對乙型肝炎病毒的聯合治療的制作方法

專利名稱：對乙型肝炎病毒的聯合治療的制作方法
技術領域：
本發明屬于治療乙型肝炎病毒(也稱作″HBV″)方法的領域，該方法包括對需要治療的宿主用已知的具有抗乙肝活性的核苷進行有效的聯合給藥。
HBV是人類僅次于煙草的致癌原因，HBV致癌的機理尚不清楚，盡管有人假定，它可以直接引起腫瘤的發展，或者通過慢性炎癥、肝硬化以及與感染相關的細胞再生，間接地引起腫瘤的發展。
乙肝病毒已經達到在全世界流行的程度。在經過了宿主未覺察到感染的2-3個月潛伏期后，HBV感染可以導致急性肝炎和肝損傷，引起腹部疼痛、黃疸和某些酶的血液濃度升高。HBV可以引起暴發性肝炎，這是一種快速進行性的、常常是致命的疾病形式，其中大塊的肝臟被破壞。
患者一般從急性肝炎階段恢復，但有些患者，高濃度的病毒抗原在血液中延期或無限期持續存在，導致慢性感染。慢性感染會引起慢性遷延性肝炎。在發展中國家，慢性遷延性HBV感染患者是很常見的。至1991年上半年，僅在亞洲就大約有225百萬慢性HBV攜帶者，全世界接近300百萬攜帶者。慢性遷延性肝炎可以引起疲勞、肝硬化和肝細胞癌，這是一種初期肝癌。
在西方發達國家，HBV感染的高危人群包括那些與HBV攜帶者或其血樣接觸的人群。HBV的流行病學與獲得性免疫缺乏綜合征(AIDS)非常相似，這也是為什么HBV感染在AIDS或AIDS相關綜合征患者中普遍的緣故。但是，HBV比HIV更具有傳染性。
然而，在最近，業已通過基因工程生產出疫苗并在廣泛使用。不幸的是，疫苗對已經感染HBV的人沒有什么幫助。雖然也可以指望每天用α-干擾素(一種基因工程蛋白)進行治療，但這種療法對治療的患者只有約三分之一是成功的，此外，干擾素不能口服給藥。
許多合成的核苷類已被證實具有抗HBV活性。Liotta等人的U.S.專利5,539,116所保護的BCH-189的(-)-對映體，稱作3TC，已經被美國食品和藥物管理局批準用于治療乙型肝炎。另見BioChem Pharma，Inc.遞交申請的EPA 0494 119 A1。
Liotta等人的U.S.專利5,814,639和5,914,33l所保護的β-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-噁噻戊環(″FTC″)顯示出抗HBV活性，見Furman等人“順式-5-氟-1-[2-(羥甲基)-1,3-噁噻戊環-5-基]-胞嘧啶(-)和(+)對映體的抗乙型肝炎活性，細胞毒性和代謝分布”Antimicrobial Agentsand Chemotherapy，1992年12月，第2686-2692頁，以及Cheng等人，Journal of Biological Chemistry，Volume267(20)，13938-13942(1992)。
U.S.專利5,565,438、5,567,688和5,587,362(Chu等人)公開了使用2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯呋喃糖基尿苷(L-FMAU)治療乙型肝炎和Epstein Barr病毒。
Emory大學和喬治亞大學研究基金會公司的U.S.專利5,767,122公開并要求保護對映純的下式β-D-二氧戊環基核苷 其中R為NH2、OH、Cl或H。在Raymond F.Schinazi的U.S.專利5,684,010中要求保護一種聯合使用DAPD和FTC治療HBV感染的方法。
噴昔洛韋(Penciclovir)(2-氨基-1，9-二氫-9-[4-羥基-3-(羥甲基)丁基-6H-嘌呤-6-酮；PCV)具有確定的抗乙肝活性，見U.S.專利5,075,445和5,684,153。
