一種羊膜上皮細胞在制備治療不孕不育癥藥物中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種羊膜上皮細胞在制備治療不孕不育癥藥 物中的用途。
【背景技術】
[0002] 不孕不育從功能上講，指的是人體不能生育。癌癥治療，諸如外科手術，化療療法 或者放射治療，會顯著減少原始卵泡的數量，影響荷爾蒙的平衡可能影響自然受孕或干擾 卵巢，輸卵管，子宮和子宮頸的機能造成不能成功受孕，造成需要生殖科技輔助或者使用妊 娠代孕的問題。然而不幸的是，化療或放射治療后的癌癥存活者，幾乎沒有保持生育能力的 方法，提高患者生活質量需要日益關注，尤其是關于恢復性腺功能和恢復生育能力。干細胞 是唯一既有自我更新又能分化特殊后代的細胞，有證據顯明，從骨髓中移植干細胞可以恢 復因對毒害生殖腺侵擾造成的卵巢功能受損，近來，在用來研宄原發性卵巢衰竭的促卵泡 素受體基因缺失小鼠模型中骨髓干細胞移植可以恢復卵泡成熟和類固醇激素的生產，盡管 目前對于干細胞存有爭議，但普遍贊同干細胞的效用療法效用，如骨髓干細胞可改善卵巢 功能。
[0003] 人體羊膜上皮細胞來自胎盤，是在解剖學和組織學上長期專用的胎兒上皮細胞， 具有早期外胚層細胞的多能性。已證明人體羊膜上皮細胞可在體外分化成3個胚層，人羊 膜上皮細胞在產后被丟棄后可在培養中能夠不斷擴展生成，因此成為再生醫學和細胞理療 的替代資源。在原腸胚形成進程中，在胚胎的外胚層形成的生殖細胞會使原始生殖細胞和 軀體系統分離，將原始生殖細胞移動到生殖嵴，因為人體羊膜上皮細胞是先于原腸胚形成 產生，所以人體羊膜上皮細胞有可能分化成生殖細胞。近來，有報道在媒介中生成的人體羊 膜上皮細胞能夠分化成類似卵泡的細胞有表現生殖細胞的特異標志物
【發明內容】
[0004] 因此，本發明要解決的技術問題就是針對目前臨床上缺乏治療由卵巢功能減退所 引發的不孕不育癥藥物的問題，提供了一種羊膜上皮細胞在制備治療不孕不育癥藥物中的 用途以及羊膜上皮細胞的制備方法。
[0005] 因此，本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之一為：一種羊膜上皮細胞在 制備治療不孕不育癥藥物中的用途。
[0006] 本發明所述羊膜上皮細胞為本領域常規的羊膜上皮細胞，其來源為本領域常規來 源，較佳地為來源于人類的羊膜上皮細胞。本發明所述羊膜，也可稱作胎膜，是母體與胎兒 間進行物質交換的重要組織。羊膜主要分為上皮層、基底層、致密層、纖維母細胞層和海綿 層五部分。人羊膜細胞主要由上皮層的羊膜上皮細胞和基底層的間質細胞構成，是發育中 的胎兒的聯系緊密的胚胎發育早期產物。羊膜上皮細胞可表達早期干細胞的一些不同標 記，如神經細胞特意的膠質纖維相關蛋白，神經元特異性標記，神經干細胞特異性標記，肝 薄壁組織細胞蛋白，甲胎蛋白等等。本發明所述羊膜上皮細胞的來源非常廣泛，不會產生倫 理或者道德問題。
[0007] 本發明所述不孕不育癥是本領域常規的不孕不育癥，從功能上是指人體不能生 育。其中所述不孕不育癥的致病原因為本領域常規致病原因，較佳地是指由于卵巢功能減 退引起的不孕不育癥，更佳地是由放射治療，化療或者外科手術所引起的不孕不育癥。
[0008] 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之二為：一種羊膜上皮細胞的培養 方法，所述培養方法包括以下步驟：從胎盤分離羊膜絨膜，將所得羊膜絨膜分割成切片，將 該切片溶于乙二胺四乙酸形成羊膜細胞懸液，將所得羊膜細胞懸液接種在細胞培養基中 35°C -37°C培養即得。
[0009] 本發明所述分離為本領域常規分離技術，是指從組織樣品中移出細胞且與另外的 非組織干細胞分開。使用任何常規技術或方法將完整的組織分離為單細胞。這些技術或方 法包括機械力，如切碎力或剪切力，或者用一種或多種蛋白酶例如膠原酶，胰蛋白酶，脂肪 酶或者胃蛋白酶進行酶消化，或者機械力與酶消化組合的技術或者方法。其中所述切片的 面積為本領域常規面積，所述切片的面積較佳地為0. 5-1. Om2。
[0010] 本發明所述細胞培養基沒有限制，只要可用于羊膜上皮細胞培養的培養基即可， 所述細胞培養基較佳地為1640培養基，更佳地，所述1640培養基中包含10 %葡萄糖，IOOU/ mL鏈霉素，lOOU/mL青霉素以及0.3mg/mL谷氨酸鹽，所述百分比為質量百分比。本發明所 述細胞培養條件沒有限制，只要可用于羊膜上皮細胞的培養即可，所述培養條件較佳地為 培養溫度37°C，培養時CO 2含量5%，所述百分比為體積百分比。其中所述細胞培養基中還 可以添加人全血清、臍帶血清或者人工腦脊液等。
