調節NF－kB的人遍在蛋白連接酶E3的制作方法

專利名稱：調節NF－kB的人遍在蛋白連接酶E3的制作方法
技術領域：
本發明在總體上涉及用于調節核因子κB(NF-κB)活化的組合物和方法。本發明具體地涉及調節磷酰化IκBα和/或IκBβ的遍在蛋白化的物質，以及與NF-κB活化相關的疾病的治療方法。本發明所使用的調節劑包括E3遍在蛋白連接酶、其部分及其變體。
背景技術：
NF-κB是一種轉錄因子，它在針對免疫、炎癥及急性期的應答基因(包括白細胞介素1、白細胞介素8、腫瘤壞死因子和某些細胞粘附分子)所觀察到的基因表達的高特異模式中起關鍵作用。如同轉錄激活因子Rel家族的其他成員，NF-κB以非活化形式被隔離在大多數細胞類型的胞質中。包括促細胞分裂原、細胞因子、抗原、應激誘發劑、UV光和病毒蛋白在內的多種細胞外刺激物引發信號轉導途徑，該途徑最終導致NF-κB的釋放和活化。
重要的NF-κB活化調節劑是抑制劑蛋白IκBα和IκBβ(在此稱作IκB)，它們與未受激細胞的胞質中的NF-κB結合(并因此失活)。在發生信號引導的IκB磷酰化之后，發生NF-κB的活化和核易位，這導致經遍在蛋白途徑發生蛋白質的水解。對于IκBα，刺激誘發的在第32和36位絲氨酸上的磷酰化使所述抑制劑成為在第21和22位賴氨酸上遍在蛋白化的目標靶，而這將導致降解。與之相似，IκBβ在第19和23位絲氨酸上的磷酰化使所述抑制劑成為在第9位賴氨酸上遍在蛋白化的目標靶。然而，還沒有鑒定出介導IκB識別的遍在蛋白系統的成分。
蛋白經遍在蛋白途徑的降解通過兩個非連續和連續步驟進行(a)多個遍在蛋白分子共價附著到蛋白底物上，和(b)通過26S蛋白體復合物降解靶蛋白。遍在蛋白途徑包含了多種成分，這些成分以分級方式共同發揮作用(綜述參見Ciechanover，Cell 7913，1994；Hochstrasser，Curr.Op.Cell.Biol.7215，1995；Jentsch and Schlenker，Cell 82881，1995；Deshaies，Trends Cell Biol.5428，1995)。單一E1酶是一個這樣的成分，它進行遍在蛋白的激活。在哺乳動物細胞、植物和酵母中分析表征了一些主要的E2酶。E2酶可能與連接酶E3結合(Reiss andHersko，J.Biol.Chem.2653685，1990；Dohmen et al.，Proc.Natl，Acad，Sci.USA 887351，1991)，似乎每種E2酶都能與一種或多種E3蛋白作用(Nuber et al.，J.Biol.Chem.2712795，1996；Orian et al.，J.Biol.Chem.27021707，1995；Stancovski et al.，Mol.Cell.Biol.157106，1995；Gonen et al.，J.Biol.Chem.271302，1996)。
已經被描述過的E3酶(遍在蛋白連接酶)很少。哺乳動物E3α(酵母中的UBR1)和E3β通過它們的游離N端氨基酸殘基來識別蛋白底物(“N末端規則”；Varshavsky，Cell 69725，1992；Hershko and Ciechanover，Ann.Rev.Biochem.61761，1992)。Cdc53可能是一種參與靶向磷酰化G1細胞周期蛋白的E3(Willems et al.，Cell 86453，1996)。E6-AP參與對p53的識別(Scheffner et al.，Cell 75495，1993)，已經鑒定了一系列獨特的E6-AP同源蛋白(Huibregtse et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA922563，1995)Nedd4參與上皮Na+通道的降解(Staub et al，Embo J.152371，1996)，RSP5(NIP1)參與通透酶Gap1和Fur1的示蹤(Hein et al.，Mol.Microbiol.1877，1995)，而Pub1靶向Cdc25(Nefsky and Beach，EMBO J.151301，1996)。最近分離的一些其他E3酶似乎參與肌蛋白c-Fos的降解，并參與NF-κB前體p105的加工(Orian et al.，J.Biol.Chem.27021707，1995；Stancovski et al.，Mol.Cell.Biol.157106，1995；Gonenet al.，J.Biol.Chem.271302，1996)。因此看來，所述連接酶是個大的且其中大部分未闡明的酶家族，并且，除了“N末端規則”連接酶(E3α和E3β)的識別方式之外，尚沒有鑒定出遍在蛋白系統的所有其他已知底物的識別基元。
因此，本領域需要提高對IκB經遍在蛋白途徑降解的理解，并需要鑒定出此降解過程的調節劑，以將其用于治療與NF-κB活化相關的疾病。本發明滿足了這些需要并進一步提供其他有關優勢。
發明概述簡要地說，本發明提供通過調節磷酰化IκBα和/或IκBβ的遍在蛋白化而調節核因子κB(NF-κB)活化的組合物和方法。一方面，本發明提供了分離的人E3遍在蛋白連接酶多肽。這些多肽可包括SEQ IDNO16所示的人E3遍在蛋白連接酶序列、其部分或者其變體，所述變體的區別在于一個或多個氨基酸的替換、插入、缺失和/或添加，以致多肽(a)增強了磷酰化IκB的遍在蛋白化作用或者(b)與磷酰化IκB結合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用。在某些實施方案中，這樣的一個多肽可具有SEQ ID NO16或所示的序列其變體，該變體的區別在于在不超過20％的SEQ ID NO16氨基酸殘基上發生一個或多個氨基酸的缺失、插入或替換，以致多肽增強了磷酰化IκB的遍在蛋白化作用。在進一步的實施方案中，這樣的一個多肽可包括人E3遍在蛋白連接酶的一部分或這一部分的變體，其中所述部分與磷酰化IκB結合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用。
另一方面，本發明進一步提供分離的編碼上述多肽的多核苷酸。在某些實施方案中，這樣的多核苷酸可編碼上述人E3遍在蛋白連接酶的一部分或這一部分的變體。也提供了包含與所述多核苷酸互補的至少10個連續核苷酸的反義多核苷酸。進一步提供了包含所述多核苷酸的表達載體以及用該表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
本發明更進一步提供包含與生理上可接受的載體相結合的上述多肽或多核苷酸的藥物組合物。
此外，本發明提供分離的抗體及其抗原結合片段，它們和具有SEQID NO16所示序列的人E3遍在蛋白連接酶相結合。這樣的抗體可以是單克隆抗體。
本發明更進一步提供包含與生理上可接受的載體相結合的上述抗體或片段的藥物組合物。
本發明進一步提供調節患者NF-κB活性的方法，包括給患者施用上述藥物組合物。
更進一步，本發明提供治療患有與NF-κB活化相關的病癥的患者的方法，包括給患者施用治療有效量的上述藥物組合物，由此治療與NF-κB活化相關的病癥。所述病癥包括炎癥、自身免疫性疾病、癌癥和病毒感染。
本發明進一步提供調節NF-κB活性的物質的篩選方法，包括以下步驟(a)使候選物質與人E3遍在蛋白連接酶多肽接觸，其中多肽包含SEQ ID NO16所示序列或者其部分或變體，所述變體的區別在于一個或多個氨基酸的替換、插入、缺失和/或添加，以致多肽增強了磷酰化IκB的遍在蛋白化作用，該接觸條件和時間足以使多肽和候選物質相互作用；和(b)隨后評價相對于預先確定的在不存在候選物質時多肽增強磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力，多肽增強磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力；由此識別出調節NF-κB活性的物質。用于此篩選的候選物質包括但不僅限于組合文庫中的小分子。
參照以下具體說明和附圖，本發明的上述方面及其他方面將變得很明顯。如同每篇文獻分別引入一樣，所有在此公開的文獻以全文引入作為參考。
附圖簡述

圖1A-1D是放射自顯影圖，其描繪了在各種IκB E3識別基元存在或不存在的條件下進行的遍在蛋白化實驗的SDS-PAGE分析結果。除非另外指明，底物是35S-標記的、以HA示蹤的IκB多肽，該多肽是經磷酰化的并與NF-κB復合物結合。
在圖1A中，泳道1顯示在32和36位置上含有丙氨酸殘基的IκBα多肽(S32/36A；SEQ ID NO13)的遍在蛋白化作用，泳道2顯示未磷酰化的野生型IκBα多肽(SEQ ID NO12)的遍在蛋白化作用。在泳道3-14中，遍在蛋白化底物是野生型IκBα多肽(SEQ ID NO12)。在泳道3中，在ATP不存在的條件下進行遍在蛋白化；在泳道4-14中，在ATPγS存在的條件下使用(泳道5-14)或不使用(泳道4)IκB E3識別基元或其他肽進行反應。所示肽為400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道5)；400μM第32、36位絲氨酸被替換為丙氨酸的IκBα肽(pp21S/A(SEQ ID NO11)，泳道6)；40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO9)，泳道7)；400μM未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO9)，泳道8)；100μM單磷酰化的IκBα肽(ppS32(SEQ ID NO9)，泳道9；ppS36(SEQID NO9)，泳道10)；和40μM較短的、二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQID NO8)，泳道11)；pp15(SEQ ID NO7)，泳道12；pp11(SEQ ID NO6)，泳道13；pp7(SEQ ID NO5)，泳道14)。
在圖1B中，遍在蛋白化底物是游離的野生型IκBα(SEQ IDNO12，泳道1-3)或游離的S32/36A替換的IκBα(SEQ ID NO13，泳道4-6)。在ATPγS不存在(泳道1和4)或存在(泳道2、3、5和6)的條件下進行反應。將40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO9)加入泳道3和6所示樣品的偶聯反應混合物中。
在圖1C中，顯示在HeLa提取物中大量細胞蛋白的遍在蛋白化。泳道1顯示在ATP不存在的條件下的遍在蛋白化，泳道5顯示在ATP存在的條件下的遍在蛋白化。在泳道3-5中，加入了IκB E3識別基元或其他肽40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO9)，泳道2)；400μMc-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道3)；和400μM未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO9)，泳道4)。
