一種雞傳染性支氣管炎病毒抗原及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于家禽疫苗技術領域，具體涉及一種用于雞傳染性支氣管炎病毒的血凝 或血凝抑制試驗的雞傳染性支氣管炎病毒抗原及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 雞傳染性支氣管炎（IB)是由傳染性支氣管炎病毒（IBV)引起的一種急性高度接 觸性呼吸道疾病，以氣管啰音、咳嗽、打噴嚏；幼雞流鼻涕，產蛋雞產蛋量減少和蛋的品質下 降為特征；患病的雞常因呼吸道、腎臟或消化道感染而引起死亡。傳支抗原特性，病毒本身 血凝性，須經特殊處理才能釋放出凝集紅細胞的受體，出現血凝性。目前傳染性支氣管苗的 效力檢驗主要采用攻毒保護方法。攻毒保護存在散毒風險，因此找到血清學替代方法非常 必要，血清學方法中血凝及血凝抑制最為簡單可行，并制備血凝抗原就顯得尤為重要。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種用于雞傳染性支氣管炎病毒的血凝或血凝抑制試驗 的雞傳染性支氣管炎病毒抗原及其制備方法。
[0004] 本發明采用的技術方案是：
[0005] -種雞傳染性支氣管炎病毒抗原，包含病毒液和輔劑，所述病毒液為呼吸型 IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或腎型IBV-T株毒種的病毒液。所述輔劑為明膠、蔗糖、聚乙 二醇、甘露寡糖或殼聚糖等耐熱穩定劑。
[0006] 其中，呼吸型IBV-M41株和腎型IBV-T株毒種，購于中國獸醫藥品監察所。腺胃型 IBV-YBX株為本申請人自行采集。
[0007] 上述抗原用于雞傳染性支氣管炎病毒的血凝或血凝抑制試驗。
[0008] -種如上所述的雞傳染性支氣管炎病毒抗原的制備方法，具體步驟如下：
[0009] 1)將病毒毒種分別用無菌生理鹽水100倍稀釋，經尿囊腔內接種10日齡SPF雞 胚，每胚0. lml，置37°C雞胚孵化箱孵化，24小時照胚1次，棄去死胚；繼續孵化至48小時， 不論死亡與否，全部取出，置4°C冰箱冷卻；
[0010] 2)收集尿囊液，3000rpm離心30分鐘，取上清；
[0011] 3)將上清裝入40ml離心管中，經30000rpm，4°C離心3小時；
[0012] 4)棄去上清，每管各加入IM pH6. 5的Tris-HCL緩沖液，進行吹打，混勻，將病毒混 懸液收集于一管內；
[0013] 5)取病毒混懸液加入2U/ml卵磷脂酶C等量混合；
[0014] 6)將病毒混合物37°C水浴2小時，每隔15分鐘振蕩混勻；最后4°C過夜；
[0015] 7)將步驟6)的混合物進行稀釋，之后加入濃度為1%的硫柳汞，邊加邊混勻，硫柳 汞終濃度為〇. 01 %，混勻后4°c保存。
[0016] 由上的雞傳染性支氣管炎病毒抗原制成抗原制劑；劑型為凍干劑。制備凍干劑時 使用的穩定劑為明膠、蔗糖、聚乙二醇、甘露寡糖或殼聚糖等耐熱保護劑；使用的方法為真 空冷凍干燥技術，穩定劑的加入量為上述步驟7)制備的抗原液的1/10-1/3。
[0017] 本發明的有益效果：
[0018] 本發明的傳染性支氣管炎血凝抗原特異性強，只對傳染性支氣管炎陽性血清反 應呈陽性，對新城疫、禽流感和減蛋綜合征陽性血清反應均呈陰性。用本發明的呼吸型 IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或腎型IBV-T株毒種加穩定劑后2~8°C保存5年效價仍在 8Log2及以上，穩定性良好。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1
[0020] 一、抗原制備
[0021] 1、將呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株和腎型IBV-T株毒種分別用無菌生理 鹽水100倍稀釋，各尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚，每胚0. lml，置37°C雞胚孵化箱孵化， 24小時照胚1次，棄去死胚。直至48小時，不論死亡與否，全部取出，置4°C冰箱冷卻。按 此方法每種抗原制備3批。
[0022] 2、收集尿囊液，裝入500ml離心瓶中，3000rpm離心30分鐘，取上清。
[0023] 3、將上清裝入40ml離心管中，經30000g，4°C離心3小時。
[0024] 4、棄去上清，每管各加入IM pH6. 5的Tris-HCL緩沖液，進行吹打，混勻，將病毒混 懸液收集于一管內。