[0011] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0012] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0013] 本發明的積極進步效果在于：本發明所述羊膜上皮細胞能夠有效治療或者改善由 于卵巢功能衰退所導致的不孕不育癥，顯著提高了功能衰退導致的不孕不育癥患者體內卵 泡的生成，而且羊膜上皮細胞的增殖是可控的，利用羊膜上皮細胞進行移植治療是安全的， 此外羊膜上皮細胞的來源非常廣泛，不會產生倫理或者道德問題，因此本發明為今后臨床 治療或者改善不孕不育癥提供了新的有效選擇。
【附圖說明】
[0014] 圖1為人體羊膜上皮細胞移植14天的小鼠的卵巢產生的基本卵泡組織學檢測結 果。
[0015] 圖2為人體羊膜上皮細胞移植20天的小鼠的卵巢產生的基本卵泡組織學檢測結 果。
[0016] 圖3為人體羊膜上皮細胞移植兩個月的小鼠的卵巢產生的基本卵泡組織學檢測 結果。
[0017] 圖4為利用人體抗原使用免疫化學方法檢測移植細胞人體卵泡刺激素受體表達 的結果。
[0018] 圖5為利用人體抗原使用免疫化學方法檢測在卵子周圍的顆粒細胞中人體卵泡 刺激素受體表達的結果。
[0019] 圖6為人體羊膜上皮細胞移植28天后使用綠色熒光蛋白和抗人核抗體染色的卵 巢切片顯示移植的人體羊膜上皮細胞的檢測結果。
[0020] 圖7為綠色熒光人體羊膜上皮細胞移植受體小鼠兩個月后，在受體卵巢的竇狀卵 泡中，綠色熒光蛋白染色與人體核抗體共同定位檢測結果。
【具體實施方式】
[0021] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0022] 實施例1人體羊膜上皮細胞的準備和培養
[0023] 本發明人胎盤均在足月妊娠獲得，獲得未攜帶艾滋病和肝炎病毒B和C的婦女同 意后，可在剖腹產過程中取走胎盤，剖腹產中一般是臀位先露，如遇胎兒窘迫以及雙胞胎癥 狀，需再次操作。本發明中使用的人體羊膜已獲倫理委員會同意。從胎盤手動剝離羊膜絨膜 放置于250毫升含有1640細胞培養基的燒瓶內，再用剃刀將它分割成0. 5平方米和I. 0平 方米的切片，在37°C將這些切片在45分鐘內溶于乙二胺四乙酸。由此產生的細胞懸液接種 在加入1640細胞培養基的6孔板中，并已補充添加10%葡萄糖（PAA Laboratories GmbH， Colbe，Germany)，鏈霉素（100U/mL，Gibco, Grand Island，NY，USA)，和青霉素（100U/M1 ; Gibco，Grand Island，NY)以及谷氨酸鹽（0.3mg/Ml ;Gibco)，在37°C下二氧化碳含量在5% 的濕潤空氣中培養。當人體羊膜上皮細胞覆蓋量達到80%到90%，其細胞就可以用來做實 驗。
[0024] 實施例2人體羊膜上皮細胞的轉染和移植以及實驗結果
[0025] 實驗動物的準備：選C57BL/6野生雌性小鼠作為接受者，6周齡（18. 15±0. 16g按 照重量），腹內注射白消安（Sigma-Aldrich，30mg/kg ;二甲基亞研；中重懸（DMSO))和環磷酰 胺（Sigma-Aldirich，120mg/kg ;DMS0)，對照組的小鼠模型只注射二甲基亞研^，本申請所有 實驗操作均獲得上海藥物研宄所實驗動物管理與使用委員會的批準，執行國家研宄理事會 對實驗動物護理和使用指南。
[0026] 將實施例1所得人羊膜上皮細胞培養到密度達到80% -90 %時，加入慢性病毒增 強綠色熒光蛋白（該質粒的構建方法請參考文獻：Liu T，Wu J，Huang Q，Hou Y，Jiang Z， Zang S?Guo L：Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock 2008, 29 :603-611.)，在細胞里培養，經過24小時的孵化，根據公式：1 X IO5癌細胞X % EGFP陽性細胞X 1，000/ μ 1毫升病毒，在癌細胞上不斷稀釋矢量，再使用集中浮層滴定。慢 性病毒矢量是IX IO8-IX IO9TUAil。再經過2天的分化，通過