蛇毒止痛劑的制作方法

專利名稱：蛇毒止痛劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛇毒作為止痛劑的用途。
背景技術：
盡管疼痛是至關重要的生理反應，不過它也會導致不必要的難受和痛苦。疼痛的控制和緩解是醫學的一個重要分支。疼痛既可以作為疾病的結果而發生，也可以作為醫療的結果而發生，例如化療。無論怎樣，盡可能多地減輕疼痛都是重要的，以便患者能夠正常活動。
與疼痛有關的兩種神經途徑在體內同時發揮作用(1)感覺途徑，它感覺組織損害，隨后產生疼痛的感覺；(2)止痛途徑，它減少疼痛的感覺，防止關于疼痛的信息流向中樞神經系統(CNS)，因而允許生物體維持其正常活動，不受損傷影響。使用抑制充當疼痛感受器的外周神經的藥物或者增強天然止痛系統都可以實現麻醉。由于這些是不同的途徑，因此它們受不同物質的影響。例如，阿斯匹林和利多卡因對外周感覺途徑有活性，而嗎啡和相關物質對止痛系統有活性。
目前使用的最有效的止痛劑是阿片來源的嗎啡類物質。眾所周知，大腦產生各種內源性阿片制劑，這一點解釋了這些物質的強大效果。它們對神經元的作用受特異性受體的介導。受這些受體調節的信號防止信息從外周疼痛神經元流向CNS。這些CNS神經元對其他各種化學物質也是敏感的，包括兒茶酚胺類(血清素、去甲腎上腺素等)、神經活性肽類(神經降壓素)和抑制性氨基酸類(甘氨酸和GABA)。
現存4000余種蛇中，已知大約有400種是有毒的。有毒的物種分為五個科，它們是蝰蛇科、眼鏡蛇科、Crotolidae、海蛇科和穴蝰科(Atractaspidae)。蝰蛇科蛇分布在歐洲、亞洲和非洲，包含8個屬，其中之一是蝰屬。Crotolidae科包括響尾蛇屬。眼鏡蛇科包括眼鏡蛇屬。
蛇毒包含多種不同的物質。據估計有數百種化合物，其中據信僅有4-8種參與蛇毒的毒性作用。盡管在功能上有相似性，不過蛇毒在它們的化學組成上還是有顯著區別的。每種都具有其特有的蛇毒組成。迄今，在這400余種有毒的蛇中僅鑒別出幾百種化合物。它們包括酶、毒素、生長因子等。大多數所分離的蛇毒化合物都是功能未知的。
蛇毒在傳統上被視為毒性物質的來源。不過，它也是止痛劑的來源。治療被一種南美蛇(彩響尾蛇(Crotalus durissus terrificus))咬傷的患者的醫生報道說盡管這些患者處于生命垂危狀態，不過他們沒有感覺到疼痛。有一種從蛇毒中分離的神經毒素產物在南斯拉夫第一屆神經毒理學大會(1977)上被認為是新型的止痛劑。這些和其他觀察結果引導人們嘗試從蛇毒中分離止痛化合物。
Bevan，P.和Hiestand，P.(1983)《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)2585319-5326描述了通過陽離子交換色譜法從Viperarusselli russelli毒中分離的單鏈多肽。該多肽與單胺和阿片配體競爭結合它們各自的受體，大鼠腦室內注射該多肽導致顯著的鎮靜效果。作者認為，該多肽是一種強烈帶電的大分子，不太可能通過血-腦屏障。還發現該多肽是一種毒性大小適度的毒素，類似于粗毒。
Dutta，A.S.和Chaudhuri，A.K.N.(1991)《印度實驗生物學雜志》(Indian J.Exp.Biol.)29937-942描述了用Viperarusselli粗毒對小鼠和大鼠所進行的實驗。將蛇毒通過腹膜內和靜脈內方式注射，發現在與CNS有聯系的一般行為模式上產生變化。蛇毒在一項測定中顯示顯著的止痛活性，但是在其他兩項測定中沒有活性。
1991年2月21日公布的WO91/01740公開了凍干大響尾蛇(Crotalus atrox)全毒在外用藥物組合物中的用途。該組合物具有止痛、致充血和解痙活性。
