一種新型干細胞制劑及其治療腦出血的用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種新型干細胞制劑、以及其用于治療腦出血的用途，特別地，本發明涉及來自羊膜的干細胞制劑用于治療腦出血。
【背景技術】
[0002]腦出血(cerebral hemorrhage)又稱腦溢血，是指非外傷性腦實質內的自發性出血，病因多樣，絕大多數是高血壓小動脈硬化的血管破裂引起。腦出血是中老年人常見的急性腦血管病，病死率和致殘率都很高，是我國腦血管病中死亡率最高的臨床類型。高血壓腦出血的治療可分為內科保守治療和外科手術治療。患者出血量不多，神經功能損害較輕，或者患者一般情況較差不能手術治療的患者可選擇內科保守治療。用藥物減輕血腫造成的繼發性損害，促進神經功能恢復；防止并發癥。出血量大，病情較重需外科手術，清除血腫，減輕腦組織受壓，盡最大努力保證神經功能。但神經功能都會不同程度地受損。所以加速神經功能的恢復是亟待解決的問題。
[0003]近年來，掀起干細胞治療的熱潮。干細胞具有多項分化潛能和自我更新能力。目前，干細胞的種類較多，如胚胎干細胞、骨髓干細胞、臍帶干細胞、羊膜干細胞、脂肪干細胞等。
[0004]胚胎干細胞目前尚存在倫理問題，骨髓及脂肪干細胞成體干細胞，相對成熟。羊膜在胎盤的最內層，含羊水包裹著胎兒。胚胎發育I個月時，羊膜囊已發育完畢，羊膜較臍帶發育的更早。羊膜為孕婦生產時的廢棄物，不存在倫理問題而且來源豐富，可作為干細胞的極佳來源。
[0005]21世紀，是干細胞治療的時代，干細胞可分泌多種細胞營養因子，包括EGF，bFGF，IGF, HGF, TNF- β等，這些因子能改善機體細胞生長的微環境，促進機體細胞的增殖和分化，促進自身組織損傷的修復，使之恢復功能。另外干細胞有多項分化潛能，可分化替代損傷的組織細胞并發揮功能。因此對于腦出血的術后治療選擇一種適合的干細胞及科學可行的治療方案，是目前亟待解決的問題。
[0006]本發明的優點在于:
[0007]I采用羊膜來源的間充質干細胞，來源豐富，不存在倫理問題。細胞增殖能力強。
[0008]2干細胞移植方式根據疾病不同而采取不同的方式，本發明是采用腦室內損傷局部直接注射。而且在腦出血患者做引流術手術后留置引流管，待選擇合適時機通過引流管將干細胞注入，可避免因腦內干細胞移植再次開顱創傷。
【發明內容】
[0009]本發明提供了一種干細胞制劑，其中所述干細胞制劑包含治療有效量的間充質干細胞、DMEM/F12細胞培養基和bFGF，其中所述的間充質干細胞來自哺乳動物的羊膜干細胞。
[0010]優選地，根據本發明的干細胞制劑，其中治療有效劑量是每kg病人體重大約I X 16個間充質干細胞。
[0011]優選地，根據本發明的干細胞制劑，其中間質干細胞的濃度為5X 106-1.25X 107/ml，且 4ml DMEM/F12 細胞培養液中含 10ng/ml bFGF。
[0012]進一步地，根據本發明的干細胞制劑，其中所述哺乳動物是人。
[0013]進一步地，根據本發明的干細胞制劑，其被配制成干細胞混懸液。
[0014]另一方面，本發明提供了一種制備干細胞制劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0015]I)培養來自哺乳動物羊膜的間充質干細胞；
[0016]2)傳代擴增步驟I)中培養的間充質干細胞；
[0017]3)用胰蛋白酶消化傳代擴增的間充質干細胞，用不含血清的培養基終止消化作用；
[0018]4)將步驟3)的間充質干細胞以5X 16-L 25X 107/ml的濃度混懸于含有bFGF的DMEM/F12細胞培養基中。
