一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及骨組織再生和骨整合修復(fù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種應(yīng)用于骨修復(fù)重建的負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自固化磷酸鈣骨水泥及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]口腔頒面部是人體重要的解剖部位，頒骨組織是構(gòu)成人體面部容貌的支架，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血運(yùn)豐富，關(guān)系著面部美觀及口腔咀嚼功能的實(shí)現(xiàn)。然而，由于先天性畸形、外傷、感染、腫瘤等原因造成的骨缺損是臨床上的常見疾病。目前，骨組織再生與重建的方法主要包括自體骨移植、異體或異種骨移植和組織工程等方法。同時(shí)，在頒骨缺損修復(fù)基礎(chǔ)上往往需要進(jìn)行牙種植等口腔功能的重建，因此，對口腔頒面部再生骨組織的速度和質(zhì)量都有一定的要求。經(jīng)典的組織工程方法采用種子細(xì)胞、支架材料和生長因子組合修復(fù)缺損部位，具有準(zhǔn)確重建原有組織形態(tài)及體積的優(yōu)點(diǎn)，已取得了一定的效果。然而，目前對于體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞應(yīng)用于臨床患者仍存在較大的爭議。分析其原因，現(xiàn)有種子細(xì)胞在體外培養(yǎng)中可能存在變異、污染、短時(shí)間內(nèi)難以獲得大量細(xì)胞等問題。因此，組織工程骨構(gòu)建時(shí)，如何獲得大量的干細(xì)胞，創(chuàng)造有利于新骨快速形成和成熟的干細(xì)胞微環(huán)境，尤其是充分調(diào)動自體干細(xì)胞的參與，對于實(shí)現(xiàn)大塊頒骨組織的再生尤為重要。
[0003]自固化磷酸鈣骨水泥(CPC)具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性、生物安全性，能任意塑形，在固化過程中具有等溫性，目前該材料已成功通過IV期臨床試驗(yàn)，廣泛應(yīng)用于骨組織缺損修復(fù)的臨床治療中。
[0004]天然骨組織是由細(xì)胞、纖維和基質(zhì)成分組成，其中細(xì)胞在周圍基質(zhì)環(huán)境信號刺激下展開增殖、分化、合成基質(zhì)和沉積礦物質(zhì)等系列活動。因此，在有利于營養(yǎng)傳輸和血管化的宏觀多級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從細(xì)胞角度設(shè)計(jì)，有望加強(qiáng)從細(xì)胞層面上對成骨活動的精確調(diào)控，從而獲得更佳的骨缺損修復(fù)效果。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥的制備方法。
[0006]本發(fā)明第二個(gè)目的在于提供一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥。
[0007]本發(fā)明第三個(gè)目的在于提供負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥在制備頒骨修復(fù)材料中的應(yīng)用。
[0008]為實(shí)現(xiàn)以上第一個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥的制備方法，其特征在于，利用細(xì)胞粘附的原理，采用血液循環(huán)流通的方法，直接富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于自固化磷酸鈣骨水泥上。
[0009]作為一個(gè)優(yōu)選方案，制備方法包括如下步驟:將自固化磷酸鈣骨水泥放入干細(xì)胞富集器的過濾芯內(nèi)，干細(xì)胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，啟動蠕動泵，循環(huán)過濾，過濾芯內(nèi)即為負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自固化磷酸鈣骨水泥。
[0010]作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述循環(huán)過濾的時(shí)間是10 — 20分鐘。
[0011]為實(shí)現(xiàn)以上第二個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥，其特征在于，通過以下方法制備獲得:將自固化磷酸鈣骨水泥放入干細(xì)胞富集器的過濾芯內(nèi)，干細(xì)胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，啟動蠕動泵，循環(huán)過濾，過濾芯內(nèi)即為負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自固化磷酸鈣骨水泥。