[0025] 5、取病毒混懸液加入2U/ml卵磷脂酶C等量混合。
[0026] 6、將病毒混合物37°C水浴2小時，每隔15分鐘振蕩混勻。最后4°C過夜，為IBV-HA 抗原。
[0027] 7、分別將IBV-HA抗原加入1 %硫柳汞，終濃度為0. 01 %，邊加邊混勻，混勻后4°C 保存。即得 M41-1 批、M41-2 批、M41-3 批；YBX-I 批、YBX-2 批、YBX-3 批；T-I 批、T-2 批、 T-3 批。
[0028] 將以上9種抗原分別與耐熱穩定劑混合凍干。
[0029] 二、成品檢驗
[0030] 2. 1性狀檢驗
[0031] 2. 2效價測定取96孔V型微量反應板對上述制備的抗原進行血凝效價檢測，每孔 加25 μ I PBS (0. 01mol/L，pH值7. 0~7. 4)，第一排加25 μ 1抗原，并做2~4個重復孔， 然后將抗原進彳了 2倍系列稀釋，稀釋后每孔再加入25 μ I PBS，最后再加入0. 5 %雞紅細胞 懸液25 μ 1，用微量振蕩器混勻，2~8°C靜置40分鐘判定結果，以使100%紅細胞凝集的抗 原最高稀釋倍數作為判定終點。結果制備的抗原的血凝價均在91og2以上，結果詳見表1。
[0032] 表1抗原血凝效價檢測結果
[0033]
【主權項】
1. 一種雞傳染性支氣管炎病毒抗原，包含病毒液和輔劑，其特征在于：所述病毒液為 呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或腎型IBV-T株毒種的病毒液；所述輔劑為明膠、蔗 糖、聚乙二醇、甘露寡糖或殼聚糖的任一種穩定劑。
2. -種由權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒抗原制成的抗原制劑。
3. 根據權利要求2所述的雞傳染性支氣管炎病毒抗原制成的抗原制劑，其特征在于： 所述制劑的劑型為凍干劑。
4. 根據權利要求1-3任一項所述的雞傳染性支氣管炎病毒抗原，其特征在于，用于雞 傳染性支氣管炎病毒的血凝或血凝抑制試驗。
5. -種根據權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒抗原的制備方法，其特征在于， 具體步驟如下： 1) 將病毒毒種分別用無菌生理鹽水100倍稀釋，經尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚，每 胚0. lml，置37°C雞胚孵化箱孵化，24小時照胚1次，棄去死胚；繼續孵化至48小時，不論 死亡與否，全部取出，置4°C冰箱冷卻； 2) 收集尿囊液，3000rpm離心30分鐘，取上清； 3) 將上清裝入40ml離心管中，經30000rpm，4°C離心3小時； 4) 棄去上清，每管各加入IM pH6. 5的Tris-HCL緩沖液，進行吹打，混勻，將病毒混懸液 收集于一管內； 5) 取病毒混懸液加入2U/ml卵磷脂酶C等量混合； 6) 將病毒混合物37°C水浴2小時，每隔15分鐘振蕩混勻；最后4°C過夜； 7) 將步驟6)的混合物進行稀釋，之后加入濃度為1%的硫柳汞，邊加邊混勻，硫柳汞終 濃度為〇. 01%，混勻后4°C保存。
【專利摘要】本發明屬于家禽疫苗技術領域，具體涉及一種用于雞傳染性支氣管炎病毒的血凝或血凝抑制試驗的雞傳染性支氣管炎病毒抗原及其制備方法。包含病毒液和輔劑，所述病毒液為呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或腎型IBV-T株毒種的病毒液。所述輔劑為明膠、蔗糖、聚乙二醇、甘露寡糖或殼聚糖的任一種穩定劑。本發明的傳染性支氣管炎血凝抗原特異性強，只對傳染性支氣管炎陽性血清反應呈陽性，對新城疫、禽流感和減蛋綜合征陽性血清反應均呈陰性。用本發明的呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或腎型IBV-T株毒種加穩定劑后2～8℃保存5年效價仍在8Log2及以上，穩定性良好。
【IPC分類】A61P31-14, A61K9-19, A61K39-215, C12R1-93, C12N7-00
【公開號】CN104667270
【申請號】CN201510109503
【發明人】宋新宇, 馬爽, 孫成友, 朱艷梅, 李金積, 楊代榮, 徐寶娟
【申請人】青島易邦生物工程有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月12日