Adefovir(9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤，也稱作PMEA或[[2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙氧基]甲基膦酸)，同樣具有確定的抗乙肝病毒活性。參見例如U.S.專利5,641,763和5,142,051。
耶魯大學和喬治亞大學研究基金會公司在WO 92/18517公開了使用L-FDDC(5-氟-3′-硫代-2′，3′-二脫氧胞苷)治療乙肝病毒。
von Janta-Lipinski等人公開了使用3′-氟-修飾的β-2′-脫氧核糖核苷5′-三磷酸酯的L-旋光對映體抑制乙型肝炎聚合酶(J.Med.Chem.，1998，41，2040-2046)。具體地講，公開了3′-脫氧-3′-氟-β-L-胸苷(β-L-FTTP)、2′，3′-二脫氧-3′-氟-β-L-胞苷(β-L-FdCTP)和2′，3′-二脫氧-3′-氟-β-L-5-甲基胞苷(β-L-FMethCTP)的5′-三磷酸酯作為HBV DNA聚合酶的有效抑制劑。
人們已經認識到，長時間使用抗病毒劑治療，會產生HBV的抗藥性變體，通常抗藥性都是通過基因突變產生的，該基因對在病毒生命循環中所使用的酶編碼，對于HBV而言最常見的是，DNA聚合酶。最近，已經有人證明，將化合物與第二種、甚至第三種會導致不同于主藥所引起的突變的抗病毒化合物進行聯合給藥，可以增進抗HBV感染藥物的功效。另外，藥物的藥動學、生物分布或其它參數也可以通過這樣的聯合治療而改變。總而言之，聯合治療可以對病毒同時產生多樣的應激反應。
據美國專利5,808,040公開，L-FMAU可以與FTC、3TC、carbovir、阿昔洛韋、干擾素、AZT，DDI(2′，3′-二脫氧肌苷)、DDC(2′，3′-二脫氧胞苷)L-DDC、L-F-DDC、和D4T進行聯合給藥。
美國專利5,674,849公開將核苷與低聚核苷酸聯合使用，治療病毒性疾病。
美國專利5,684,010公開治療乙型肝炎的方法，包括將下式化合物 其中R是NH2、OH或Cl，與FTC、3TC、carbovir或干擾素聯合給藥或交替給藥。
WO 98/23285公開了治療或預防人或動物患者乙肝病毒感染的方法，包括對患者給以有效量或預防劑量的噴昔洛韋(或其生物前體，如泛昔洛韋)和α-干擾素。
鑒于事實上乙肝病毒已經到了在全球范圍流行的程度，并且對感染的患者具有嚴重的而且常常是悲劇性的傷害，對于被病毒感染的人，仍然強烈需要提供新的有效的、對宿主低毒性的治療。
因此，本發明的目的是為感染了乙肝病毒和相關病癥的病人或其它宿主提供新的治療方法，包括以聯合方式給以協同有效量的抗HBV藥劑。
發明概要現已發現具有乙肝活性的藥劑的某些聯合具有協同作用，因此，以有效的聯合或交替劑量模式給藥時，可以對患者帶來更高的利益。
在本發明的一個優選實施方案中，公開了治療人HBV感染和相關病癥的方法，包括給以協同有效量的β-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-噁噻戊環(FTC)，優選實質上為(-)-光學異構體形式，或其可藥用的鹽、酯或前藥和噴昔洛韋(2-氨基-1，9-二氫-9-[4-羥基-3-(羥甲基)丁基-6H-嘌呤-6-酮；也稱作“PCV”)。在本發明的任一實施方案中，泛昔洛韋(Famciclovir)或其它任何噴昔洛韋的生物前體均可以代替噴昔洛韋。
本發明的另一個優選實施方案是治療人HBV感染和相關病癥的方法，包括以聯合或交替的方式，給以協同有效量的β-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-噁噻戊環(FTC)，優選實質上為(-)-光學異構體形式，或其可藥用的鹽、酯或前藥和9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA，以下也稱作Bis-POM-PMEA或BP-PMEA)或其可藥用的鹽、酯或前藥，任選在可藥用載體中。
