一種1,2,4-三嗪并嘧啶二酮類化合物作為hCBS酶抑制劑的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種hCBS酶抑制劑的應用。
【背景技術】
[0002] 人體內源性的H2S氣體分子參與并調控很多生理和病理過程，為重要的信號轉導 通路的調控分子。在結腸癌、神經退行性疾病、缺血性中風、低血壓、高血壓和胰腺炎等很多 病理條件下，內源性H 2S含量都發現有異常變化。因此，目前需要內源性H2S信號的特異抑 制劑或激活劑作為分子探針工具去進一步闡述H 2S的生理功能，和治療與H2S-相關的疾病 的小分子藥物先導物。
[0003] CBS (cystathionine β-synthase,胱硫醚-β -合成酶）是一種 PLP-依賴型（ρ yridoxal-5' -phosphate-dependent)酶，即維生素 B6依賴型酶。在人體內，CBS催化底物 L-半胱氨酸（Cysteine)和L-同型半胱氨酸（L-Homocysteine)產生內源性H2S氣體。在 循環休克、中風、唐氏綜合癥和癌癥病人或模型動物的體內已發現過量的H 2S和/或CBS活 性的增強，因此，hCBS (human CBS)已經被認為是治療循環休克、中風、唐氏綜合癥以及腫 瘤等與H2S相關的疾病的潛在靶標。
[0004] 已知的hCBS小分子抑制劑，不僅與酶的結合力弱而且選擇性也很低，因為他們對 其它維生素 B6-依賴型酶也有抑制作用。因此，急需篩選出特異性的hCBS抑制劑，可作為 "工具藥"去證實已發現的H 2S的生物學效應和信號通路作用，同時也可作為藥物研發的先 導化合物。
[0005] 目前，酶抑制劑的發現主要通過兩種方法，即生物篩選和合理藥物設計。基于靶點 的合理藥物設計就是通過對藥物作用的靶點進行研究，找到新的、合適的藥物來治療某些 疾病。發現一個的靶點往往就能設計出一類新藥，在新藥研究領域也是極受重視的。
[0006] 深入認識酶結構，特別是當它與特異性抑制劑復合時的結構，將會產生一種鑒定 該酶中結合位點的方法，并獲得酶/抑制劑復合物以及該酶中敏感殘基的構象，這些知識 對藥物設計和優化方法來講都是至關重要的。
[0007] hCBS純酶3D晶體結構已被報道，這為其靶向抑制劑的設計提供了一定的結構基 礎，但是與底物-結合相關的氨基酸殘基還不清楚。
[0008] 因此，本領域的技術人員致力于研究hCBS酶促反應的抑制劑以及這種抑制劑作 為研究治療循環休克、中風、唐氏綜合癥和腫瘤等與H 2S相關的疾病的藥物的先導化合物的 應用。
【發明內容】
[0009] 本發明中所用縮寫如下：
[0010] hCBS 指人源胱硫醚-β -合成酶，即 human cystathionine β -synthase ;
[0011] 0丁咄指5,5'-二硫代二（2-硝基苯甲酸)，即5,5'-0行111〇1^8-(2-11行1'(*61^〇1。 acid)；
[0012] Tris-HCl 指三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽，即 Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride；
[0013] EDTA 指乙二胺四乙酸，即 Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ;
[0014] L-Cys 指 L-半胱氨酸，即 L-Cysteine ;
[0015] D, L-HCys 指 D, L-同型半胱:氛酸，即 D, L-Homocysteine ;
[0016] SAM 指 S-腺苷甲硫氨酸，即 S-adenosyl methionine ;
[0017] PLP 指憐酸批咳醒，即 pyridoxal-5' -phosphate ;
[0018] HepG2 細胞指人肝癌細胞系，即 a human liver carcinoma cell line ;
[0019] 1，6-二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-嘧啶二酮，即 I, 6-dimethylpyrimido [5, 4-e] [I, 2, 4] triazine-5, 7 (1H, 6H)-dione ；
[0020] 1,6-二甲基-3-苯基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(1!1，6!1)-嘧啶二酮，即1，6-(1 imethyl-3-phenylpyrimido[5, 4-e][I, 2, 4]triazine-5, 7(1H, 6H)-di one ；
[0021] 6-甲基[1,2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-嘧啶二酮，即 6_methylpyrimido[5, 4_e] [1，2, 4]triazine_5, 7(1H，6H)_dione〇
[0022] 蝶啶-2,4(3H，8H)-二酮，即 pteridine-2, 4(3H, 8H)-dione。
[0023] HepG2 細胞指人肝癌細胞系，即 a human liver carcinoma cell line ;
[0024] 本發明中用 Compd.2 指代 1，6-二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-. 啶二酮；
[0025] 用 Compd.5 指代 1，6-二甲基-3-苯基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-. 啶二酮；
[0026] 用 Compd 6 指代 6 -甲基[1，2, 4 [三嗪并[5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)_ 嘧啶二酮；
[0027] 用 Compd. 7 指代蝶啶-2, 4 (3H，8H)-二酮。