[0012]為實(shí)現(xiàn)以上第三個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥在制備頒骨修復(fù)材料中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:(I)本發(fā)明通過細(xì)胞粘附這一簡單有效的方法提高磷酸鈣骨水泥中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量；(2)直接富集自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于三維支架材料上，干細(xì)胞不通過體外擴(kuò)增，避免了細(xì)胞擴(kuò)增中可能產(chǎn)生的變異、污染等問題；(3)本發(fā)明提供的負(fù)載自體富集骨髓干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥，可以顯著促進(jìn)頒骨缺損的骨修復(fù)，磷酸鈣骨水泥已被國家衛(wèi)生部門批準(zhǔn)可以應(yīng)用于臨床骨再生治療，對于該治療方法的施行提供了可能。
【附圖說明】
[0014]圖1為打開過濾器組件，取下過濾芯，并打開過濾器蓋。
[0015]圖2為連接血袋，準(zhǔn)備引流骨髓血。
[0016]圖3為控制骨髓血的流入和氣體的排除。
[0017]圖4為引流完成，關(guān)閉二通旋塞開關(guān)。
[0018]圖5為將硅膠管嵌入蠕動泵中，啟動循環(huán)過濾。
[0019]圖6為異位成骨效果(左圖為負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC，右圖為負(fù)載未經(jīng)富集的骨髓干細(xì)胞的CPC )。
[0020]圖7為犬下頒骨缺損修復(fù)(A為頒骨缺損，B為負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC填充骨缺損區(qū))。
[0021]圖8為Micro CT(左圖為負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC，右圖為未負(fù)載細(xì)胞的CPC)。
[0022]圖9為犬下頒骨缺損骨修復(fù)情況(苦味酸品紅染色，深紅色區(qū)域?yàn)樾律?，A為負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC，B為未負(fù)載細(xì)胞的CPC)。
[0023]圖10為負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞磷酸鈣骨水泥填充頒骨缺損區(qū)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0025]實(shí)施例1.負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥的制備方法利用細(xì)胞粘附的原理，采用血液循環(huán)流通的方法，直接富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于自固化磷酸鈣骨水泥上。
[0026]實(shí)驗(yàn)中采用干細(xì)胞富集器進(jìn)行操作，包括如下步驟:將自固化磷酸鈣骨水泥放入干細(xì)胞富集器的過濾芯內(nèi)，干細(xì)胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，啟動蠕動泵，循環(huán)過濾，過濾芯內(nèi)即為負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自固化磷酸鈣骨水泥。
[0027]實(shí)驗(yàn)中優(yōu)選的一種方案包括如下具體步驟:
1、選定干細(xì)胞豐富的部位(如髂骨)，利用骨穿針對準(zhǔn)預(yù)定穿刺部位進(jìn)行穿刺，完成后拔出針芯；
2、連接真空抽吸注射器和骨穿針手柄，利用真空抽吸注射器抽取50-100mL骨髓血，并注射到含抗凝劑的血袋中備用；
3、取干細(xì)胞過濾富集器，取下過濾器組件按圖1依次打開過濾器組件，將CPC材料放入干細(xì)胞過濾富集器的過濾芯內(nèi)中，并重新將過濾器組件連接復(fù)位；
4、將整套產(chǎn)品固定，并放置于相應(yīng)的支撐架，并用引流管連接裝有骨髓血的血袋，如圖2位置所示；
5、引流開始時(shí)，三通旋塞的開關(guān)轉(zhuǎn)動至圖3所示位置，控制骨髓血的流入和氣體的排出；
6、待所需的骨髓血全部進(jìn)入器械后，按圖4所示位置關(guān)閉三通旋塞的開關(guān)；
7、完成骨髓血的引流后，將干細(xì)胞過濾富集器的硅膠管段(即圖5所示部分)嵌入蠕動泵泵頭中，并固定好其余部件的位置，啟動蠕動泵，按規(guī)定時(shí)間、頻率開始進(jìn)行循環(huán)過濾；
8、蠕動結(jié)束后，取下干細(xì)胞過濾富集器，打開過濾器組件，取出負(fù)載富集自體骨髓干細(xì)胞的CPC。
[0028]本發(fā)明采用華東理工大學(xué)自主研發(fā)的磷酸鈣骨水泥，可向上海瑞邦生物有限公司購買，其已獲得國家藥品監(jiān)督管理局準(zhǔn)生產(chǎn)批文。本發(fā)明不需專門、復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，操作流程簡單，有利于推廣使用。
[0029]實(shí)施例2.負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥在頒骨修復(fù)中的應(yīng)用
分別將負(fù)載未經(jīng)富集的骨髓干細(xì)胞的CPC和負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC埋入裸鼠皮下，8周后取材，觀察CPC的異位成骨效果。結(jié)果顯示負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC較分別將負(fù)載未經(jīng)富集的骨髓干細(xì)胞的CPC好。