在本發明的另一個優選實施方案中，公開了治療人HBV感染和相關病癥的方法，包括以聯合或交替的方式，給以協同有效量的2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯呋喃糖基尿苷(L-FMAU)或其可藥用的鹽、酯或前藥和具有下式的化合物，或其可藥用的鹽、酯或前藥
優選β-D-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧雜戊環-4-基]嘌呤(DAPD)，且該化合物優選以基本純凈的形式給藥，任選在可藥用載體中。
在本發明的另一個優選實施方案中，公開了治療人HBV感染和相關病癥的方法，包括以聯合或交替的方式，給以協同有效量的2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯呋喃糖基尿苷(L-FMAU)或其可藥用的鹽、酯或前藥和噴昔洛韋或其可藥用的鹽、酯或前藥，任選在可藥用載體中。
在本發明的另一個優選實施方案中，公開了治療人HBV感染和相關病癥的方法，包括給以協同有效量的2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯呋喃糖基尿苷(L-FMAU)或其可藥用的鹽、酯或前藥和(9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)或其可藥用的鹽、酯或前藥，任選在可藥用載體中。
本發明的另一個優選實施方案包括治療人HBV感染和相關病癥的方法，包括給以協同有效量的下式的化合物或其可藥用的鹽、酯或前藥和PMEA或其可藥用的鹽、酯或前藥， 其中R是NH2、OH、H或Cl(這里一起稱作DAPD類化合物)，優選β-D-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧雜戊環-4-基]嘌呤(DAPD)，且該化合物優選以基本純凈的形式給藥，任選在可藥用載體中。發明詳述本文所用的術語“經分離的對映體”是指核苷組分包括大約95％-100％，更優選超過97％的核苷的單一對映體。
術語“基本純凈的形式”或基本不含其相反的對映體是指核苷組分的一種對映體中包括不多于約5％的另一種對映體，更優選不多于約2％，最優選存在少于約1％。
化合物或其可藥用酯或鹽的協同聯合作用還用于預防和治療HBV感染和其它相關病癥，如抗-HBV抗體陽性和HBV-陽性狀況、由HBV引起的慢性肝炎、肝硬化、急性肝炎、暴發性肝炎、慢性遷延性肝炎和疲勞。這些協同制劑還可以用于預防或阻止個體的臨床病情進展，這些個體是抗-HBV抗體陽性或HBV抗原陽性，或者是已經接觸HBV。
活性化合物可以通過與適當的酯化試劑如酰氯或酸酐反應，轉化為可藥用的酯。活性化合物或其可藥用衍生物按照常規方法，如與適當的堿作用可以轉化為它們的可藥用鹽。這些酯或鹽可以轉化為母化合物，例如通過水解。
術語“協同聯合”是指藥物的聯合，按照本文所述的方法測定，在體內或體外產生了協同作用。I.活性化合物及其生理上可接受的鹽本文所公開的活性化合物是已知的具有抗乙肝活性的用于治療的核苷或者環狀的或開鏈式的核苷類似物。業已發現核苷的某些聯合優于單一療法，或者優于其它的聯合方式。并非已知抗-HBV藥物的所有的聯合都帶來益處，常見的情況是藥物對抗作用。