在圖1D中，遍在蛋白化底物是磷酰化(泳道2-7)或未磷酰化(泳道1)的野生型IκBβ(SEQ ID NO14)。在ATPγS不存在(泳道2)或存在(泳道1，3-7)的條件下使用(泳道4-7)或不使用(泳道1-3)IκB E3識別基元或其他肽來進行反應。所示肽為40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQID NO9)，泳道4)；400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道5)；40μM二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQ ID NO8)，泳道6)；和400μM未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO9)，泳道7)。
圖2是放射自顯影圖，其描繪了使用受激HeLa細胞提取物進行的體外遍在蛋白依賴型降解實驗的結果。在SDS-PAGE的每個泳道中，顯示的是在降解實驗后磷酰化(上帶)和未磷酰化(下帶)的以HA示蹤的IκBα多肽(SEQ ID NO12)的水平。泳道1顯示這些多肽在不使用ATP進行的降解實驗后的水平。在泳道2-6中，在反應混合物中包括了ATP。將40μM候選調節劑加入泳道3-6所示的反應二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO9)，泳道3)；二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQ IDNO8)，泳道4)；c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道5)；和未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO9)，泳道6)。
圖3A是放射自顯影圖，其描繪了使用HeLa細胞溶胞產物的分級流通級分進行的遍在蛋白化實驗的SDS-PAGE分析結果，所述HeLa細胞溶胞產物經調節劑柱進行分級分離。在所有情況下，底物是35S-標記的、以HA示蹤的IκBα多肽(SEQ ID NO12)，該多肽是經磷酰化的并與NF-κB復合物結合。泳道1顯示使用未分離提取物的遍在蛋白化水平。在泳道2-9中，提取物經肽-瓊脂糖凝膠柱進行分級分離。使用的肽為c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道2)；第32、36位絲氨酸被替換為丙氨酸的IκBα肽(pp21S/A(SEQ ID NO11)，泳道3)；二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO9)，泳道4-6)；二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQ ID NO8)，泳道7-9)。另外，將網狀細胞的級分II(160μg)加入泳道5和8所示的遍在蛋白化反應中，將級分I(160μg)加入泳道6和9中的反應。
圖3B是放射自顯影圖，其顯示了在HeLa細胞中大量細胞蛋白的遍在蛋白化作用。泳道1顯示在ATP不存在的條件下的遍在蛋白化，泳道2顯示在ATP存在但無候選調節劑的條件下的遍在蛋白化。在泳道3-6中，加入了候選調節劑40μM二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQ IDNO8)，泳道3)；400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道4)；400μM第32、36位絲氨酸被替換為丙氨酸的IκBα肽(pp21S/A(SEQ IDNO11)，泳道5)；40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO9，泳道6)。
圖4A-4F是顯微照片，其顯示了候選調節劑對的核NF-κB易位的影響。在圖4A-C中，pp21(圖4A和4B)或ppFos(圖4C)被顯微注射入HeLa細胞的胞質中。接著立即用TNFα激活細胞并用抗p65的抗體對細胞進行免疫染色。在圖4D-F中，pp21(圖4D)或ppFos(圖4F)被注射入人血管上皮細胞(HUVEC)的胞質中。接著立即用TNFα活化細胞并用抗E-選擇蛋白的抗體對細胞進行免疫染色。圖4E是圖4D的相差顯微照片。在每個顯微照片中，注射的細胞用大箭頭標出。在圖4D和4E中，未注射的E-選擇蛋白陰性細胞用小箭頭標出。
圖4G和4H呈現圖4A-4F所示顯微注射實驗的概略。在圖4G中顯示了表現出核p65染色的HeLa細胞百分數。使用pp21和ppFos分別顯微注射90和42個細胞。圖4H顯示了表現出E-選擇蛋白染色的HUVEC的百分數。使用pp21和ppFos分別顯微注射160和36個細胞。對于每一張圖，柱1顯示在IκBE3識別基元或其他肽以及TNFα活化不存在時的水平。柱2-4顯示了在肽不存在(柱2)或者pp21存在下(柱3)或ppFos存在下(柱4)在TNFα激活后的水平。
圖5是放射自顯影圖，其描繪了Western印跡分析結果，該Western印跡分析顯示來自TNFα活化細胞的pIκBα相關性遍在蛋白-連接酶活性的免疫沉淀。將pIκBα/NF-κB復合物從蛋白體受抑制的、受TNFα刺激的或未受激的HeLa細胞中免疫沉淀出來，并通過遍在蛋白、ATP-γS和以下成分的加入進行體外的遍在蛋白化，所述成分為泳道1，UBC5C；泳道2，UBC5C和E1；泳道3，無；泳道4-6，UBC5C和所標示的E1；泳道7，UBC5C、E1和pIκBα-肽；泳道8，UBC5C、E1和絲氨酸被替換的IκBα肽；泳道9，受TNFα刺激的HeLa溶胞產物樣品。細胞刺激示于TNFα行。在圖的左邊、底部和頂部標出了單體及與遍在蛋白偶聯的IκBα。
圖6是放射自顯影圖，其說明當IκBα在DSGLDS(SEQ ID NO8和19)位點發生IKK磷酰化后，遍在蛋白-連接酶和IκBα/NF-κB復合物的相關性。從未活化的細胞中免疫純化出35S標記的IκBα/NF-κB復合物。該復合物用IKK-2EE磷酰化(在上方用+標出)，作為E3源與未活化的HeLa溶胞產物一起溫育，洗滌，并在ATPγS、遍在蛋白、E1、UBC5C(除非被排除的成分由Abst Ub-Enz指明)的存在下在體外進行遍在蛋白化。泳道2-7顯示由IKK產生的磷酰化；泳道1和3-7顯示與HeLa溶胞產物一起溫育的影響；在泳道4中，在與HeLa溶胞產物一起溫育的過程中加入了pIκBα肽；在泳道5中，在HeLa溫育的過程中加入了絲氨酸被替換的IκBα肽；在泳道6中，將E1從遍在蛋白化階段中省去；在泳道7中，在遍在蛋白化過程中將UBC5C省去。
圖7A和7B說明與遍在蛋白-連接酶活性相關的IκBα結合蛋白的識別。圖7A顯示SDS-聚丙烯酰胺凝膠樣品的膠體藍染色，所述樣品為含有IκBα/NF-κB和相關蛋白的經免疫純化的級分。IκBα/NF-κB復合物用IKK-2EE磷酰化(泳道2、3)或模擬磷酰化，并用于吸附來自HeLa溶胞產物的遍在蛋白-連接酶(泳道1、2)。在右邊指出了分子大小標準參照物(kD)。在左邊指出了通過質譜分析鑒定的蛋白。在左側用括號標出對應于與遍在蛋白-連接酶活性相關的帶(p54和p58)的凝膠位置。圖7B足吸附到pIκBα/NF-κB上的蛋白的放射自顯影圖，其中所述pIκBα/NF-κB來自35S標記的HeLa細胞。放射性標記的HeLa溶胞產物與IKK磷酰化的、抗體固定化的IκBα/NF-κB復合物一起溫育。然后，洗滌免疫復合物，進行洗脫，用SDS-PAGE和放射自顯影方法對其進行并分析。泳道1顯示與HeLa溶胞產物一起溫育的未磷酰化的IκBα/NF-κB復合物；泳道2-4顯示在不存在(泳道2)或存在pIκBα肽(泳道3)或絲氨酸被替換的IκBα肽(泳道4)的條件下與HeLa溶胞產物一起溫育的磷酰化IκBα/NF-κB復合物。在左邊指出的是分子大小標準參照物(kD)、RelA和IκBα帶；在右邊指出的是四個與pIκBα相關的帶，其中三個用pIκBα肽展示(箭頭)。
圖8A-8D顯示與遍在蛋白-連接酶相關的p54的質譜分析結果。圖8A顯示未分離的胰蛋白酶肽混合物的納電子噴射質譜(nanoelectrospray mass spectrum)，其中所述混合物來自從連接酶陽性泳道(等價于圖7B中的泳道2)切下的54kD凝膠帶。將箭頭所標的峰打碎并將其鑒定為由β-TrDP衍生的肽。橫條指示在C中放大的區域。圖8B和8C顯示與遍在蛋白-連接酶活性相關(C)或不相關(B)的54 kD帶的納電子噴射譜的比較。選擇m/z為714.38的肽測序。圖8D為在圖8C中鑒定的肽的碎片譜。從一系列二價碎片離子中裝配出序列標志，在nrdb數據庫中搜索相符的模式。將針對檢索到的β-TrCP序列AAVNVVDFDDKYIVSASGDR(SEQ ID NO20)而計算出的碎片質量與全部碎片譜比較，以證實二者相符。用圓圈標出與預期碎片離子相符的峰。
圖9A和9B表示編碼人E3遍在蛋白連接酶的多核苷酸序列(SEQID NO15)。
圖10表示人E3遍在蛋白連接酶蛋白序列(SEQ ID NO16)。
圖11A-11C是Western印跡，其說明E3遍在蛋白連接酶家族成員的結合特異性和遍在蛋白化特異性。在這些圖中，mβ-TrCP指小鼠β-TrCP，hβ-TrCP指人β-TrCP，Δβ-TrCP指缺失了F盒區域的人β-TrCP，Slimb指果蠅Slimb蛋白。圖11A說明與pIκBα的選擇性結合。利用FLAG抗原決定簇將蛋白從被轉染的293T細胞中免疫沉淀出來，將該蛋白與經免疫純化的IκBα/NF-κB復合物一起溫育，所述復合物已進行過指定處理(-/+IKK)，并利用所指明的抗體通過Western印跡來分析已結合的物質。該圖的上部顯示特異性pIκBα結合；中部顯示10％底物流通；下部為經免疫沉淀的蛋白的印跡；在左邊指出了分子大小標準參照物(kD)。圖11B顯示，β-TrCP-pIκBα的結合被磷酸肽廢除，所述磷酸肽為pIκBα降解基元1(pp10)，而不被有關的未磷酰化肽(pS/A)廢除。圖11C說明由E3家族成員蛋白產生的pIκBα體外遍在蛋白化。將經免疫純化的以FLAG示蹤的蛋白與35S標記的IκBα/NF-κB復合物一起溫育，進行指定處理(-/+IKK)并在ATPγS、遍在蛋白、E1、UBC5C的存在下進行遍在蛋白化。在左邊指出了IκBα底物(由全長的兩個降解產物組成)、pIκBα-多遍在蛋白偶聯物和分子大小標準參照物。
圖12A和12B說明Δβ-TrCP的過度表達對IκBα降解和NF-κB活化的抑制，Δβ-TrCP是一種顯性陰性分子。圖12A顯示在受P/I刺激的Jurkat細胞中的κB依賴型熒光素酶實驗結果，其中所述Jurkat細胞是用κB-Luc報告基因質粒和指明的表達載體(即，從左至右分別是僅載體、編碼人β-TrCP的載體、缺失了F盒區域的編碼人β-TrCP的載體以及編碼果蠅Slimb蛋白的載體)轉染的。NF-κB活性顯示為相對(倍數)的熒光素酶活性，并以未受激的空FLAG載體作為參照(單倍)。圖12B顯示IκBα的Western印跡分析結果，其中IκBα為佛波酯和受Ca+[P/I]刺激和未受激Jurkat細胞的IκBα，且所述Jurkat細胞是用空FLAG載體或Δβ-TrCP轉染的。圖中指出了刺激后的間隔(分鐘)。
發明詳述如上所述，本發明總體上涉及有效用于調節核因子κB(NF-κB)活化和治療與NF-κB活化相關的疾病的組合物和方法。本發明具體地涉及調節磷酰化IκB(即，IκBα和/或IκBβ)遍在蛋白化的物質。該遍在蛋白化導致NF-κB的釋放和活化。