[0019]另一方面，本發明提供了根據本發明的干細胞制劑、或根據本發明的方法制備的干細胞制劑在用于制備治療哺乳動物腦出血的患者的藥物中的用途。
[0020]優選地，根據本發明所述的用途，其中所述干細胞制劑通過腦室施用。
【附圖說明】
[0021]圖1顯示患者鉆孔開顱，引流后，留置引流管。
[0022]圖2顯示將干細胞懸液注入到腦室內。
[0023]圖3顯示縫合皮膚，將引流管埋于皮下，備第二次移植。
[0024]圖4A-圖4H表明流式細胞術檢測羊膜干細胞的細胞表面標志物，其中CD105、⑶73、和⑶90陽性的羊膜間充質干細胞數多95%，表面標記物⑶45、⑶34、⑶14、⑶19、HLA-DR陽性的羊膜間充質干細胞數< 2%。
[0025]應當了解，所附附圖并非按比例地顯示了本發明的基本原理的圖示性的各種特征的略微簡化的畫法。本文所公開的本發明的具體設計特征包括例如具體尺寸、方向、位置和外形將部分地由具體所要應用和使用的環境來確定。
[0026]在這些圖形中，貫穿附圖的多幅圖形，附圖標記引用本發明的同樣的或等同的部分。
【具體實施方式】
[0027]本發明的目的在于提供一種針對腦出血術后促進神經功能恢復的干細胞制劑，和臨床治療途徑。
[0028]第一方面內容:
[0029]治療腦出血干細胞制劑的制備
[0030]I提取細胞:
[0031]A原料:健康孕婦剖宮產胎兒羊膜，供者肝炎病毒標志物、梅毒、HIV檢測均陰性。供者對實驗知情同意，經醫院倫理委員會批準。
[0032]B無菌條件下從胎盤剝離羊膜，用PBS洗滌數次，去除羊膜上的血絲及粘稠物。
[0033]C在生物安全柜內，在培養皿中將羊膜剪成小塊，加入胰蛋白酶消化，血清中和。
[0034]D清除羊膜片上消化下來的上皮細胞后將羊膜片剪碎，用PBS洗滌，離心后的沉淀接種于培養皿中培養并傳代擴增。
[0035]2制備腦出血干細胞制劑
[0036]A細胞增殖到一定數量后，將細胞進行胰酶消化，用大量的不含血清的培養基來終止消化作用。
[0037]B干細胞制劑的制備
[0038]細胞營養液的配制:成分:DMEM/F12細胞培養液，bFGF。
[0039]用配好的細胞營養液4ml懸浮準備好的干細胞，混勻后裝入注射瓶中，無菌密封。
[0040]第二方面
[0041]干細胞治療方案
[0042]I腦出血患者術前，對患者交代干細胞治療的作用和意義
[0043]2患者簽署干細胞臨床試驗治療知情同意書
[0044]3行血腫引流術。
[0045]4手術結束時，在腦室或血腫腔放置的引流管埋在皮下，無菌包扎。
[0046]5術后I周，生命體征平穩，行干細胞治療。打開包扎的引流管，用注射器從瓶中抽出干細胞懸液后拔掉針頭，將注射器接到引流管上，緩慢注入干細胞混懸液。再注射2ml鹽水沖洗引流管中殘留細胞。
[0047]6拔下注射器，將引流管埋在皮下，無菌包扎，以備第二次干細胞移植。
[0048]7共通過此引流管移植3次，后拔出引流管，縫合頭皮，包紗布。
[0049]第三方面
[0050]干細胞治療后，與不移植相比，肢體功能明顯改善。
[0051]實施例
[0052]I提取細胞:
[0053]A原料:健康孕婦剖宮產胎兒羊膜，供者肝炎病毒標志物、梅毒、HIV檢測均陰性。供者對實驗知情同意，經醫院倫理委員會批準。:
[0054]B無菌條件下從胎盤剝離羊膜，用PBS洗滌數次，去除羊膜上的血絲及粘稠物。
[0055]C在生物安全柜內，在培養皿中將羊膜剪成小塊，加入濃度為0.125%的胰蛋白酶消化30min后，血清中和。