活性化合物可以以任何衍生物的形式給藥，只要該衍生物給予受者后，能夠直接或間接地釋放母化合物或者其本身具有活性。非限定性的例子是可藥用鹽(也稱作“生理上可接受的鹽”)，活性化合物的5′和N4-胞嘧啶基或N6-腺嘌呤基酰化(酯化)衍生物(也稱作“生理活性衍生物”)。在一個實施方案中，酰基是羧酸酯，其中酯基的非羰基部分選自直鏈或支鏈的、或環狀的烷基或低級烷基，烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)，芳烷基(包括芐基)，芳氧基烷基如苯氧基甲基，芳基(包括任選被鹵素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的苯基)；或者是磺酸酯，如烷基或芳烷基磺酸酯(包括甲磺酸酯)，磷酸酯包括但不限于一、二或三磷酸酯，三苯甲基或一甲氧基三苯甲基、取代的芐基、三烷基甲硅烷基(如二甲基-5-丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基酯。酯部分的芳基任選包括苯基。
對活性化合物，尤其是在N4-胞嘧啶基或N6-腺嘌呤基和5′-O位置上進行修飾，可以影響活性物質的生物利用度和代謝速率，并由此獲得對活性物質釋放的控制。此外，修飾還可以影響化合物的抗病毒活性，在某些情況下可以增強母化合物的活性。按照本文所述的方法和本領域技術人員熟知的方法制備衍生物并測試它的抗病毒活性，可以容易地對此進行評估。前藥本文所述的任何抗乙肝藥劑均可以以前藥的形式進行給藥，以提高核苷的活性、生物利用度、穩定性或改變其性質。許多羥基連接的前藥配基是已知的。一般情況下，羥基的烷基化、酰化或其它親脂性的修飾，核苷的一、二或三磷酸酯都會增強核苷的穩定性。可以在羥基上或磷酸酯部分置換一個或多個氫的取代基例子是烷基、芳基、類固醇、碳水化合物(包括糖)、1，2-二酰基甘油和醇。更多的描述在R.Jones和N.Bischofberger，抗病毒研究(Antiviral Research)，27(1995)1-17，所有這些均可用于和所公開的核苷聯合，以達到期望的效果。
一些U.S.專利公開了適當的親脂性的可以以共價鍵結合到核苷上的取代基，優選結合到核苷的5′-OH或開鏈式的核苷類似物(如PMEA或噴昔洛韋)的羥基上。非限定性的例子包括U.S.專利5,149,794(1992年9月22日，Yatvin等人)、5,194,654(1993年3月16日，Hostetler等人)、5,223,263(1993年6月29日，Hostetler等人)、5,256,641(1993年10月26日，Yatvin，等人)、5,41l,947(1995年5月2日，Hostetler等人)、5,463,092(1995年10月31日，Hostetler等人)、5,543,389(1996年8月6日，Yatvin等人)、5,543,390(1996年8月6日，Yatvin等人)、5,543,391(1996年8月6日，Yatvin等人)和5,554,728(1996年9月10日，Basava等人)。
一些外國專利申請公開了可結合到本發明活性化合物上的親脂性取代基和親脂性制劑，包括WO89/02733、WO90/00555、WO91/16920、WO91/18914、WO93/00910、WO94/26273、WO/15132、EP0350287、EP93917054.4和WO91/19721。II.活性化合物的制備用于本發明協同聯合的治療性核苷及其制備方法是本領域已知的。
β-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-噁噻戊環(FTC)及其對映體可以按照U.S.專利5,204,466、5,700,937、5,728,575和5,827,727公開的方法制備。