本發明部分基于對一種人E3遍在蛋白連接酶的鑒定和表征，該人E3遍在蛋白連接酶識別磷酰化的和與NF-κB相關的IκB。多肽(包括人E3遍在蛋白連接酶以及其一部分或其他變體)可用于調節NF-κB在體外和在患者中的活性。這樣的多肽可用于例如對可用于調節NF-κB活性的物質(如小分子)進行識別，以及用于治療與異常的NF-κB活化相關的疾病。人E3遍在蛋白連接酶多肽和多核苷酸在本發明中，已發現作為54kD蛋白遷移的人E3遍在蛋白連接酶與磷酰化IκBα(磷酰化IκBα在此也叫做pIκBα)結合，并增強其遍在蛋白化。在圖9和SEQ ID NO15中提供了編碼人E3遍在蛋白連接酶的多核苷酸的序列；在圖10和SEQ ID NO16中提供了全長人E3遍在蛋白連接酶的蛋白序列。在本發明中還發現，人E3遍在蛋白連接酶是F盒/WD蛋白家族的成員，該家族包括β-TrCP(Margottin et al.，Mol.Cell 1565-574，1998)和果蠅Slimb蛋白(參見Jiang and Struhl，Nature 391493-496，1998)。如下所具體描述，此家族的其他成員共同具有E3的某些特性，并可在使用E3的本發明方法中使用這樣的蛋白及其變體。
本發明所述人E3遍在蛋白連接酶包括天然的人E3遍在蛋白連接酶(在本文中也稱作“E3”)以及其一部分或其他變體。E3變體與天然E3可在序列上存在差別，該差別可以源自一個或多個氨基酸的替換、缺失、添加和/或插入，如本發明所述，只要所述變體能與本發明所述IκB多肽結合并增強其遍在蛋白化。優選E3變體包含在不超過20％、優選不超過15％、更優選不超過10％的SEQ ID NO16所示殘基上發生的氨基酸替換。變體進一步包括截短的多肽和含有附加氨基酸序列的多肽，這些附加氨基酸序列對所述多肽活性的影響極小。人E3遍在蛋白連接酶多肽可以具有任何長度，其條件是它保留所述特性。換言之，這樣的多肽可以是寡肽(即由相對較少的通過肽鍵連接的氨基酸殘基構成，例如具有8-10個殘基)、全長蛋白(或其變體)或具有中等大小的多肽(例如20、50、200或400個氨基酸殘基)。
某些變體包含保守替換。在“保守替換”中，是用一個氨基酸替換另一個具有相似性質的氨基酸，從而肽化學領域的技術人員可預測出多肽的二級結構和親水性實質上未改變。通常可基于殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性上的相似來進行氨基酸的替換。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的極性頭部基團(具有相似親水性值)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守性改變的其他氨基酸組包括(1)丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸；(2)半胱氨酸、絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸；(3)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；(4)賴氨酸、精氨酸、組氨酸；和(5)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸。變體也可(或作為一種選擇)包含非保守變化。也可(或作為一種選擇)通過例如對多肽的免疫原性、二級結構和親水性影響極小的氨基酸的刪除或添加來對變體進行修飾。
如上所述，某些E3多肽可在氨基和/或羧基末段含有附加的氨基酸序列。例如，可將E3序列偶聯到位于蛋白N末端的信號(或前導)序列上，該信號(或前導)序列以共翻譯方式或以翻譯后方式指導所述蛋白的轉移。也可(或作為一種選擇)將多肽偶聯到接頭或其他序列上，以易于進行多肽(如多組氨酸)的合成、純化和鑒定，或者用于增強多肽和固相載體的結合。例如，可將多肽連接到免疫球蛋白的Fc區。
使用本領域普通技術人員所公知的任何結合實驗，可容易地確定E3多肽與磷酰化IκB結合的能力。例如，可將IκBα/NF-κB復合物與固定的E3多肽一起溫育，并(例如在Western印跡中)使用抗IκBα的抗體評價IκBα的結合水平。在這樣的實驗中，E3多肽應可測地結合IκBα；優選相對于天然人E3，所述E3多肽的結合水平基本上沒有減少。換言之，相對于天然多肽，變體可測地結合磷酰化、復合化的IκBα的能力可以增強或不變，或者，相對于天然多肽，發生少于50％、優選少于20％的降低。很明顯，可在這些實驗中用其他合適的底物替換pIκBα/NF-κB復合物。
正如本發明所述，E3多肽增強磷酰化IκB遍在蛋白化的能力可通過以下步驟進行評估使多肽與IκBα/NF-κB復合物、ATPγS、遍在蛋白E1、遍在蛋白E2一起溫育，利用IκBα的特異性抗體通過Western印跡測定緩慢移動的IκBα-遍在蛋白偶聯物。通常，在這一實驗中，E3多肽應產生可測水平的遍在蛋白化；優選相對于由近似量的天然人E3產生的遍在蛋白化水平，上述遍在蛋白化的水平基本上沒有減少。
本發明還涉及包含了E3的一部分或其他變體的多肽，所述E3的一部分或其他變體保留了與磷酰化IκB結合的能力，但未保留增強IκB遍在蛋白化的能力。使用本發明提供的結合實驗和遍在蛋白化實驗可容易地識別該多肽，且通常可將其用于抑制IκB的遍在蛋白化。這樣的多肽包括缺失了F盒區域(即與遍在蛋白級聯物的一種或多種成分相互作用的蛋白區域)的多肽。通常可功能性地識別F盒區域(即，由F盒區域缺失所形成的蛋白導致在遍在蛋白機制中補充了合適的成分)，它通常是建立在F盒區域共有序列的基礎上(參見Patton et al.，Trends inGenet.14236-243，1998)。某些所述的多肽包含了SEQ ID NO16的氨基酸122-168的缺失。在某些實施方案中，E3的一部分可包含SEQ IDNO16所示序列的10-374個，優選50-250個連續氨基酸殘基。
本發明進一步提供編碼所述E3多肽的多核苷酸。本發明包括任何編碼本發明所述多肽、其一部分或變體的多核苷酸。這些多核苷酸可以是單鏈的(編碼或反義多核苷酸)或雙鏈的，可以是DNA分子(基因組DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。在本發明的多核苷酸中可以但不必須存在有附加的編碼或非編碼序列，可以但不必須將多核苷酸連接到其他分子和/或載體上。
可使用本領域普通技術人員熟知的各種雜交或擴增技術中的任一技術來分離編碼人E3或其一部分的天然DNA序列。在這些技術中，可基于本發明提供的E3序列來設計探針或引物，并可購買或合成這些探針或引物。可篩選來自任何合適組織的文庫。接著可利用熟知的技術使用已擴增的一部分或部分的cDNA分子從基因組DNA文庫或從cDNA文庫中分離全長基因。另外，可由多個PCR片段構建全長基因。本發明具體包括包含這些序列的一部分或全長多核苷酸、全長多核苷酸的其他部分以及與這些全長分子的全部或一部分互補的序列。此外，本發明具體涉及了來自其他物種的同源體，并通常如本發明所述制備這些同源體。
具有所述序列的多核苷酸變體與天然E3多核苷酸的區別在于一個或多個替換、缺失、插入和/或添加。優選的變體包含在不超過20％、優選在不超過10％的核苷酸位置上的核苷酸替換、缺失、插入和/或添加。某些變體基本上與天然基因或其部分同源或互補。這樣的多核苷酸變體能夠在中等嚴格的條件下雜交到天然存在的編碼E3蛋白的DNA序列(或互補序列)上。合適的中等嚴格的條件包括在由5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA組成的溶液(pH8.0)中預洗滌；在50-65℃下在5X SSC中雜交過夜；接著在65℃用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC中各洗滌兩次，每次20分鐘。這樣的雜交DNA序列也屬于本發明的范圍。
本發明的普通技術人員將意識到，作為遺傳密碼簡并的結果，編碼本發明所述多肽的核苷酸序列是許多的。這些多核苷酸中的一些與由任何天然基因構成的核苷酸的同源性極小。雖然如此，本發明仍具體包括由于密碼子使用的不同而變化的多核苷酸。
如上所述，本發明進一步提供反義多核苷酸和具有任何上述序列的部分。通常可利用任何本領域公知的方法制備這些多核苷酸，包括例如固相的氨基磷酸酯化學合成法。另外，也可通過DNA序列在體外或體內的轉錄來產生RNA分子，所述DNA序列被引入載體，使之位于合適的RNA聚合酶啟動子(例如T3、T7或SP6)的下游。如本文所述，也可將多核苷酸的某些部分用于制備被編碼的多肽。另外，多核苷酸的一部分也可作為探針(例如用于測定E3在樣品中的表達)，并可利用各種報告基團如放射性核素、熒光染料和酶標記此部分。這些部分的優選長度為至少10個核苷酸，更優選至少20個核苷酸。在某些優選的實施方案中，作為探針使用的部分包含E3基因特有的序列。也可將與編碼序列互補的序列(即反義多核苷酸)的一部分用作探針或用于調節基因的表達。也可將可被轉錄成反義RNA的DNA構建體引入細胞或組織中，以便產生反義RNA。
可以進一步修飾任何多核苷酸以增加體內穩定性。可能的修飾包括但不限于，在5’和/或3’末端添加側翼序列；在骨架中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶連接；和/或包括非傳統堿(如肌苷、queosine和wybutosine)以及乙酰基、甲基、硫代和其他修飾形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
可使用已知的重組DNA技術將本文所述的多核苷酸連接到各種其他核苷酸序列上。例如，可將多核苷酸克隆進多種克隆用載體中的任一種中，所述克隆用載體包括質粒、噬菌粒、λ噬菌體衍生物和裝配型質粒。特殊目的載體包括表達載體、復制載體、探針生成載體和測序載體。通常，載體將含有在至少一種生物體中起作用的DNA復制起始點、便利的限制性內切酶位點和一種或多種可選標志。也可存在附加的起始、終上和/或間插DNA序列，其例如方便易于表達的載體的構建。可購得或利用本領域熟知的方法從所述序列組裝得到合適的載體。在載體中可能存在的其它元件取決于所需用途，這些元件對于本領域普通技術人員是顯而易見的。
通常可以通過本領域熟知的方法將此處所述的載體轉染到合適的宿主細胞例如哺乳動物細胞中。這些方法包括磷酸鈣沉淀、電穿孔和顯微注射。
通常，可使用標準自動化合成技術來制備E3多肽，或者利用編碼目的多肽的重組DNA的表達來制備這些多肽。可使用引入氨基酸和/或氨基酸類似物的標準技術來合成肽。在合成過程中，可以根據需要，使用例如叔丁基二碳酸酯(t-butyldicarbonate，t-BOC)基團或芴基甲氧羰基(FMOC)來保護氨基酸和/或氨基酸類似物的活性基團。氨基酸和/或氨基酸類似物可以商業購得(例如，Sigma Chemical Co.；AdvancedChemtec)或通過本領域公知方法合成。肽可以使用固相方法來合成，其中肽被附著到樹脂上，例如4-methylbenzhydrylamine(MBHA)、4-(羥甲基)-苯乙酰氨基甲基-和4-(羥甲基)-苯氧甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)(Wang樹脂)等樹脂上(所有這些均可商業購得)；或附著到對硝基苯基苯甲酮肟聚合物上(肟樹脂)，其可如De Grado和Kaiser所述(J.Org.Chem.473258，1982)進行合成。本領域的技術人員將意識到氨基酸和/或氨基酸類似物的選擇將部分取決于所需的特定物理、化學或生物學特性。可通過給藥方法和患者體內的靶位點來部分地確定這些特性。
