜脈注射給藥，3天一次，給藥21天，共 給藥7次。實驗組對人肝癌細胞H印G2裸小鼠移植瘤的T/C分別為56. 74%，71. 57% ;抑 瘤率分別為40. 23%，28. 45%。5-FU以30mg/kg尾靜脈注射給藥，3天1次，給藥21天，共 給藥7次后對人肝癌細胞H印G2裸小鼠移植瘤的T/C為30. 74 %，抑瘤率達70. 11 %。其中 5-FU 30mg/kg劑量組對實驗鼠體重有極顯著影響（P〈0. 01)。
[0062] 結論：千層紙素苷對肝癌HepG2細胞有明顯生長抑制和殺傷作用。
[0063] 表1 :OAG對人肝癌細胞HepG2裸鼠異種移植腫瘤生長體積變化的影響（X土SD，腫 瘤體積：單位mm3)
[0064]
【主權項】
1. 千層紙素苷在制備抗腫瘤藥中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的腫瘤是肝癌。
3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的抗腫瘤是指對腫瘤細胞具有生長抑 制和殺傷作用。
【專利摘要】本發明屬于抗腫瘤藥領域，公開了千層紙素苷在制備抗腫瘤藥中的應用。根據本發明提出了千層紙素苷在制備抗腫瘤藥中的應用，可將千層紙素苷制備成各種劑型的治療腫瘤的藥物，為腫瘤病人提供了更好的選擇。
【IPC分類】A61K31-7048, A61P35-00
【公開號】CN104706649
【申請號】CN201510115263
【發明人】郭青龍, 盧娜, 魏立彬, 趙麗, 李志裕, 周煜新
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年3月16日