[0030]圖6為異位成骨效果(左圖為負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC，右圖為負(fù)載未經(jīng)富集的骨髓干細(xì)胞的CPC )。
[0031]犬下頒骨缺損修復(fù)試驗(yàn):在犬的下頒骨制造20mmX8mm的頰舌側(cè)缺損，分別將未負(fù)載細(xì)胞的CPC和負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC填充入骨缺損區(qū)(見圖7)，4個(gè)月后取材，觀察下頒骨缺損修復(fù)的效果。結(jié)果顯示:1) Micro顯示負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC較未負(fù)載細(xì)胞的CPC與周圍骨組織的融合性較好(見圖8) ;2)苦味酸品紅染色顯示顯示負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC較未負(fù)載細(xì)胞的CPC有更多的新骨形成(見圖9)。這提示著顯示負(fù)載富集骨髓干細(xì)胞的CPC較未負(fù)載細(xì)胞的CPC的成骨能力較強(qiáng)。
[0032]臨床病例:將負(fù)載富集自體骨髓干細(xì)胞的CPC填充頒骨缺損區(qū)(圖10)，并縫合粘膜創(chuàng)口。
[0033]患者術(shù)后I周行頒骨全景片及CBCT檢查，術(shù)后3個(gè)月行頒骨全景片檢查，術(shù)后6個(gè)月行頒骨全景片和CBCT檢測。
[0034]本發(fā)明不僅適用于根尖囊腫的缺損修復(fù)，對頒骨角化囊腫、囊性成釉細(xì)胞瘤等囊腫也同樣適用。
[0035]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，例如改變抽取骨髓的部位，抽取骨髓的體積量，富集的時(shí)間，以及自固化磷酸鈣骨水泥的規(guī)格等，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥的制備方法，其特征在于，利用細(xì)胞粘附的原理，采用血液循環(huán)流通的方法，直接富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于自固化磷酸鈣骨水泥上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥的制備方法，其特征在于，制備方法包括如下步驟:將自固化磷酸鈣骨水泥放入干細(xì)胞富集器的過濾芯內(nèi)，干細(xì)胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，啟動蠕動泵，循環(huán)過濾，過濾芯內(nèi)即為負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自固化磷酸鈣骨水泥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥的制備方法，其特征在于，所述循環(huán)過濾的時(shí)間是10 — 20分鐘。
4.一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥，其特征在于，通過以下方法制備獲得:將自固化磷酸鈣骨水泥放入干細(xì)胞富集器的過濾芯內(nèi)，干細(xì)胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，啟動蠕動泵，循環(huán)過濾，過濾芯內(nèi)即為負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自固化磷酸鈣骨水泥。
5.權(quán)利要求4所述的負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥在制備頒骨修復(fù)材料中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種負(fù)載富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥及制備方法，利用細(xì)胞粘附的原理，采用血液循環(huán)流通的方法，直接富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于自固化磷酸鈣骨水泥上。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）本發(fā)明通過細(xì)胞粘附這一簡單有效的方法提高磷酸鈣骨水泥中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量；（2）直接富集自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于三維支架材料上，干細(xì)胞不通過體外擴(kuò)增，避免了細(xì)胞擴(kuò)增中可能產(chǎn)生的變異、污染等問題；（3）本發(fā)明提供的負(fù)載自體富集骨髓干細(xì)胞的自固化磷酸鈣骨水泥，可以顯著促進(jìn)頜骨缺損的骨修復(fù)，磷酸鈣骨水泥已被國家衛(wèi)生部門批準(zhǔn)可以應(yīng)用于臨床骨再生治療，對于該治療方法的施行提供了可能。
【IPC分類】A61L27-38, A61L27-12
【公開號】CN104587523
【申請?zhí)枴緾N201410254518
【發(fā)明人】蔣欣泉, 張志愿, 吳玉瓊, 張秀麗
【申請人】上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年6月10日