肽反應基團的選擇性修飾還可以產生有利的特性。可以在肽仍附著于樹脂上的同時對它進行處理，以獲得N端修飾的化合物如乙酰化的肽，或使用氟化氫或等價的切割劑將肽從樹脂上切下，然后對其修飾。可在從樹脂上切下之后或有時在溶液相合成之前，對合成的含有C端羧基的化合物(Wang樹脂)進行修飾。肽的N端或C端修飾方法是本領域所熟知的，包括例如N端的乙酰化或C端的酰胺化。類似地，氨基酸或氨基酸類似物側鏈的修飾方法是肽合成領域技術人員所熟知的。對肽反應基團的修飾的選擇取決于所需特性。
E3多肽也可以是環肽。可以通過在例如肽的N端的氨基基團與C端的羧基基團之間誘導共價鍵的形成來獲得環肽。也可以通過在末端反應基團與反應性氨基酸側鏈之間或在兩個反應側鏈之間形成共價鍵來獲得環肽。根據所需特性選擇環肽對于本領域技術人員來說是顯而易見的。例如，環肽可以在體內使穩定性增加、溶解性增加、免疫原性降低或者清除率降低。
可使用例如反相高效液相色譜(RP-HPLC)的方法或其他基于大小或電荷的分離方法來純化新合成的肽。而且，可使用這些方法或其他已知方法來表征經純化的肽，其他已知方法例如有氨基酸分析和質譜分析法。
另外，也可使用熟知的技術由目標多肽的編碼核酸來制備多肽。可使用分離的cDNA來制備內源性蛋白。為制備變體多肽，可使用標準誘變技術，例如寡核苷酸定向的位點特異性誘變，并可除去DNA序列的片段以制備截短的多肽。
通常，可將任一種本領域普通技術人員公知的表達載體用于表達本發明的重組多肽。表達可在任何適宜的被表達載體轉化或轉染的宿主細胞中完成，其中所述表達載體含有編碼重組多肽的DNA序列。合適的宿主細胞包括原核生物、酵母、桿狀病毒感染的昆蟲細胞和動物細胞。在表達后，可首先使用商業可得的濾膜來濃縮來自宿主/載體系統的上清液，所述宿主/載體系統將蛋白或多肽分泌到培養基中。在濃縮后，可將濃縮液施用到合適的純化基質中，純化基質例如為親合性基質或離子交換樹脂。可使用一步或多步反相HPLC，以進一步純化重組多肽。
通常，本文所述多肽和多核苷酸是分離的。“分離的”多肽或多核苷酸是被從其原始環境中取出的。例如，如果將天然形成的蛋白從自然體系的一些或全部共存物質中分離出來，則所獲得的天然形成的蛋白是分離的。優選將本發明提供的多肽分離到純度為至少80％(按重量計)，更優選分離到純度為至少95％(按重量計)，最優選分離到純度為至少99％(按重量計)。通常，可使用例如標準技術硫酸銨分級分離、SDS-PAGE電泳和親合層析來完成該純化。如果例如將多核苷酸克隆到并非自然環境一部分的載體中，則認為該多核苷酸是分離的。抗體本發明進一步提供與E3多肽特異性結合的抗體和其抗原結合片段。如果本文使用的抗體或抗原結合片段(例如在ELISA中)以可測水平與多肽反應且不與無關蛋白發生可測的反應，則稱這些抗體或抗原結合片段與多肽“特異性結合”。抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。優選的抗體是在本發明所述遍在蛋白化實驗中抑制或阻斷E3活性的抗體。其他所選的抗體(其可用于例如免疫激酶實驗中)是免疫沉淀活性E3的抗體，所述活性E3使用任何標準實驗(例如本發明提供的實驗)進行檢測。
可通過本領域普通技術人員公知的各種技術制備抗體(參見，例如Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)。在一種這樣的技術中，一開始將包含多肽的免疫原注射到合適的動物體內(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊)，優選按照預定的包括了一次或多次加強免疫的時間表進行注射，對動物定期取血。接著，通過例如親合層析并使用偶聯到合適固相載體上的多肽，從這些血清中純化出多肽的特異性多克隆抗體。
單克隆抗體的制備例如可使用Kohler和Milstein的技術(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)及其改進方法。簡言之，這些方法包括制備能產生具有所需特異性(即，與目的多肽的反應性)的抗體的無限增殖細胞系。這些細胞系可從例如上述免疫的動物脾細胞中得到。接著，通過例如和骨髓瘤細胞融合，優選和與免疫動物同系的骨髓瘤細胞融合，來無限增殖該脾細胞。例如，脾細胞和骨髓瘤細胞可與非離子型去垢劑結合數分鐘，然后以低密度接種到選擇性培養基中，該培養基支持雜交細胞的生長，而不支持骨髓瘤細胞的生長。優選的選擇技術使用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)選擇。充足的時間通常約為1-2周。在這之后，觀察到雜交細胞群落。可選擇出單一的群落并檢測其針對多肽的結合活性。優選具有高反應性和特異性的雜交瘤。
單克隆抗體可從生長中的雜交瘤克隆的上清液中分離。另外，可使用多種技術來提高產量，例如將雜交瘤細胞注射入合適的脊椎動物宿主如小鼠的腹膜腔中。然后，可從腹水或血液中收獲多克隆抗體。可利用常規技術將雜質從抗體中去除，所述常規技術例如為層析、凝膠過濾、沉淀和提取。
在某些實施方案中，優選使用抗體的抗原結合片段。這些片段包括Fab片段，其可使用標準技術制得。簡言之，可通過A蛋白珠柱的親合層析將免疫球蛋白從兔血清中提純(Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白以得到Fab和Fc片段。Fab和Fc片段可通過例如A蛋白珠柱上的親合層析得以分離。遍在蛋白化實驗如上所述，E3多肽調節磷酰化IκB遍在蛋白化的能力可通過以下途徑得以評估將多肽與IκBα/NF-κB復合物(或其他合適的底物)、ATPγS、遍在蛋白E1、遍在蛋白E2一起溫育，并通過例如Western印跡使用IκBα的特異性抗體來檢測IκBα-遍在蛋白偶聯物。用于此處所述遍在蛋白化實驗的IκB多肽可以是天然人IκBα(SEQ ID NO1)或IκBβ(SEQ ID NO3)，或者可以是天然蛋白的變體。通常對IκB的多肽變體進行修飾，以便使該變體在此處所述遍在蛋白化實驗中被磷酰化和遍在蛋白化的能力基本上沒有降低。可標記IκB多肽。例如，使用標準技術，通過在體外多肽在35S-蛋氨酸存在下的翻譯，可將35S引入IκB多肽。
通常，可使用體外系統如麥芽提取物，通過DNA在培養的宿主細胞中的表達或通過翻譯，從編碼該多肽的DNA制備IκB多肽。如果使用宿主細胞，該細胞優選是細菌、酵母、桿狀病毒感染的昆蟲細胞或哺乳動物細胞。使用本領域普通技術人員熟知的技術，可將重組DNA克隆進任何適合在所述宿主細胞中使用的表達載體中。通常可按照制造商的指示，進行多肽的體外翻譯。
在體外翻譯后，無需純化即可使用表達的IκB多肽。多肽也可以是以基本上純的形式分離的。可將IκB多肽分離到純度為至少80％(按重量計)，更優選分離到純度為至少95％(按重量計)，最優選分離到純度為至少99％(按重量計)。通常，可使用例如本文所述的典型純化方法或者硫酸銨分級分離、SDS-PAGE電泳和親合層析的標準技術來完成該純化。
某些遍在蛋白化實驗可使用細胞E3去表征E3活性的調節劑。在這些實驗中，可在體外將來自受激或未受激Jurket、HeLa、THP-1或內皮細胞的細胞提取物與IκB多肽一起在ATP和磷酸酶抑制劑岡田軟海綿酸的存在下溫育。通常可按照Alkalay等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210599，1995)制備細胞提取物。溫育的條件應足以導致IκB多肽(在IκBα及其變體的絲氨酸32和36上)的磷酰化以及磷酰化多肽(pIκB)與細胞衍生的NF-κB復合物之間的結合。例如，IκB多肽可與HeLa或Jurket的細胞提取物、ATP和岡田軟海綿酸一起溫育。在30℃下溫育90分鐘已足以使IκB多肽磷酰化。在此溫育之后，可如Alkalay等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210599，1995)，用例如抗p65的抗體免疫純化pIκB/NF-κB復合物，并在無細胞系統中進行pIκB/NF-κB復合物的體外遍在蛋白化。接著，可先使用熟知的SDS-PAGE技術并隨后使用放射自顯影技術，來評定遍在蛋白化水平。
在這些條件下，野生型35S-pIκBα多肽在ATPγS的存在下產生多個遍在蛋白化的類別(參見圖1A，泳道4)。35S標記的IκBαS32/36A突變體(泳道1)和未磷酰化的野生型35S-IκBα(泳道2)均不能發生遍在蛋白化。然而，突變體或野生型IκBα的游離形式易于發生偶聯(圖1B)。與之相似，可使游離的(而不是與復合物結合)IκBα第21、22位賴氨酸突變體在體外遍在蛋白化。因此，不同于使用游離IκB多肽進行的遍在蛋白化實驗，此處提供的遍在蛋白化實驗只靶向與復合物結合的且已適當磷酰化的IκB多肽。
上述遍在蛋白化實驗可用于識別調節IκB遍在蛋白化的物質。調節劑可包括抗體(例如單克隆抗體)、肽、小分子(例如來自組合文庫)和其他刺激或優選抑制IκBα和/或IκBβ多肽遍在蛋白化的藥物。通常，可通過將候選調節劑包括在遍在蛋白化反應中并評價它對遍在蛋白化水平的影響，來識別所述的調節劑，所述遍在蛋白化的反應可如上所述另外進行。候選物質用于這一實驗的合適濃度為約0.1μM-約1mM。對于肽候選物質，可加入肽酶抑制劑，例如苯丁抑制素(40μg/ml)，優選的肽量為約10μM-約1mM。對遍在蛋白化水平產生統計學上有意義的影響的候選物質包括在本發明的調節劑范圍之內。
可通過將物質(例如約5mg/ml的肽物質)顯微注射到合適的細胞(例如HeLa細胞或初級人血管內皮細胞)中，進一步評價該物質。在顯微注射之后，可(例如用TNFα)刺激細胞，并溫育細胞以使NF-κB活化。在HeLa細胞中，TNFα誘發NF-κB快速核易位至細胞核中，這可用p65的特異性抗體通過染色進行檢測。調節劑引起NF-κB易位的統計學上有意義的降低，并可將此易位降低至不可測的水平。
通過受NF-κB調控的粘附蛋白在表面上的表達，初級人血管內皮細胞(HUVEC)對TNFα刺激產生響應，所述粘附蛋白例如為ICAM-1、V-CAM-1和E-選擇蛋白(Read et al.，Immunity 2493，1995；Chen et al.，J.Immunol.1553538，1995)。E-選擇蛋白特別是NF-κB依賴性的，它是主要可誘導的內皮粘附分子，最初貼附于嗜中性粒細胞上并在活化了的內皮上滾動。受激細胞可被固定并染色，以檢測一種或多種受NF-κB調控的粘附蛋白的表達。多肽或其他調節劑的顯微注射對該表達產生統計學上有意義的抑制，但不影響NF-κB非依賴型粘附蛋白如ICAM2的表達。治療應用如上所述，本文所述的某些E3多肽、多核苷酸、抗體和其他物質通常可用作調節劑以特異性地抑制或增強細胞NF-κB的功能。調節劑也可用于調節患者體內IκBα和/或IκBβ的遍在蛋白化，由此在體內調節NF-κB的細胞功能。此處使用的“患者”可以是包括人在內的任何哺乳動物，其可以患有與NF-κB活化相關的疾病，或者未患有可測的疾病。因此，治療可以是針對現有疾病的或者是預防性的。與NF-κB活化相關的疾病包括但不限于，炎癥、自身免疫性疾病、癌癥和病毒感染。