Giorgi，R.，Bernardi，M.M.和Cury，Y.(1993)《Toxicon》311257-1265描述了由通過超濾法從彩響尾蛇(Crotalus durissusterrificus)毒提取的小分子量物質所激發的止痛效果。將提取物通過皮下、腹膜內和口服方式對小鼠給藥。
1993年5月26日公布的CN1,072,344公開了含有蛇毒素酶商品(未給出來源)、白細胞肽因子和冰片的蛇毒素軟膏，冰片是一種已知的止痛中藥。該軟膏起到抗生素的作用，沒有毒副作用。
Pu，X.C.，Wong，P.T.H.和Gopalakrishnakone，P.(1995)《Toxicon》331425-1431描述了通過凝膠過濾和HPLC法從扁頸眼鏡蛇毒中精制的神經毒素。將該毒素通過腹膜內、口服或i.c.v.方式對小鼠給藥，發現具有有力的止痛效果。
U.S.S.R.專利No.435,824描述了從Nayaksin干燥眼鏡蛇毒中制備的止痛組合物。這種蛇來自眼鏡蛇科的眼鏡蛇屬。
過去20年間，一種名為Viprosalum或Viprosal的軟膏在前蘇聯和東歐用于緩解疼痛。這種軟膏是蝰蛇毒(歐洲種)的凡士林溶液以及羊毛脂、樟腦和solicilate的混合物。
發明概述本發明的目的是提供從蛇毒中分離的止痛物質，它基本上是無毒的。
按照本發明的一個方面，提供了基本上無毒的、從蛇毒中分離的級分，具有通過Mono Q離子交換色譜法從蛇毒中精制的級分特征，其中該級分具有止痛效果。
在本發明這方面的優選實施方式中，在Mono Q柱上、在20mMTris-HCl緩沖液pH7.0中進行色譜法，該級分在12-28分鐘時洗脫。應當強調的是，上述條件打算限定本發明的級分，并不限制可以制備該級分的方式。換句話說，本發明的級分可以通過各種精制方法而從蛇毒制備。不過，它被限定為具有如上所限定的精制級分的特征。
進而按照本發明的這個方面，提供了作為止痛劑使用的藥物組合物，包含基本上無毒的、從蛇毒中分離的級分，具有通過Mono Q離子交換色譜法從蛇毒中精制的級分特征，其中該級分具有止痛效果。
在本發明的優選實施方式中，該藥物組合物用于局部使用。
本發明在進一步方面提供了用于從蛇毒中分離基本上無毒的級分的方法，該級分具有止痛效果，是用一種水性緩沖液通過離子交換色譜法從蛇毒中精制的。
在本發明這方面的優選實施方式中，該離子交換色譜法是用MonoQ FPLC柱進行的。在進一步優選的實施方式中，該水性緩沖液是Tris-HCl緩沖液或乙酸銨緩沖液。在特別優選的實施方式中，緩沖液的濃度是20mM，pH在6.8-7.5范圍內。
由本發明所提供的級分結合了大量以前未曾報道共同出現在相同材料中的性質。這些性質包括(1)具有止痛活性；(2)基本上沒有毒性；和(3)基本上是精制的。
本說明書中，術語無毒被定義為不發生作為使用具有止痛效果的藥理水平的本發明級分的結果的病理現象。術語基本上無毒被定義為包括低至可接受程度的毒性以及沒有毒性。
本發明的級分可以從蝰蛇科(Viperidae)、眼鏡蛇科(Elapidae)、響尾蛇科(Crotolidae)、海蛇科(Hydrophidae)和穴蝰科(Atractaspidae)各種毒蛇中分離。盡管下述用于闡述本發明的實驗涉及山蝰(Vipera xanthina)、蝰蛇(Vipera russelli)、菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)和黑唇眼鏡蛇(Naja melanoleuca)，不過不言而喻的是這些物種僅僅充當上述五科毒蛇的實例。
盡管本發明的級分是粗毒的精制級分，不過它顯然包含不止一種物質。本發明不僅包括本發明的級分，而且包括各種可以從本發明級分中精制、并且具有本發明級分性質的產物。本發明還包括這些產物的衍生物，它們保留了本發明級分的性質。在蛋白質類材料的情況下，這樣的衍生物將包括蛋白質或多肽，其中一種或多種氨基酸已被加入、刪去和/或取代。其他化學修飾也涵蓋其中。