[0028] 本發明中所提到的酶促反應容器能夠容納H2S氣體檢測容器，即氣體檢測容器能 夠置入酶促反應容器中，以使酶促反應產生的H 2S氣體能夠全部擴散進入檢測體系。
[0029] 本發明公開了一種1，2, 4-三嗪并嘧啶二酮類化合物作為hCBS酶抑制劑的應用， 該化合物是1，6 -二甲基[1，2, 4]三嗪并[5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮，結構式如（I)所 不，分子量191. 19。
[0030]
【主權項】
1. 一種1，2, 4-三嗪并嘧啶二酮類化合物作為hCBS酶抑制劑的應用，該化合物是 1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(111，611)-嘧啶二酮，結構如式（1)所示，分子量 193. 16 ：
2. -種抑制離體hCBS酶促反應的方法，其步驟如下： 步驟一、配制緩沖溶液：在酶促反應容器中配置Tris-HCl濃度為50mM，PLP濃度為 100iiM，hCBS-413濃度為50-500nM，L-Cys濃度為4mM，D,L-HCys濃度為4mM的去離子水溶 液，pH為 7. 6-9. 0 ; 步驟二、配制酶促反應混合液：將化合物1，6 -二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)_嘧啶二酮分別加入到步驟一所配制的緩沖溶液中，配制成不同濃度 的酶促反應混合液，形成酶促反應體系； 步驟三、配制H2S氣體檢測體系： 在H2S氣體檢測容器中，加入50yL的DTNB溶液，所述DTNB溶液為：DTNB濃度為 300iiM，Tris-HCl濃度為262mM，EDTA濃度為13mM，pH=8. 9的去離子水溶液，形成H2S氣體 檢測體系，將氣體檢測容器置入酶促反應容器中，以使酶促反應產生的H2S氣體能夠擴散進 入氣體檢測體系； 步驟四、孵育過程： 用封板膜密封酶促反應容器，在37°C下孵育60分鐘； 步驟五、化合物1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(111，611)-嘧啶二酮作為hCBS抑制劑應用效果的檢測： 在酶標儀上測定H2S氣體檢測體系在413nm下的光吸收。
3. 如權利要求2所述的方法，其中，步驟一中所述pH=8. 6。
4. 如權利要求2所述的方法，其中，步驟一中所述hCBS-413濃度為100nM。
5. 如權利要求2所述的方法，其中，步驟二中所述化合物1,6-二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮的濃度為 0-400iiM。
6. 如權利要求2所述的方法，其中，步驟二中所述化合物1,6-二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮的濃度為 12iiM。
7. -種抑制細胞內hCBS酶抑制劑的方法，其步驟如下： 步驟一、將人源H印G2培養在由氨基酸營養液中孵育一天后，將化合物1，6-二甲基 [1，2, 4]三嗪并[5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮加入到所述氨基酸營養液中，進行共孵育； 然后，用冷的Tris-HCl緩沖液將細胞洗滌兩次，并用細胞刮刷收集；收集的細胞在裂解緩 沖液中，先用液氮冷凍，然后在37°C下解凍2分鐘，此冷凍、解凍操作重復3次；之后，裂解 液在轉離心機上離心1小時后，收集上層清液。作為H印G2細胞溶液進行下一步實驗；所述 Tris-HCl緩沖液的濃度為50mM，pH=8. 6 ; 步驟二、在酶促反應容器中加入步驟一中得到的H印G2細胞溶液，然后加入PLP濃度為 100iiM、SAM濃度為200iiM的去離子水溶液20iiL和L-Cys濃度為4mM、D,L-HCys濃度為 4mM的去離子水溶液； 步驟三、配制H2S氣體檢測體系： 在H2S氣體檢測容器中，加入50yL的DTNB溶液，所述DTNB溶液為：DTNB濃度為 300iiM，Tris-HCl濃度為262mM，EDTA濃度為13mM，pH=8. 9的去離子水溶液，形成H2S氣體 檢測體系；將氣體檢測容器置入酶促反應容器中，以使酶促反應產生的H2S氣體能夠擴散進 入氣體檢測體系； 步驟四、孵育過程： 用封板膜密封酶促反應容器，在37°C下孵育60分鐘； 步驟五、化合物1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-嘧啶二酮作為細 胞內hCBS酶抑制劑應用效果的檢測： 在酶標儀上測定H2S氣體檢測體系在413nm下的光吸收。
8. 如權利要求7所述的方法，其中，步驟一中加入的1,6-二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮的最終濃度 10iiM、1iiM、0. 1iiM或 0? 05iiM。
9. 一種如權利要求1所述的1，2, 4-三嗪并嘧啶二酮類化合物在治療循環休克、中風、 唐氏綜合癥和腫瘤的藥物中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種1,2,4-三嗪并嘧啶二酮類化合物作為hCBS酶抑制劑的應用，具體涉及化合物1,6–二甲基[1,2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(1H，6H)-嘧啶二酮作為hCBS酶抑制劑的應用。該小分子化合物對離體hCBS酶促反應的IC50為12μM，可以作為研究H2S信號通路的工具藥，以及開發治療循環休克、中風、唐氏綜合癥和腫瘤等與H2S相關的疾病的藥物的先導化合物。
【IPC分類】A61K31-53, A61P9-00, C12Q1-527, A61P9-10, A61P35-00, C12Q1-02, A61P25-00
【公開號】CN104546860
【申請號】CN201310466969
【發明人】吳方, 周越洋, 于晶
【申請人】上海交通大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月9日