治療是指本文所述調節劑的給藥。為給藥至患者，通常將一種或多種所述化合物配制成藥物組合物。藥物組合物可以是無菌的水溶液或非水溶液、混懸液或者乳劑，其另外還包含生理上可接受的載體(即不干擾活性成分的活性的無毒材料)。可將本領域普通技術人員所公知的任何合適的載體用于本發明的藥物組合物中。典型載體包括生理鹽水、明膠、水、醇類、天然或合成的油、糖溶液、乙二醇、注射用有機酯如油酸乙酯或者這些材料的組合。可任選地，藥物組合物另外還可含有防腐劑和/或其他添加劑和/或其他活性成分，所述添加劑例如有抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和/或惰性氣體。
此外，藥物組合物還可包含與生理上可接受的載體相結合的編碼調節劑的多核苷酸(從而使調節劑在原位生成)。在該藥物組合物中，多核苷酸可存在于本領域普通技術人員公知的各種傳遞系統(包括核酸、細菌和病毒表達系統)和膠體分散系統(包括脂質體)中的任何一種系統中。適宜的核酸表達系統包含了對在患者體內表達所必需的多核苷酸序列(例如合適的啟動子和終止信號)。正如例如Ulmer等人所述，DNA也可以是“裸露的”(Science 2591745-1749，1993)。
可用來將核酸序列導入目標患者細胞中的多種病毒載體包括，但不限于，牛痘或其他痘病毒、皰疹病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。將DNA導入這些載體的技術是本領域普通技術人員所熟知的。優選逆轉錄病毒載體是鼠類或鳥類逆轉錄病毒的衍生物，包括但不限于莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMuLV)、哈維鼠類肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠類乳腺瘤病毒(MuMTV)和勞斯肉瘤病毒(RSV)。逆轉錄病毒載體可另外轉移或摻入作為可選標志的基因(以有助于被轉導細胞的識別或選擇)和/或一特定靶細胞上受體的配體的編碼基因(以使載體具有靶特異性)。例如，可通過插入編碼糖、糖脂或蛋白的核苷酸序列，使逆轉錄病毒載體是靶特異的。也可使用抗體經本領域普通技術人員公知的方法來完成靶向。
病毒載體一般是非病原性的(缺陷性的)可復制病毒，它們需要幫助以產生傳染性的載體顆粒。例如，可通過使用含有質粒的輔助細胞系來提供此幫助，所述質粒在LTR中的調控序列的控制下編碼逆轉錄病毒的所有結構基因，但這些質粒不含能使裝配機構識別出用于包裝的RNA轉錄物的核酸序列。這樣的輔助細胞系包括(但不限于)ψ2、PA317和PA12。可對引入所述細胞的逆轉錄病毒載體進行裝配，產生載體病毒體。接著，可將用此方法產生的載體病毒體用于感染組織細胞系如NIH 3T3細胞，以產生大量嵌合的逆轉錄病毒體。
另一針對多核苷酸的靶向傳遞系統是膠體分散系統。膠體分散系統包括高分子復合物、毫微囊、微球體、珠和基于類脂的系統，基于類脂的系統包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質體。在體外和體內用作傳遞工具的優選膠體系統是脂質體(即人工膜囊泡)。業已顯示，大小為0.2-4.0μm的單層大囊泡(LUV)可封裝絕大部分的含有高分子的緩沖水溶液。可將RNA、DNA和完整的病毒體封裝在含水的內部，并將它們以生物活性形式傳遞到細胞中(Fraley，et al.，Trends Biochem.Sci.677，1981)。除了哺乳動物細胞之外，脂質體還可用于將多核苷酸傳遞到植物、酵母和細菌的細胞中。為使脂質體成為有效的基因轉移工具，以下特征必須存在(1)對目的基因進行高效封裝而同時不危及其生物活性；(2)與非靶細胞相比，優先且主要與靶細胞結合；(3)高效地將囊泡的含水內容物傳遞到靶細胞的胞質中；和(4)準確并有效地表達遺傳信息(Mannino，et al.，Biotechniques 6882，1988)。
脂質體的尋靶可基于解剖學和機械因素進行分類。解剖學分類建立在選擇性的基礎上，其可以是例如器官特異的、細胞特異的和/或細胞器特異的。機械尋靶可基于其是被動還是主動來進行區分。被動尋靶利用了脂質體傾向于分布到器官的網狀內皮系統(RES)細胞中的自然傾向，其中所述的器官含有竇狀毛細血管。在另一方面，主動尋靶涉及通過將脂質體偶聯到特異性配體上導致的脂質體變化，或通過改變脂質體組成或大小導致的脂質體變化，所述特異性配體例如為單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白，所述改變脂質體組成或大小是為了實現向器官和細胞類型尋靶，而不靶向天然形成的局部位點。
給藥的途徑、頻率和劑量隨患者的不同而不同。通常，藥物組合物可經靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、腔內或透皮給藥。每天可給藥1至6次。合適的劑量應足以改善患與NF-κB活化相關的疾病患者的癥狀。這樣的改善可通過監測炎性反應(例如水腫、移植排斥、超敏性)或通過與所述疾病相關的臨床癥狀的改善來得以檢測。通常，存在于一劑中的調節劑或由一劑中的由DNA原位產生的調節劑的量為約1μg-約100mg/kg宿主。合適的劑量大小隨患者的大小而變，但一般為約10mL-500mL/10-60kg動物。
提供以下實施例作為說明而非限制。實施例實施例1使用遍在蛋白化實驗鑒定IκB E3識別基元本實施例說明一典型遍在蛋白化實驗以及該實驗在評價肽抑制IκB遍在蛋白化的能力上的應用A.體外遍在蛋白化實驗按照制造商的指示(Promega，Madison，WI)，在麥芽提取物中，在35S-蛋氨酸的存在下，在體外翻譯以HA示蹤的IκBα或以HA示蹤的IκBβ cDNA(Haskill et al.，Cell 651281-1289，1991)。為了磷酰化IκBα或IκBβ，1μl含有標記蛋白的提取物在終體積為30μl的反應混合物中在30℃溫育90分鐘，所述反應混合物為100μg HeLa或Jurkat細胞提取物(如Alkalay et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210599，1995所述進行制備)、2mM ATP和1μM岡田軟海綿酸。在此溫育過程中，標記的IκB多肽在絲氨酸32和36上發生磷酰化，并與內源性NF-κB復合物結合(數據未列出)。
在溫育后，加入1μl抗p65的血清，將NF-κB免疫復合物固定到蛋白A-瓊脂糖凝膠上并在如Alkalay等人所述的HeLa細胞提取物中進行體外遍在蛋白化。已遍在蛋白化的蛋白通過SDS-PAGE得以分離，并通過放射自顯影得以顯影。
如圖1A所示，只有野生型35S-pIκBα多肽生成多個遍在蛋白化的類別(泳道4)。35S標記的IκBα S32/36A突變體(泳道1)和未磷酰化的野生型35S-IκBα(泳道2)均不能發生遍在蛋白化，在ATP不存在的條件下未觀察到pIκBα的遍在蛋白化(泳道3)。
通過比較游離的35S-IκB的遍在蛋白化和復合物結合型磷酰化底物的體外遍在蛋白化，進一步證明本實驗的生理關聯性。依據復合物結合型S32/36A突變體在體內的命運，它不能與遍在蛋白偶聯，而突變體或野生型IκBα的游離形式易于發生偶聯(圖1B)。與之相似，只有游離的而非與復合物結合的IκBα第21、22位賴氨酸突變體可在體外遍在蛋白化(數據未列出)。因此，當以無差別形式通過遍在蛋白系統識別游離的IκBα時，與復合物結合的抑制劑被遮蔽了，除非它經過適當地磷酰化。B.鑒定IκBα-遍在蛋白連接酶識別基元為了鑒定IκBα-遍在蛋白連接酶識別基元，在肽酶抑制劑苯丁抑制素(40μg/ml)的存在下，將多種肽以不同濃度加入反應混合物中。這些肽橫跨蛋白的N端信號域，它們在一個或兩個絲氨酸殘基(第32和36位)上發生磷酰化，或者它們是未經修飾的或絲氨酸被替換的。將這些肽以不同濃度包括在遍在蛋白化反應中，并測試其對pIκBα特異性遍在蛋白化的抑制。當監測到游離IκBα的偶聯時，直接將經翻譯的蛋白加入偶聯反應混合物中。
只有在絲氨酸32和36上均發生磷酰化的肽(pIκBα肽)才能有效地抑制pIκBα的遍在蛋白化(圖1A，泳道7、11-14)。在濃度為400μM時，c-Fos磷酸肽(ppFos，泳道5)、第32、36位絲氨酸替換為丙氨酸的IκBα肽(p21 S/A，泳道6)和未磷酰化的肽(p21，泳道8)不對pIκB的遍在蛋白化產生可測的影響。計算磷酰化IκBα肽的IC50，典型抑制濃度示于圖1A。二磷酰化的IκBα肽抑制pIκB的偶聯反應(泳道7、11-14)，其IC50為5μM。在上面的表1和SEQ ID NO5-9中提供了這些肽的序列。相反，單磷酰化的肽(泳道9、10)抑制pIκBα的偶聯反應，其IC50為400μM。測試的最小肽(pp7，泳道14)僅橫跨信號磷酰化位點，它足以有效地抑制遍在蛋白化，盡管其IC50較高(10μM)。因此，包含SEQ ID NO1中的殘基21-41的肽包含了針對E3遍在蛋白連接酶的識別域。有趣的是，第21和22位的賴氨酸對于抑制并非是必需的，這意味遍在蛋白系統的識別位點與實際的偶聯位點是不同的。
在兩個其他的遍在蛋白偶聯反應中測試肽的特異性，所述兩個偶聯反應為游離野生型(圖1B，泳道1-3)或S32/36A突變IκBα(圖1B，泳道4-6)的偶聯，以及遍在蛋白與HeLa提取物中的大量細胞蛋白間的偶聯(按照Alkalay等人所述，用125I標記的遍在蛋白檢測，圖1C)。IκBα-遍在蛋白連接酶識別基元或對照肽的加入不影響這兩個反應。
已發現，包含IκBα-遍在蛋白連接酶識別基元的肽使與pIκBα相關的底物pIκBβ不能遍在蛋白化(圖1D)。與pIκBα的偶聯相似，IκBβ的特異性偶聯也要求有結合的NF-κB復合物存在(未顯示)，并在與IκBα同源的殘基第19和23位絲氨酸上已經發生了磷酰化。在磷酸酶抑制劑不存在的條件下制備的IκBβ底物不發生遍在蛋白化(圖1D，泳道1)。肽影響pIκBβ的遍在蛋白化，其IC50類似于在pIκBα情況中觀察到的IC50(圖1D，泳道4-7)。因此，這顯示相同的酶靶向兩種IκB，以進行遍在蛋白依賴型降解。
在互補的遍在蛋白依賴型體外降解實驗中測試抑制性pIκBα肽(Orian et al.，J.Biol.Chem.27021707，1995；Stancovski et al.，Mol.Cell.Biol.157106，1995)。使用該實驗，只有受激細胞產生的pIκBα以依賴于遍在蛋白的方式發生體外降解，而來自相同細胞提取物的未磷酰化的IκBα不發生降解。將抑制偶聯的磷酸肽引入降解實驗，這導致pIκBα底物的穩定(圖2，泳道3、4)，而未磷酰化的肽物質或磷酸-Fos肽對照不影響特異的pIκBα降解(泳道5、6)。所述肽在賴氨酸21/22上的修整不降低降解抑制作用(泳道4)，這說明所述肽不會通過消耗作為可偶聯的底物的遍在蛋白-蛋白體系統來廢止pIκBα的降解。實施例2鑒定參與底物識別的遍在蛋白系統成分本實施例說明對負責pIκB多肽識別的特定E3的鑒定。
pIκBα-遍在蛋白偶聯和降解需要全套遍在蛋白系統酶E1、源自遍在蛋白系統級分I的特定E2、E2F1(Alkalay et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210599，1995；Chen et al.，Cell 84853，1996)和級分II-成分E3。為了鑒定參與底物識別的遍在蛋白系統成分，將HeLa溶胞產物經IκBα磷酸肽柱分級分離，分析流通級分以用于pIκBα偶聯。按照制造商的指示，將肽以2mg/ml的濃度連接到NHS-瓊脂糖凝膠(Pharmacia)上。在0.1％NP40和3％卵清蛋白的存在下，100μg HeLa提取物與2.5μl偶聯樹脂在4℃一起溫育1小時。棄去樹脂，在上述遍在蛋白化實驗中測試未結合的物質。