本發明的級分可以用于制備作為止痛劑使用的藥物組合物。這樣一種組合物還將包含藥學上可接受的載體或賦形劑，例如羊毛脂和凡士林的混合物。該組合物可以制成腸胃外使用的劑型，例如鹽水溶液，或局部使用的軟膏劑、霜劑或油膏劑。為了緩解受治療者的疼痛，藥物組合物將被注射或者局部涂抹在適當的位置。其他可能的用藥模式是口服和直腸用藥。除了活性成分以外，任何藥物組合物一般還將包接受的載體或賦形劑。由于本發明的級分有時在一遲滯期后發揮作用，預期它將尤其對慢性疼痛有效，盡管它可以用于治療任何類型的疼痛。
附圖的簡要說明結合下列優選實施方式的詳細說明和下列附圖，有助于更好地理解本發明，其中

圖1A和1B闡述在Mono Q柱上精制巴勒斯坦山蝰(Viperapalestinae)毒期間所得結果。Y軸代表280nm下的吸光度，X軸是洗脫時間，以分鐘計。圖B是圖A9-31分鐘和更低吸光度范圍區域的放大；圖2闡述另一次在Mono Q柱上精制巴勒斯坦山蝰(Viperapalestinae)毒期間所得結果；圖3闡述在Mono Q柱上精制蝰蛇(Vipera russelli)毒期間所得結果；圖4闡述在Mono Q柱上精制菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)毒期間所得結果；圖5闡述用Tris-HCl緩沖液在Mono Q柱上精制黑唇眼鏡蛇(Najamelanoleuca)毒期間所得結果；和圖6闡述用乙酸銨緩沖液在Mono Q柱上精制黑唇眼鏡蛇(Najamelanoleuca)毒期間所得結果。
優選實施方式的詳細說明材料和方法蛇毒提取數百條蛇，得到巴勒斯坦山蝰(Vipera palestinae)毒。將它們的蛇毒冷凍和凍干。其他蝰屬蛇毒購自‘Latoxin’，Rosans，France。菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)和黑唇眼鏡蛇(Najamelanoleuca)毒購自‘Quality Venoms for Medical Research’，NewYork，U.S.A.。
測定A、止痛測定
A、止痛測定每項試驗使用數十只相似體重和年齡的倉鼠。根據所要試驗的樣本數將倉鼠分組。將含有供試物質的軟膏劑(50％羊毛脂和50％凡士林)涂抹在動物背部毛皮上。不切除毛皮，以確保對皮膚沒有損害。對照組倉鼠用不含本發明級分的軟膏劑處理。通過連續局部涂抹6、14或21天對倉鼠進行處理。在最后一次涂抹軟膏劑后第二天進行止痛性試驗。
在典型的試驗中，對每只動物涂抹含有或不含止痛物質的恒量軟膏劑達預定天數。這個階段之后，在股骨區皮下注射0.8ml 1NHCl/0.1kg體重誘發疼痛。倉鼠對HCl注射的反應是用舌頭觸及注射區域，這稱為“舔”。從注射后20分鐘開始觀察倉鼠達40分鐘，計數“舔”的次數。“舔”的次數充當HCl誘發疼痛的定量指征。
比較對照動物與治療動物“舔”的平均次數，測定止痛效果。利用t檢驗統計測定差異的顯著性。
B、致死劑量測定將四種不同濃度的供試物質注射至體重20-25克的小鼠的腹膜內。每種濃度注射八只小鼠。計算供試物質引起50％死亡的劑量(LD50)的方法描述在Reed，L.J.和Muench，H.(1938)《美國衛生學雜志》(Am.J.Hygiene)27493中。LD50單位被定義為每20g體重導致注射小鼠50％死亡所必需的供試物質量(mg/20g)。
C、毒性測定使用倉鼠進行短期測定(最多10天)，其中將供試物質注射至腹膜內達10天。使用大鼠進行長期測定，此間局部涂抹軟膏劑，每天一次，每周6天，歷時4個月(共計涂抹100次)。
在即期毒性測定中，用0.1或0.2ml各種未稀釋的Mono Q級分皮下注射小鼠(20-25克)。
D、蛋白質測定使用已知濃度的卵清蛋白標準，在280nm下通過光譜法測定本發明級分中的蛋白質類材料的量及其在每份分離物中的濃度。