2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯呋喃糖基尿苷(L-FMAU)可以按照Chu等人的U.S.專利5,565,438、5,567,688和5,587,362公開的方法制備。
DAPD類化合物，包括(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-氧雜戊環-4-基]嘌呤(DAPD)的制備方法公開在U.S.專利5,767,122、5,684,010、5,444,063和5,179,104上。
噴昔洛韋可以按照公開在U.S專利5,075,445和5,684,153中的方法進行制備。
PMEA可以按照公開在U.S.專利5,641,763和5,142,051的方法制備。
活性核苷的一、二和三磷酸酯衍生物可以按照已公開的方法進行。制備一磷酸酯可以按照Imai等人，J.Org.Chem.，34(6)，1547-1550(June 1969)所述的方法制備，二磷酸酯可以按照Davisson，等人.J.Org.Chem.，52(9)，1794-1801(1987)所述的方法制備，三磷酸酯可以按照Hoard等人.J.Am.Chem.Soc.，87(8)，1785-1788(1965)所述的方法制備。III.聯合治療已經確認，在長期使用抗病毒劑治療后，會產生HBV的抗藥性變體，通常抗藥性都是通過基因突變產生的，該基因對在病毒生命循環中所使用的酶編碼，對于HBV而言最常見的是，DNA聚合酶。最近，已經有人證明，將化合物與第二種、甚至第三種會導致不同于主藥所引起的突變的抗病毒化合物進行聯合給藥，可以延長、增強或恢復抗HBV感染藥物的功效。另外，藥物的藥動學、生物分布或其它參數也可以通過這樣的聯合治療而改變。總而言之，聯合治療可以對病毒同時產生多樣的應激反應。
由于細胞外和細胞內HBV DNA濃度的固有差異，相對于未處理細胞中的這些HBV DNA形式的平均水平，只有HBV病毒顆粒DNA受到3倍以上的阻抑，一般才認為在統計學上是有意義的[P＜0.05](Korba和Gerin，抗病毒研究(Antiviral Res.)1955-70，1992)。對于未處理細胞，細胞外HBV病毒顆粒DNA的典型值在80-150pg/ml培養基(平均約92pg/ml)。
為了便于參照，在這些試驗中進行了雜交分析，該方法使得約1.0pg細胞外的HBV DNA/ml培養基等價于3×105病毒顆粒/ml。
為了探知所觀察到的抗病毒效果是否歸因于對細胞活力的整體影響，進行了毒性分析，所用的方法是中性紅染料攝入法(Uptake ofneutral red dye)，這是一種標準的和廣泛應用的細胞活力測定方法，適于各種病毒-宿主體系，包括HSV和HIV。該方法的細節見毒性的表格說明。試驗參量測試化合物在收到時包裝良好，室溫下為固體。將測試化合物溶解于100％的組織培養品級(tissue culture grade)的DMSO(Sigma，Corp.)，濃度為100mM(DAPD，FTC，L-FMAU)或50mM(DXG)。在獨立的試管中，將化合物制成每日等分試樣，并儲藏在-20℃。每天進行治療時，在室溫下將每日等分試樣懸浮于培養基中，并立即加入到細胞培養物中。
為了進行抗病毒分析，將融合的培養物置于96-孔平底組織培養板。對于每種藥物治療，均采用兩個獨立的培養板(平行測定)；每個培養板上的全部3個培養物，都用抗病毒劑的各個稀釋度進行治療(每個稀度6個培養物)。培養物接續用9個日劑量的測試化合物進行治療，每天更換含新鮮的測試化合物的培養基。然后只測定細胞外(病毒顆粒)HBV DNA濃度。