從對照磷酸肽柱和S32/36A肽柱得到的流通級分保留了全部IκBα偶聯能力(圖3A，泳道2、3)，而從兩個不同pIκBα肽得到的流通級分失去了它們的IκBα特異性偶聯能力(泳道4、7)。消耗的偶聯活性可由網狀細胞級分II進行補充(泳道5、8)，該級分含有E3酶的所有已知類別(Ciechanover，Cell 7913，1994)。補充不能通過加入級分I或者級分I和E1獲得(分別為泳道6和9)，這表明肽柱消耗E3，而不消耗E2或E1。此外，IκBα的第21和22位賴氨酸殘基對于保留E3不是必要的(比較圖3A，泳道7至泳道4)，這強調在底物識別位點和偶聯位點的不同。當所有流通級分在隨機HeLa蛋白偶聯中維持全部活性時，肽柱消耗被發現是對IκBE3特異的(通過檢查125I遍在蛋白的偶聯來進行檢測，圖3B)。這表明特定E3負責在識別基元處識別pIκB。實施例3典型肽對細胞NF-κB活化的影響本實施例說明，通過顯微注射包含IκBα-遍在蛋白連接酶識別基元的肽，抑制細胞NF-κB活化。
在顯微注射前，將HeLa細胞植在方格蓋玻片(Cellocate，Eppendorf)上18小時。使用半自動器械(Eppendorf)，用22個氨基酸的pIκBα肽(pp21；表1和SEQ ID NO9)或對照磷酸-Fos肽(SEQ ID NO10)進行顯微注射。將在100mM KCl、5mM Na2HPO4(pH7.2)中濃度為5mg/ml的肽注射入細胞質中，然后立即用TNFα(200單位/mL)活化20分鐘(用于NF-κB易位)或3小時(用于E選擇蛋白的表達)。在活化后，將細胞固定，并用p65的特異性抗體(Mercurio et al.，Genes & Dev.7705，1993；Santa Cruz)或抗E選擇蛋白的單克隆抗體(R&D Systems)將細胞染色。
正如90％細胞的p65核染色所示，當肽不存在時，TNFα引發NF-κB快速核易位至細胞核中(參見圖4G，第2列)。在一些試驗中，pp21肽廢止了TNFα刺激的NF-κB活化(參見圖4A和4B中的典型區域；和圖4G，第3列)。相反，與未顯微注射的細胞相比，對照pp-Fos肽不影響NF-κB誘導核易位的速率(圖4C和4G，第4列)。
為了進一步評估NF-κB抑制的功能性結果，將IκB-E3抑制性肽顯微注射到初級人血管內皮細胞中(HUVEC；Chen et al.，J.Immunol1553538，1995)。通過由NF-κB調控的粘附蛋白(例如E選擇蛋白)在表面的表達，這些細胞對TNFα產生響應。如上所述培植、顯微注射和刺激HUVEC細胞。在刺激后3小時，細胞被固定并染色，以標明NF-κB依賴型E選擇蛋白的表達。在一些試驗中，在TNFα刺激后，75％-85％的HUVEC細胞由于E選擇蛋白而深度染色。顯微注射pp21肽導致在70％-80％顯微注射的細胞中E選擇蛋白的表達受到抑制(圖4D；和圖4H，第3列)。相反，與未經顯微注射的細胞相比，對照pp-Fos肽不影響E選擇蛋白的表達(圖4F和圖4H，第4列)。對照S32/36A替換的IκBα肽的顯微注射不影響E選擇蛋白表達的速率。
這些結果證明，由信號誘導而磷酰化的IκBα和IκBβ的亞基特異性降解由特定E3介導。針對E3遍在蛋白連接酶的識別域是一短序列，其以兩個由信號得到的磷酸絲氨酸為中心，這代表第一個生物學上有關的E3識別基元，在兩種IκB中所述的磷酸絲氨酸是保守的。IκB識別的特異性由描述磷酰化底物的上下文所支持結合的細胞復合物使底物與非特異性E3隔絕。該特征將NF-κB抑制劑的降解限制于刺激后的階段，此時它通過位點特異性磷酰化與特異的連接酶相接觸。使用本發明提供的調節劑，通過在體內抑制IκB連接酶，可廢止NF-κB的活化和其產生的作用。實施例4進一步表征IκBα的遍在蛋白化本實施例進一步說明與IκBα遍在蛋白化相關的遍在蛋白連接酶的特征A.細胞因子刺激促進pIκBα和特異性遍在蛋白-連接酶之間的結合為了進一步研究由磷酰化IκBα-復合物引起的遍在蛋白結構成分的補充，從蛋白體抑制的、TNF-α刺激的HeLa細胞中純化出pIκBα/NF-κB復合物，并評價其遍在蛋白化能力。HeLa細胞與蛋白體抑制劑ALLN(150μM)預溫育1小時，用TNF-α刺激10分鐘。IκBα/NF-κB復合物用山羊抗Rel A(p65)的抗體(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)和同源p65肽(ELFPLIFPAEPAQASGP(SEQ ID NO21)，其是合成的并購自Alfa-Diagnostic，Inc.，而后其經HPLC純化，經質譜分析，證明了預計的結構并證實純度超過85％)進行免疫親合純化。
向經免疫純化的級分中添加遍在蛋白系統的多種成分，并進行體外遍在蛋白化。具體地講，所述級分中添加有0.2μg純化的E1和0.1μg純化的重組UBC5C(Jensen et al.，J.Biol.Chem.27030408-30414，1995)，并在反應緩沖液中在37℃溫育90分鐘，所述反應緩沖液含有50mM Tris(pH7.6)、2mM MgCl2、1mM DTT、20nM岡田軟海綿酸、1mg/ml牛遍在蛋白(Sigma)和5mM ATPγS(Sigma)。反應混合物接著在SDS-緩沖液中加熱至沸，樣品通過SDS-PAGE(8.5％)和磷酸成像進行分析。
業已發現，遍在蛋白、純化的E1和特定E2、UBC5C的加入足以產生全容量IκBα-遍在蛋白偶聯活性(圖5，第2列)，這在與IκBα特異性抗血清反應的大分子物質的積聚中十分明顯。該活性是依賴于E1的(比較泳道1和2)，來自未受激HeLa細胞的相應的免疫純化級分不能提供該活性(比較泳道4、5、6)。當受激HeLa的級分同時含有磷酰化和未磷酰化的IκBα時，觀察到的偶聯物可以源自兩種IκB中的任一種。
為了確定IκBα-偶聯物的來源，在pIκBα肽(pp12；CDRHDS[PO3]GLDS[PO3]；SEQ ID NO22)(泳道7)或絲氨酸/谷氨酸替換的IκBα肽(p12S/E)(泳道8)的存在下進行遍在蛋白化反應。兩種肽均是合成的并購自Alfa-Diagnostic，Inc.，而后其經HPLC純化，經質譜分析，證明了預計的結構并證實純度超過85％。在肽酶抑制劑苯丁抑制素(40μg/ml)的存在下，將IκBα肽以指定濃度加入反應混合物中。只有pp12使多遍在蛋白-IκBα偶聯物不能形成，這表明遍在蛋白化對pIκBα是特異的(Yaron et al.，EMBO J.166486-6494，1997)。B.磷酰化對于補充特異性遍在蛋白-連接酶活性是必要且充分的E1和E2特異性地補充受激HeLa級分的pIκBα-偶聯物，但不補充未受激級分，這一發現可有若干解釋a)HeLa刺激活化了特異性pIκB-遍在蛋白連接酶；b)HeLa刺激修飾了底物，由此使它易于遍在蛋白化；或c)HeLa刺激對于修飾底物和連接酶均是必要的。為了區分這幾種可能，使用重組的、組成活化的IKK2蛋白(IKK2-EE)(Mercurioet al.，Science 278860-66，1997)。類似于TNFα激活IKK-復合物，該蛋白在絲氨酸32/36上磷酰化IκBα。
先使未受激HeLa的溶胞產物與重組的35S標記的IκBα一起溫育，再將來自未受激HeLa溶胞產物的35S標記的IκBα/NF-κB復合物免疫沉淀，之后，復合物用重組IKK2-EE磷酰化、用p65同源肽洗脫并進行體外遍在蛋白化。在與IKK2-EE溫育后，幾乎所有的35S-IκB都發生磷酰化。而遍在蛋白、E1和UBC5C的加入并不能導致pIκBα的磷酰化(圖6，泳道2)。因此，由IKK引起的IκB磷酰化不足以促進其在E1和E2存在下的遍在蛋白化。可以想象，pIκBα遍在蛋白化需要附加的HeLa溶胞產物成分，該成分沒有從未受激細胞中共免疫純化。
為證明這一假說，或直接地或在IKK2-EE磷酰化后，將免疫結合的IκBα/NF-κB復合物與未受激HeLa的溶胞產物一起溫育，用高鹽緩沖液徹底洗滌，并用p65肽洗脫。事實上，HeLa溶胞產物與磷酰化IκB復合物(圖6，泳道3)而不是與未磷酰化的IκB復合物(泳道1)的溫育提供了pIκBα偶聯所需的pIκB-連接酶成分。當把E1或E2從反應中略去時，沒有得到任何信號，這證明凝膠上方的信號代表多個遍在蛋白IκBα-偶聯物(泳道5、6)。在提供必要的連接酶成分方面，受TNFα刺激的HeLa的溶胞產物不比未受激的溶胞產物優越。
pp12對pIκBα遍在蛋白化的抑制作用(圖5)暗示，在溫育過程中基本HeLa成分特異并穩定地與pIκBα識別基元結合，之后，這些基本成分在pIκB-遍在蛋白偶聯中發揮作用。為了測試這一設想，將pp12或對照肽p12S/E包括在溫育過程中，在洗脫級分前，可將這些肽與HeLa溶胞產物一同除去。pp12(圖6，泳道4)而不是p12S/E(泳道5)的加入廢止了與pIκB-復合物相關的遍在蛋白-連接酶活性，同時保持了底物的完整。這對于肽處理級分在網狀細胞級分II的存在下發生遍在蛋白化的能力是明顯的，所述網狀細胞級分II是E3源。可從此試驗中得出若干結論1)pIκBα遍在蛋白化所必須的遍在蛋白-連接酶成分由IκBα/NF-κB復合物在IKK磷酰化后從HeLa溶胞產物中補充。
2)此促進偶聯的成分含在未受激的HeLa溶胞產物中，這表明不需要通過TNF刺激來活化遍在蛋白-連接酶。
3)基本連接酶成分顯然是特異的，該成分通過與pIκB識別基元的直接作用來與IκB結合(通過pp12對pIκBα-偶聯物的抑制來證實)。C.分離識別pIκBα的特異性遍在蛋白-連接酶成分
HeLa提取物(250mg)與250μl抗p65的免疫珠一起溫育。在A緩沖液(1M KCl、0.5％NP40、50mM pH7.6的Tris緩沖液、1mM DTT)中洗滌四次，在B緩沖液(50mM pH 7.6的Tris緩沖液、1mM DTT)中洗滌一次。然后，這些珠中的一半用IKK進行體外磷酰化，另一半進行模擬磷酰化。珠在A緩沖液中洗滌兩次，在B緩沖液中洗滌一次。它們與100mg HeLa提取物在1μm岡田軟海綿酸存在下于25℃攪拌30分鐘，在A緩沖液中洗滌四次，在B緩沖液中洗滌一次，用1mg/ml p65肽洗脫。使用10mg35S代謝標記的HeLa溶胞產物(100μCi/ml蛋氨酸/半胱氨酸，8小時)和25μl p65-免疫珠進行相似的試驗。源自熱和冷溶胞產物的洗脫物-級分相互混合，在SDS-樣品緩沖液中加熱至沸，并通過7.5％SDS-PAGE和放射自顯影進行分析。將與放射自顯影信號對應的凝膠片切下，并如下所述通過質譜測定其蛋白帶的序列。
通過SDS-PAGE分析，比較三個經免疫親合純化的級分(圖7A)1)一個含有IκBα/NF-κB復合物的級分，該級分未經IKK2-EE磷酰化，但與HeLa溶胞產物一起溫育；2)一個經IKK2-EE磷酰化且隨后與HeLa溶胞產物一起溫育的級分；3)一個經IKK2-EE磷酰化但未與HeLa溶胞產物一起溫育的級分。所有溫育均在由免疫珠固定的復合物上進行，然后，徹底洗滌該復合物并用p65肽洗脫。
三個級分的SDS-PAGE分析揭示了模式變化，該變化歸因于IKK磷酰化或歸因于IκBα/NF-κB蛋白的進一步免疫吸附，但所述分析沒有辨明任何在IKK磷酰化后補充到IκB復合物中的蛋白。蛋白染色的復雜性可能會掩蓋任何補充的蛋白的存在，所述蛋白與經免疫純化的蛋白一起遷移。為了識別補充的蛋白，在源自級分1和2的經膠體藍染色的珠上進行質譜分析。此分析揭示幾乎全部Rel家族蛋白和IκBα的存在，包括NF-κB1(p105)、NF-κB2(p100)、Re1A(p65)、p50、p49、C-Re1、IκBα和IκBε。只有少數其他蛋白與IκB/NF-κB復合物共免疫沉淀，特別是GRP78/Bip、Hsp70和Hsc70。