實施例I、從巴勒斯坦山蝰(Vipera palestinae)毒精制本發明的級分在典型的精制中，將50-80mg巴勒斯坦山蝰毒溶于20mM Tris緩沖液pH7.5，最終濃度為0.1g/ml。離心并除去沉淀后，將上清液通過微孔濾器(40微米)過濾，取0.1-0.2ml上1×10cm FPLC Mono Q柱(Pharmacia)。A溶劑由20mM Tris緩沖液pH7.5組成，B緩沖液由20mM Tris和0.5M NaCl組成。在洗脫的前20分鐘期間單用緩沖液A。在后45分鐘期間使用緩沖液A與B的混合物(50％∶50％)，最后5分鐘使用100％緩沖液B。本發明的級分在20-25分鐘區域洗脫出來(見圖2B)，這是根據各種測定所確定的(見下)。洗脫也可以單用緩沖液A進行，可以用20mM乙酸銨pH6.9代替。歷時3年用Mono Q柱進行了一百次精制，均得到相似的結果。
II、來自巴勒斯坦山蝰(Vipera palestinae)毒的本發明級分的鑒別A、本發明級分的性質為了測定本發明級分的性質，將在Mono Q柱上制得的0.1mg本發明級分溶于緩沖溶液。同時，將2.4mg鏈霉蛋白酶E溶于洗脫緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.5)，制得鏈霉蛋白酶E。準備三支試管，一支僅含有鏈霉蛋白酶，第二支僅含有本發明級分，第三支中將本發明級分用5μl鏈霉蛋白酶E(0.17微克)培養。將試管在室溫下培養24小時，然后試驗止痛活性。
結果是僅有試管2具有止痛活性。該試驗重復3次，均得到同一結果。因此可以得出結論，本發明級分具有蛋白質樣性質或者它的止痛活性需要蛋白質的參與。
B、本發明級分的純度在10次分離操作的基礎上，來自Mono Q柱的20-25分鐘級分(見上I)含有0.02±0.05S.D.mg/ml蛋白質。每次操作得到0.1mg本發明級分。該數量相當于總上柱蛇毒蛋白的0.6％。這說明本發明級分的純度高。
III、止痛活性使用歷時兩年制得的制劑試驗本發明級分的止痛活性。將含有0.01mg蛋白質的0.2ml本發明級分溶于50g軟膏，得到濃度為0.0002mg本發明級分/g軟膏。如“方法”一節所述將倉鼠用該軟膏局部處理21天。結果總結在表1中。
表1
*7次實驗“舔”的平均數±S.D.
這些實驗顯示，與對照相比，用本發明級分處理的倉鼠減少了對HCl誘發疼痛的感覺。用Mono Q柱制備的本發明級分完全與蛇毒的毒性組分分離開來，見如下討論。
IV、毒理學研究A、本發明級分的注射A1、向小鼠(每只20-25g)s.c.注射0.05mg用Mono Q柱制備的本發明級分。該劑量是在倉鼠中產生止痛效果所需量的250倍。在該劑量下，本發明級分對小鼠沒有毒性，觀察到沒有可見的癥狀。相形之下，注射從柱子洗脫的0.02mg前幾次級分(試管2-7)導致被注射的全部5只小鼠立即死亡。該發現證明止痛級分基本上沒有毒性。
A2、在進一步的實驗中，用本發明級分注射3組倉鼠，每組8只(100-120克)。將凍干級分溶于生理鹽水溶液，濃度為0.002mg/ml，分別取0.1ml或0.2ml每日注射到第一組和第二組動物腹膜內達10天。第三(對照)組僅注射0.2ml鹽水。注射的10天內，采集血樣用于生化參數的測定和組織病理學試驗。
在所測定的生化因子中，在前兩組中觀察到膽固醇和淀粉酶增加(結果沒有顯示)。不過觀察到肝酶(LDH，SGOT，SGPT)功能沒有顯著變化。
A3、研究了A2節實驗動物的組織病理學。在本發明級分注射組與對照組之間檢測到沒有顯著的組織病理學差異。
B、局部處理如“方法”一節(止痛測定)所述將本發明級分制成軟膏劑。使用三組大鼠，每組10只(雄性和雌性)，體重120-140g。如“方法”一節所述局部涂抹軟膏劑。涂于第1組和第2組的軟膏劑包含濃度分別為0.0002和0.001mg/g的本發明級分。第3組中，軟膏劑僅包含溶劑作為對照。每日向每只大鼠涂抹0.2g軟膏。在實驗的四個月期間，第1組的每只大鼠總計接受0.03mg/kg體重的本發明級分，第2組的每只大鼠總計接受0.15mg/kg體重的本發明級分。在實驗期間，觀察到大鼠的行為或體重沒有變化。