[0056]D清除羊膜片上消化下來的上皮細胞后將羊膜片剪碎，用PBS洗滌，離心后的沉淀接種于培養皿中培養并傳代擴增。
[0057]使用流式細胞術檢測了來自羊膜的間充質干細胞的細胞表面標志物，其中CD105、⑶73、和⑶90陽性的羊膜間充質干細胞數多95%，表面標記物⑶45、⑶34、⑶14、⑶19、HLA-DR陽性的羊膜間充質干細胞數< 2%。
[0058]2制備干細胞制劑
[0059]A細胞營養液的配制:DMEM/F12細胞培養液4ml含10ng/mlbFGF。
[0060]B細胞增殖到總數約達5X 17個時，將細胞用濃度為0.25%的胰酶消化，用相當于5倍胰酶量的不含血清的培養基來終止消化作用。1000RPM，離心。用配好的細胞營養液懸浮離心沉淀的干細胞，混勻后裝入注射瓶中，無菌密封，其中，間充質干細胞的濃度時I X 17個 /ml ο
[0061]3腦出血患者的移植治療
[0062]做血腫引流術的腦出血患者
[0063]A術前，對患者交代干細胞治療的作用和意義
[0064]B患者簽署干細胞治療知情同意書
[0065]C手術結束時，在腦室或血腫腔放置引流管，無菌包扎。
[0066]D術后I周，生命體征平穩，行干細胞治療，細胞濃度為I X 17個/ml，共4ml。打開包扎的引流管，放出6ml的腦脊液，用注射器從瓶中抽出4ml干細胞懸液后拔掉針頭，將注射器接到引流管上，緩慢注入干細胞混懸液。再注射2ml生理鹽水，沖洗引流管中殘留細胞。
[0067]E拔下注射器，將引流管埋在皮下，無菌包扎，以備第二次干細胞移植。
[0068]第二次和第三次移植步驟同第一次。間隔7天。I個療程3次。
[0069]第一次治療后5天，肌張力也有所下降，肌力增加。治療一個療程后，陸續顯現療效，包括患者語言障礙減輕，肢體偏癱導致的運動障礙均有改善。
【主權項】
1.一種干細胞制劑，其中所述干細胞制劑包含治療有效量的間充質干細胞、DMEM/F12細胞培養基和bFGF，其中所述的間充質干細胞來自哺乳動物的羊膜。
2.根據權利要求1所述的干細胞制劑，其中治療有效劑量是每kg病人體重大約IX 16個間充質干細胞。
3.根據權利要求1所述的干細胞制劑，其中間質干細胞的濃度為5X10 6-1.25X 17/ml，且 5ml DMEM/F12 細胞培養液中含 10ng/ml bFGF。
4.根據權利要求1所述的干細胞制劑，其中所述哺乳動物是人。
5.根據權利要求1所述的干細胞制劑，其被配制成干細胞混懸液。
6.一種制備干細胞制劑的方法，所述方法包括以下步驟: 1)培養來自哺乳動物羊膜的間充質干細胞； 2)傳代擴增步驟I)中培養的間充質干細胞； 3)用胰蛋白酶消化傳代擴增的間充質干細胞，用不含血清的培養基終止消化作用； 4)將步驟3)的間充質干細胞以5X16-L 25XlOVml的濃度混懸于含有bFGF的DMEM/F12細胞培養基中。
7.根據權利要求1-5任一項所述的干細胞制劑、或根據權利要求6所述的方法制備的干細胞制劑在用于制備治療哺乳動物腦出血的患者的藥物中的用途。
8.根據權利要求7所述的用途，其中所述干細胞制劑通過腦室施用。
【專利摘要】本發明涉及一種新型干細胞制劑及其治療腦出血的用途，特別地，發明涉及包含治療有效量的間充質干細胞、DMEM/F12細胞培養基、和bFGF用于治療腦出血的用途。
【IPC分類】A61K35-50, A61P7-04, A61P25-00
【公開號】CN104546916
【申請號】CN201510063669
【發明人】畢薇薇, 李志剛
【申請人】吉林省拓華生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年2月6日