為了避免可能造成對推定的pIκB-遍在蛋白連接酶的遮蔽，用35S生物合成性標記的HeLa溶胞產物代替連接酶源，并通過SDS-PAGE分析和放射自顯影來跟蹤與IκBα結合的蛋白(圖7B)。相同地，測試不同級分的遍在蛋白-連接酶容量。將活性級分的帶模式(泳道2)與非活性級分的帶模式(泳道1)進行比較。在泳道2中辨別了分子量為54、58、61和64kD的四個35S-蛋白帶。這些蛋白帶中的一些可代表直接識別pIκBα的遍在蛋白連接酶的成分，而其他的則可能與pIκBα間接相關或者與IKK磷酰化復合物的另一成分相關。為了挑選出直接識別pIκBα的連接酶成分，將pp12或對照肽p12S/E加入放射標記的HeLa溶胞產物，接著將該溶胞產物與免疫結合的IκBα/NF-κB復合物一起溫育。對洗脫級分的比較顯示，針對所述四個特殊帶的級分只存在于級分2中，三個帶被特異性pp12肽所消除(p54、p58和p61)，而只有64kD帶在pp12的存在下繼續存在(圖7B，比較泳道2和3)。對照肽不影響特殊蛋白中任一個與pIκBα的結合(泳道4)。p58和p54這兩個與pIκBα相互作用的蛋白是一貫存在的，它們總與特異性遍在蛋白-連接酶活性相關。實施例5鑒定人E3遍在蛋白連接酶本實施例說明人E3遍在蛋白連接酶的分離和表征。
將前實施例所述的54和58kD帶從連接酶陽性和連接酶陰性(HeLa溶胞產物與未磷酰化的IκBα-復合物一起溫育)的泳道中切下，通過納電子噴射質譜，對原位消化的蛋白(Shevchenko et al.，Anal.Chem.68850-858，1996)和由此得到的胰蛋白酶肽測序(Wilm et al.，Nature379466-469，1996)。正如所述，蛋白帶以凝膠態還原，S-烷化，并以凝膠態由過量胰蛋白酶消化(室溫過夜)(Shevchenko et al.，Anal.Chem.68850-858，1996；Wilm et al.，Nature 379466-469，1996)。提取凝膠片，將所得肽混合物濃縮并脫鹽，其中使用含有50nl Poros R2材料(Perceptive Biosystems，Framingham，MA)的微柱。使用1μl 60％甲醇、5％甲酸，將肽直接洗脫到納電子噴射針中。在四級飛行時間質譜儀(QqTOF，Perkin-Elmer Sciex，Toronto，Canada)上記錄納電子噴射圖譜。從碎片譜中裝配出肽序列標志(Mann and Wilm，Anal.Chem.664390-4399，1994)，并使用肽搜索程序(PeptideSearch，Mann and Wilm，Anal.Chem.664390-4399，1994)，在歐洲生物信息研究所(EBI，HinxtonPark，England)維護的非冗余蛋白序列數據庫(nrdb)中搜索該序列標志。
54kD凝膠帶的質譜揭示出一個復雜的肽混合物(圖8A)，從該混合物中選擇一些肽用于碎裂。通過肽序列標志搜索(Mann and Wilm，Anal.Chem 664390-4399，1994)鑒定的蛋白包括NF-κBl(p50)、IκB激酶α、IκBε、RelB、微管蛋白β-1鏈和甲狀腺受體起始子結合蛋白。為了鑒定與E3活性相關的蛋白，選擇少量存在的附加肽用于通過比較來自活性級分和來自非活性級分的54kD帶的譜來進行測序(圖8B)。肽序列標志(1587.81)VVNV(SEQ ID NO23)(1999.09)由圖8C所示的碎片譜導出，并被明確地鑒定為AAVNVVDFDDKYIVSAS(SEQ ID NO24)。其他譜鑒定了肽LEGHEELVR(SEQ ID NO25)、LVVSGSSDNTIR(SEQ ID NO26)、IQDIETIESNWR(SEQ ID NO27)和VISEGMLWK(SEQ ID NO28)。最初的四個片段具有人F盒/WD蛋白β-TrCP中的序列(Margottin et al.Mol.Cell 1565-574，1998)。然而，第五個肽(VISEGMLWK(SEQ ID NO28))與來自果蠅Slimb蛋白的肽(參見Jiang and Struhl，Nature 391493-496，1998)相符，其與人β-TrCP高度同源。進一步的測序鑒定了圖9提供的人E3遍在蛋白連接酶的核酸序列(SEQ ID NO15)，預計的蛋白序列(SEQ ID NO16)示于圖10。因此，人E3遍在蛋白連接酶看起來是同源蛋白β-TrCP/Slimb家族的一個新成員。實施例6進一步表征E3遍在蛋白連接酶活性本實施例進一步說明人E3遍在蛋白連接酶家族成員β-TrCP和Slimb的遍在蛋白連接酶活性。
在無細胞系統中檢測這些蛋白特異性結合pIκBα和輔助其遍在蛋白化的能力。IκBα/NF-κB復合物從HeLa細胞中免疫提純，如上所述，免疫復合物用IKK2-EE磷酰化或模擬磷酰化。它接著與下列已固定的以FLAG示蹤的E3家族成員一起溫育，所述成員從轉染的293細胞中免疫沉淀，包括小鼠β-TrCP(mβ-TrCP)、人β-TrCP(hβ-TrCP)、缺失了F盒區域殘基122-168的人β-TrCP(Δβ-TrCP)和果蠅Slimb蛋白。使用抗IκBα和抗FLAG的抗體，通過Western印跡來分析結合的物質。所有這些蛋白只結合IKK磷酰化的IκBα，而不結合模擬磷酰化的IκBα(參見圖11A)。然而，人和鼠β-TrCP結合IκBα的能力比高度同源的果蠅蛋白好得多(比較泳道2、4、6和8)。Δβ-TrCP結合IκBα的能力甚至比野生型蛋白好，這表明F盒區域對于結合不是必需的。此外，β-TrCP的結合可被代表pIκBα識別基元的肽(pp10；DRHDS(PO3)GLDS(PO3)M，(SEQ ID NO29))所廢止(參見圖11B，泳道3)；而不被對照肽廢止(泳道4)，進而指明了保守DS(PO3)GLDS(PO3)(SEQ ID NO30)序列的pIκBα識別位點。
為了評價結合對遍在蛋白化的影響，在pIκBα遍在蛋白化中，使用E3家族成員和所述缺失突變體作為E3活性的來源。在E1和E2(UBC5C)的存在下，野生型β-TrCP蛋白促進pIκBα的遍在蛋白化，而不促進未磷酰化的IκBα的遍在蛋白化(參見圖11C，泳道1-4)。Δβ-TrCP缺乏F盒蛋白-蛋白相互作用組件，盡管它具有結合能力(圖11A，泳道6)，但它不能促進遍在蛋白化(泳道7和8)。盡管Slimb促進一些pIκBα的遍在蛋白化，但其效力至少比人和鼠β-TrCP低10倍(基于相似的FLAG-標志表達水平)，這與其較弱的活性相對應。
這些家族成員的模塊設計和本文所述的體外分析間接表明，F盒的缺失將形成在體內起顯性陰性分子作用的蛋白。事實上，在受激Jurkat細胞中，Δβ-TrCP的瞬時過度表達抑制了內源性IκBα的降解，從而導致pIκBα的積聚(圖12A)。隨后，NF-κB的活化受到抑制(圖12B)。由于Δβ-TrCP不影響NF-AT受體的活化，所以NF-κB的活化是特異性的。應注意這樣一個事實，即在使用野生型Slimb時也觀察到NF-κB受到抑制，而野生型人β-TrCP的表達不產生抑制作用(圖12B)。因此，野生型Slimb的過度表達對于NF-κB活化具有顯性陰性影響，這可能與其相對弱的pIκBα遍在蛋白化活性有關(圖11B)。
基于前面的敘述，可以理解的是，盡管為舉例說明而在本文描述了本發明的具體實施方案，但仍可進行改進而同時不背離本發明的精神和范圍。因此，本發明僅受所附權利要求的限制。
序列表概要SEQ ID NO1是IκBα的氨基酸序列SEQ ID NO2是IκBα的DNA序列SEQ ID NO3是IκBβ的氨基酸序列SEQ ID NO4是IκBβ的DNA序列SEQ ID NO5是pp7的氨基酸序列SEQ ID NO6是pp11的氨基酸序列SEQ ID NO7是pp15的氨基酸序列SEQ ID NO8是pp19的氨基酸序列SEQ ID NO9是pp21的氨基酸序列SEQ ID NO10是磷酸-Fos肽的氨基酸序列SEQ ID NO11是pp21 S/A的氨基酸序列SEQ ID NO12是以HA示蹤的IκBα的氨基酸序列SEQ ID NO13是以HA示蹤的S32、36IκBα的氨基酸序列SEQ ID NO14是以HA示蹤的IκBβ的氨基酸序列SEQ ID NO15是人E3遍在蛋白連接酶的DNA序列SEQ ID NO16是預測的人E3遍在蛋白連接酶的氨基酸序列SEQ ID NO17是人β-TrCP的DNA序列SEQ ID NO18是人E3β-TrCP的氨基酸序列
SEQ ID NO19是IκBα的磷酰化位點SEQ ID NO20是檢索到的β-TrCP序列SEQ ID NO21是同源p64肽的氨基酸序列SEQ ID NO22是pIκBα肽pp12的氨基酸序列SEQ ID NO23是人E3遍在蛋白連接酶的肽序列標志SEQ ID NO24是來自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO25是來自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO26是來自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO27是來自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO28是來自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO29是pIκBα識別基元的氨基酸序列SEQ ID NO30是保守的pIκBα序列序列表<110>信號藥物公司耶路撒冷希伯來大學伊薩姆研究發展公司<120>調節NF-κB活化的化合物和方法<130>860098.427PC<140>PCT<141>1999-12-09<160>30<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>317<212>PRI<213>智人<400>1Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro1 5 10 15Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser20 25 30Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu35 40 45Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu50 55 60Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu65 70 75 80Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln85 90 95Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln100 105 110Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu115 120 125Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly130 135 140Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val145 150 155 160Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu
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Asp Val Asn Thr325 330 335Gly Glu Met Leu Asn Thr Leu Ile His His Cys Glu Ala Val Leu His340 345 350Leu Arg Phe Asn Asn Gly Met Met Val Thr Cys Ser Lys Asp Arg Ser355 360 365Ile Ala Val Trp Asp Met Ala Ser Pro Thr Asp Ile Thr Leu Arg Arg370 375 380Val Leu Val Gly His Arg Ala Ala Val Asn Val Val Asp Phe Asp Asp385 390 395 400Lys Tyr Ile Val Ser Ala Ser Gly Asp Arg Thr Ile Lys Val Trp Asn405 410 415Thr Ser Thr Cys Glu Phe Val Arg Thr Leu Asn Gly His Lys Arg Gly420 425 430Ile Ala Cys Leu Gln Tyr Arg Asp Arg Leu Val Val Ser Gly Ser Ser435 440 445Asp Asn Thr Ile Arg Leu Trp Asp Ile Glu Cys Gly Ala Cys Leu Arg450 455 460Val Leu Glu Gly His Glu Glu Leu Val Arg Cys Ile Arg Phe Asp Asn465 470 475 480Lys Arg Ile Val Ser Gly Ala Tyr Asp Gly Lys Ile Lys Val Trp Asp485 490 495Leu Val Ala Ala Leu Asp Pro Arg Ala Pro Ala Gly Thr Leu Cys Leu500 505 510Arg Thr Leu Val Glu His Ser Gly Arg Val Phe Arg Leu Gln Phe Asp515 520 525Glu Phe Gln Ile Val Ser Ser Ser His Asp Asp Thr Ile Leu Ile Trp530 535 540Asp 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10<210>28<211>9<212>PRT<213>智人<400>28Val Ile Ser Glu Gly Met Leu Trp Lys1 5<210>29<211>10<212>PRT<213>智人<220><221>MOD RES<222>(5)<223>磷酰化<220><221>MOD RES<222>(9)<223>磷酰化<400>29Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp Ser Met1 5 10<210>30<211>6<212>PRT<213>智人<220><221>MOD RES<222>(2)<223>磷酰化<220><221>MOD RES<222>(6)<223>磷酰化<400>30Asp Ser Gly Leu Asp Ser1 權利要求
1.具有SEQ ID NO16所示序列的分離的多肽或其變體，該變體的區別在于在不超過20％的SEQ ID NO16中的氨基酸殘基上發生一個或多個氨基酸的缺失、插入或替換，以致多肽增強磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用。
2.包括SEQ ID NO16所示的人E3遍在蛋白連接酶的一部分的分離的多肽或其變體，其中所述部分與磷酰化的IκB結合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用。
3.分離的編碼權利要求1所述多肽的多核苷酸，其中該多核苷酸不編碼全長人E3遍在蛋白連接酶。
4.分離的編碼權利要求2所述多肽的多核苷酸。
5.包含至少10個連續的與權利要求3所述多核苷酸互補的核苷酸的反義核苷酸。
6.包含權利要求3-5中任一項所述多核苷酸的表達載體。
7.用權利要求6所述表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
8.藥物組合物，包含(a)人E3遍在蛋白連接酶多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO16所示的序列或其一部分或其變體，該變體的區別在于在不超過20％的SEQ ID NO16中的氨基酸殘基上發生一個或多個氨基酸的缺失、插入或替換，以致多肽增強磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用；和(b)生理上可接受的載體。
9.藥物組合物，包含(a)人E3遍在蛋白連接酶多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO16所示序列的一部分或其變體，該變體的區別在于一個或多個氨基酸的替換、插入、缺失或添加，以致多肽與磷酰化的IκB結合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用；和(b)生理上可接受的載體。
10.藥物組合物，包含(a)編碼人E3遍在蛋白連接酶多肽的多核苷酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO16所示的序列或其一部分或其變體，該變體的區別在于在不超過20％的SEQ ID NO16中的氨基酸殘基上發生一個或多個氨基酸的缺失、插入、添加或替換，以致多肽增強磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用；和(b)生理上可接受的載體。
11.藥物組合物，包含(a)編碼人E3遍在蛋白連接酶多肽的多核苷酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO16所示序列的一部分或其變體，該變體的區別在于一個或多個氨基酸的替換、插入、缺失或添加，以致多肽與磷酰化的IκB結合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用；和(b)生理上可接受的載體。
12.藥物組合物，包含(a)權利要求5所述的反義多核苷酸；和(b)生理上可接受的載體。
13.分離的抗體或其抗原結合片段，其與SEQ ID NO16所示的人E3遍在蛋白連接酶序列相結合。
14.權利要求13所述的抗體或其片段，其中抗體是單克隆抗體。
15.包含權利要求13所述的抗體或其片段以及生理上可接受的載體的藥物組合物。
16.權利要求8-12或15中任一項所述的藥物組合物，在藥品制造中的應用，其中所述藥品用于調節患者的NF-κB的活性。
17.權利要求8-12或15中任一項所述的藥物組合物，在藥品制造中的應用，其中所述藥品用于治療患有與NF-κB活化相關的疾病的患者。
18.權利要求17所述的組合物，其中所述疾病選自炎癥、自身免疫性疾病、癌癥和病毒感染。
19.調節NF-κB活性的物質的篩選方法，包括以下步驟(a)使候選物質與人E3遍在蛋白連接酶多肽接觸，其中所述多肽包含SEQ ID NO16所示序列或者其部分或其變體，所述變體的區別在于一個或多個氨基酸的替換、插入、缺失或添加，以致多肽增強磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用，候選物質與人E3遍在蛋白連接酶多肽接觸的條件和時間足以使多肽和候選物質相互作用；和(b)隨后相對于預先確定的在不存在候選物質時多肽增強磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力，評價多肽增強磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力；由此識別出調節NF-κB活性的物質。
20.權利要求19所述的方法，其中候選物質是存在于組合文庫中的小分子。
21.調節患者中NF-κB活性的方法，包括將包含β-TrCP蛋白(SEQID NO18)或者其部分或其變體的多肽給藥至患者，并因此調節患者中的NF-κB活性，所述變體的區別在于在不超過20％的SEQ ID NO18中的殘基上發生一個或多個氨基酸的插入、缺失、添加或替換，以致多肽增強磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用。
22.在藥品制造中使用的治療有效量的多肽，該多肽包含β-TrCP蛋白(SEQ ID NO18)或者其部分或其變體，所述變體的區別在于在不超過20％的SEQ ID NO18中的殘基上發生一個或多個氨基酸的插入、缺失、添加或替換，以致多肽增強磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用，其中所述藥品用于治療患有與NF-κB活化相關的疾病的患者。
23.權利要求22所述的多肽，其中所述病癥選自炎癥、自身免疫性疾病、癌癥和病毒感染。
24.調節NF-κB活性的物質的篩選方法，包括以下步驟(a)使候選物質與包含β-TrCP蛋白(SEQ ID NO18)或者其部分或其變體的多肽接觸，所述變體的區別在于在不超過20％的SEQ IDNO18中的殘基上發生一個或多個氨基酸的插入、缺失、添加或替換，以致多肽增強磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用，候選物質與多肽接觸的條件和時間足以使多肽和候選物質相互作用；和(b)隨后相對于預先確定的在不存在候選物質時多肽增強磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力，評價多肽增強磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力；由此識別出調節NF-κB活性的物質。
25.權利要求24所述的方法，其中候選物質是存在于組合文庫中的小分子。
全文摘要
本發明提供了用于調節核因子κB(NF－κB)活化的組合物和方法。所述組合物包含一種或多種調節磷酰化IκBα和/或IκBβ的遍在蛋白化的物質。這些組合物可用于治療與NF－κB活化相關的疾病。調節劑包括人E3遍在蛋白連接酶、其抗體及其變體以及相關蛋白。
文檔編號A61K38/53GK1346406SQ99814307
公開日2002年4月24日 申請日期1999年12月10日 優先權日1998年12月10日
發明者安東尼·M·曼寧, 弗蘭克·默丘里奧, 沙倫·阿米特, 伊農·本-內里艾, 馬蒂·戴維斯, 埃達·哈楚拜, 艾里斯·拉萬, 亞伯拉罕·亞龍 申請人:信號藥物公司, 耶路撒冷希伯來大學伊薩姆研究發展公司