在實驗室中收集血液和尿液。關于收集尿液，將動物置于塑料表面上，收集尿液，立即用Multistick試驗。關于采集血液，將大鼠麻醉，采集動脈血。離心除去血漿，貯存在4℃下，測定生化參數。
B1、檢測到SGPT或SGOT沒有增加。檢測到下列血液分析物水平與對照組沒有顯著差異Cre；Ca2+；P(i)；Glu；Ur；Chl；TP；Alb；Bili；Al.Phos；AMY(結果沒有顯示)。
B2、尿液中各種生化參數的測量結果總結在表2中。
表2
*僅使用雄性大鼠。
表中分析物水平說明如下(-)陰性；(0)痕量；(+)低；(++)中等。括號后的數字表示所試驗的大鼠數。
檢測到沒有顯著差異。
B3、研究了用溶于軟膏的本發明級分局部處理的成年大鼠的組織病理學。最后一次涂抹軟膏后第二天，處死動物，取它們的皮膚和組織，固定在福爾馬林中。將組織包埋在石蠟中，切成6微米切片。用蘇木精和Oozin染色。試驗了下列組織(1)受處理區域的皮膚；(2)未處理區域的皮膚；(3)心臟；(4)腎臟；和(5)腦。
組織來自(1)用0.0002mg/g止痛級分處理的十只大鼠中的八只；(2)用0.001mg/g止痛級分處理的十只大鼠中的六只；和(3)八只對照大鼠。所有被試驗的大鼠都是隨機選擇的。
結果總結在表3中。
表3
結論是在處理組與對照組之間觀察到沒有顯著的組織病理學變化。
總而言之，發現從Vipera palestinae毒中分離的本發明級分沒有顯著毒性。
V、Vipera palestinae的額外精制使用不含NaCl的20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0在Mono Q柱上進行Vipera palestinae毒的額外精制，本發明級分在13-17分鐘時洗脫，峰值為14.5分鐘(圖2)。
VI、從蝰蛇(Vipera russelli)制備本發明級分和鑒別A、精制使用20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0在Mono Q柱上精制Viperarusselli毒。本發明級分在12-17分鐘時洗脫，峰值為13.5分鐘(圖3)。
B、止痛活性如“方法”一節所述試驗如上VI-A精制的級分對倉鼠的止痛活性。發現對照組舔的次數(平均±S.D.)為83.8±11.8，而受處理倉鼠舔的次數為47.6±7.7(p＜0.02)。這說明該級分具有顯著的止痛活性。
C、毒理學研究對小鼠進行皮下注射，測量Mono Q級分的即期(immediate-term)毒性。發現在0.3-4.3分鐘洗脫的0.1ml級分導致被注射小鼠立即死亡。5分鐘后洗脫的0.2ml級分(包括止痛級分)沒有毒性。
VII、從菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)制備本發明級分和鑒別A、精制使用20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0在Mono Q柱上精制菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)毒。本發明級分在10-20分鐘時洗脫，峰值為15.3分鐘(圖4)。在使用20mM乙酸銨緩沖液pH 7.0所進行的另一次精制中，該級分在12.5-17分鐘洗脫(結果沒有顯示)。
B、止痛活性如“方法”一節所述試驗如上VII-A精制的級分對倉鼠的止痛活性。發現對照組舔的次數(平均±S.D.)為83.8±11.8，而受處理倉鼠舔的次數為25.3±5.3(p＝0.00)。這說明該級分具有顯著的止痛活性。