毒性分析采用96-孔平底組織培養板進行。按照抗病毒分析所采用的相同程序并在同樣的培養條件下，將用于毒性分析的細胞進行培養和用測試化合物處理，每個化合物在4種濃度下進行測試，每個濃度一式三份培養物，采用中性紅染料攝入法，在最后一次處理24小時后測定毒性的相對強度。將內化染料在510 nM處的吸光度(A510)用于定量分析，其值表示為平均A510值的百分數(±標準偏差)，未處理細胞的9個獨立培養物樣品與測試化合物處于同一96-孔培養板上。
聯合治療采用基本的分析方式進行，不同的是，對每個藥物聯合采用6個系列的3倍稀釋液，每個聯合稀釋液共使用8個獨立培養物。化合物按照設定的摩爾比混合，以EC90值計，得到接近等效的抗病毒效果。對每種聯合采用三種不同的摩爾比，以判斷相對效能的變化性。這些摩爾比貫穿于稀釋液系列。與聯合治療相平行，采用標準的基本分析方式進行相應的單一治療。
為了報導結果，所述聯合治療的SI、EC50、EC90和CC50值是聯合混合物中第一個化合物的值。混合物中第二個化合物的濃度、SI、EC50、EC90和CC50值是可以根據具體混合物的指定摩爾比計算出來的。對于所實施的聯合方案更詳細的分析可見于BE Korba(1996)抗病毒研究(Antiviral Res).2949。
采用CalcuSynTM程序(Biosoft，Inc.)進行數據分析，分析確定出協同作用、加和作用或拮抗作用，該程序采用廣為認可的Chou和Talalay方法，并采用Monte Carlo統計軟件包，結合統計學求值，評價藥物的相互作用。采用幾種不同的格式來展示數據，包括中值-效應和劑量-效應圖、等輻射熱測量圖(isobolograms)和聯合指數[CI]圖，并給出標準偏差。對后面的分析而言，CI大于1.0表示拮抗作用，CI小于1.0顯示協同作用。
對于聯合治療相關的毒性分析，將試驗方案限于混合物中毒性更大的化合物或原液濃度(例如，相對于可加入到培養物中而不產生毒性的DMSO總體積，此毒性是指由DMSO導致不是指由測試化合物導致)。抗病毒評價對照試驗在正常的波動范圍內，未處理的細胞在被攻擊期(challenge period)，細胞外的HBV(病毒顆粒)DNA濃度保持恒定。陽性治療對照，3TC(拉米夫定)[((-)β，L，2′，3′-二脫氧-3′硫代胞苷]和噴昔洛韋[PCV](二者均購自Moraveck Biochemicals，La Brea，CA)，在所使用的濃度下對HBV DNA復制均產生明顯的阻抑。在這些分析測試中所觀察到的3CT活性與已有試驗相一致，在對2.2.15細胞進行連續9天的治療后，相對于未處理細胞的平均水平，0.15-0.2μM的3TC對HBV病毒顆粒DNA產生90％阻抑[EC90](例如，參見Korba和Boyd，Antimicrob.Agents Chemother.(1996)401282-1284)。在這些分析測試中所觀察到的PCV活性高于已有試驗所報告的值(EC90約為0.7-0.9μM，Korba和Boyd，Antimicrob.Agents Chemother.(1996)401282-1284)。但是，在幾個其它非相關試驗中，這些試驗所用的PCV制劑在本文所報告的范圍內始終產生抗-HBV活性。
化合物測試測試化合物DAPD、FTC、DXG和L-FMAU對于由2.2.15細胞產生的細胞外(病毒顆粒)HBV DNA水平，產生顯著的、選擇性的阻抑。
與FTC合并治療，DAPD的抗病毒活性增強。除最高測試濃度外，DAPD的抗病毒活性在3∶1或1∶1的摩爾比的所有濃度下是協同的。隨著FTC相對濃度的增加，兩種藥劑的協作效應下降。在1∶3的摩爾比情況下，兩種藥劑顯現出拮抗作用。
DAPD和PCV在全部三種摩爾比和所有濃度下，均顯現出拮抗作用。
在1∶10和1∶1的摩爾比情況下，DAPD和L-FMAU顯現出拮抗作用。在1∶3的摩爾比(約等于EC90的效果)情況下，兩種藥劑的相互作用更為復雜。在較低濃度下，DAPD和L-FMAU表現出中等的協同作用以至加和作用，在較高濃度下逐漸發展為拮抗的性的作用。但后來的測試表明，DAPD與L-FMAU是相互協同的。