C、毒理學研究如上VI(c)測量Mono Q級分的毒性。發現毒性級分在0.5-5.0分鐘洗脫。5分鐘后洗脫的全部級分(包括止痛級分)都沒有毒性。
VIII、從黑唇眼鏡蛇(Naja melanoleuca)制備本發明級分和鑒別A、精制使用20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0在Mono Q柱上精制Najamelanoleuca毒。本發明級分在12-18分鐘時洗脫，峰值為14.3分鐘(圖5)。在使用20mM乙酸銨緩沖液pH6.9所進行的另一次精制中，該級分在峰值17分鐘洗脫(圖6)。
B、毒理學研究如上VI(c)測量Mono Q級分的毒性。發現毒性級分在0.1-4.0分鐘洗脫。5分鐘后洗脫的全部級分(包括止痛級分)都沒有毒性。
本領域技術人員將認識到，本發明并不限于已經描述的內容，相反，本發明的范圍僅受下列權利要求的限制。
權利要求
1.基本上無毒的、從蛇毒中分離的級分，具有通過Mono Q離子交換色譜法從蛇毒中精制的級分特征，其中所述級分具有止痛效果。
2.根據權利要求1的級分，其中所述色譜法是在Mono Q柱上、在20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0中進行的，該級分在12-28分鐘時洗脫。
3.根據權利要求1的級分，其中所述蛇選自由蝰蛇科(Viperidae)、眼鏡蛇科(Elapidae)、響尾蛇科(Crotolidae)、海蛇科(Hydrophidae)和穴蝰科(Atractaspidae)組成的組。
4.根據權利要求3的級分，其中所述蝰蛇科是山蝰(Viperaxanthina)。
5.根據權利要求4的級分，其中所述山蝰是巴靳斯坦山蝰(Viperaxanthina palestinae)。
6.根據權利要求3的級分，其中所述響尾蛇科是菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)。
7.根據權利要求3的級分，其中所述眼鏡蛇科是黑唇眼鏡蛇(Najamelanoleuca)。
8.從權利要求1級分得到的產物，它保留該級分的所述性質。
9.權利要求8的產物的衍生物，它保留權利要求1級分的所述性質。
10.根據權利要求1的級分在作為止痛劑使用的藥物組合物制備中的用途。
11.作為止痛劑使用的藥物組合物，包含根據權利要求1的基本上無毒的級分和藥學上可接受的載體或賦形劑。
12.用于局部給藥的根據權利要求11的藥物組合物。
13.用于腸胃外給藥的根據權利要求11的藥物組合物。
14.用于治療疼痛的根據權利要求11的藥物組合物。
15.緩解受治療者疼痛的方法，包括將根據權利要求1的基本上無毒的級分對所述受治療者給藥。
16.根據權利要求15的方法，其中所述級分是局部給藥的。
17.用于從蛇毒中分離基本上無毒的級分的方法，其中所述級分具有止痛效果，該方法包括將全毒上離子交換柱，用一種水性緩沖液洗脫該級分。
18.根據權利要求17的方法，其中所述柱子是Mono Q離子交換柱。
19.根據權利要求18的方法，其中所述柱子是用Tris-HCl緩沖液或乙酸銨緩沖液洗脫的。
20.根據權利要求19的方法，其中所述緩沖液的濃度是20mM，pH在6.8-7.5范圍內。
21.根據權利要求20的方法，其中所述級分在12-28分鐘時洗脫。
全文摘要
公開了從蛇毒中分離的基本上無毒的級分,該級分具有止痛效果。該級分具有在Mono Q離子交換柱上從蛇毒中精制的級分特征。還描述了包含該無毒級分的作為止痛劑使用的藥物組合物和用于緩解疼痛的方法,包括將該無毒級分給藥。
文檔編號A61P25/00GK1361695SQ99816844
公開日2002年7月31日 申請日期1999年7月14日 優先權日1999年7月14日
發明者A·舒洛弗, N·普利莫爾 申請人:S.I.S.舒洛弗科學研究有限公司