與FTC合并治療，L-FMAU的抗病毒活性增強。除最高測試濃度外，L-FMAU的抗病毒活性在3∶1或10∶1的摩爾比情況的所有濃度下是中等協同作用的。隨著FTC相對濃度的增加，兩種藥劑的協作效應下降。在1∶1的摩爾比情況下，兩種藥劑顯現出拮抗作用。
與PCV合并治療，L-FMAU的抗病毒活性也是增強的。在所有測試濃度下，L-FMAU的抗病毒活性在1∶1或1∶3的摩爾比具有弱的協同作用。隨著PCV相對濃度的增加，兩種藥劑的協作效應下降。在1∶10的摩爾比情況下，兩種藥劑顯現出拮抗作用。毒性評價在抗病毒評價中所用濃度下的3TC、PCV、或者任一測試化合物均未觀察到明顯的毒性(對從未處理細胞觀察到的染料攝入水平，有大于50％的阻抑)。
在不同的混合物中，聯合治療均未顯出增強其中任一藥劑毒性的趨勢。一些聯合混合物的毒性明顯高于相應的單一治療，因為所報告的值是以各混合物中所列第一化合物濃度作為參數的。這一點對含有PCV的混合物尤為顯著。但是，按照混合物中第二化合物(如PCV)重新計算毒性趨勢，則看出所有的表觀毒性是由更多的毒性化合物引起的，而這些聯合并沒有增強毒性。
化合物測試測試化合物FTC對于2.2.15細胞生產的細胞外(病毒顆粒)HBV DNA水平，產生顯著的、選擇性的阻抑。
與PCV合并治療，FTC的抗病毒活性增強。在測試的所有摩爾比下，聯合治療的抗病毒活性是協同的。隨著PCV相對濃度的增加，兩種藥劑的協作效應下降。毒性評價在抗病毒評價中所用濃度(表S1、T1)下，3TC、PCV、FTC或者任一聯合治療均未觀察到明顯的毒性(對從未處理細胞觀察到的染料攝入水平，有大于50％的阻抑)。
在不同的混合物中，聯合治療均未顯出增強其中任一藥劑毒性的趨勢。一些聯合混合物的毒性明顯高于相應的單一治療，是因為所報告的值是以各混合物中所列第一化合物濃度作為參數的。
詳細的測試方法如上面所給出，測試化合物(Bis-POM-PMEA除外)在收到時包裝良好，在干冰冷卻下為粉末物質并儲藏在-20℃。測試化合物Bis-POM-PMEA在收到時為100mM的DMSO溶液。在獨立的試管中，制成測試化合物的每日等分試樣，并儲藏在-20℃。每天進行治療時，在室溫下將每日等分試樣懸浮于培養基中，并立即加入到細胞培養物中。
化合物測試(原始分析)全部測試化合物對于2.2.15細胞生產的細胞外(病毒顆粒)HBV DNA水平，均產生顯著的、選擇性的阻抑。但是，(-)-β-FTC、DAPD和L-FMAU的效力低于先前分析測試所觀察到的結果，對于DAPD和L-FMAU最為明顯。
Bis-POM-PMEA(BP-PMEA)+FTC。BP-PMEA和FTC的混合物產生的抗-HBV活性全部是中等協同的。混合物的效力隨著FTC的相對比例增加而增強。但總的來說，FCT的濃度按比例降低的情況下，產生最好的相互作用。在30∶1混合物的所有濃度下，一般均能觀察到相對同樣程度的協同作用。在10∶1和3∶1混合物的較低濃度下，觀察到相對更強的協同作用；在3∶1混合物的最高濃度下，觀察到中等的以至強的拮抗作用。
BP-PMEA+DAPD。BP-PMEA和DAPD的混合物產生的抗-HBV活性，在相對較低的DAPD濃度下為中等至弱的協同作用，而在相對較高的的DAPD濃度下為中等至強的拮抗作用。混合物的效力也隨著DAPD相對比例的增加而下降。在不同混合物的較低濃度下，觀察到相對較強的協同作用。
BP-PMEA+L-FMAU。BP-PMEA和L-FMAU的混合物產生的抗-HBV活性，在相對較低的L-FMAU濃度下是中等協同的，在相對較高的L-FMAU濃度下是加和性的以至弱拮抗性的。在相對最高濃度(1∶1摩爾比)的L-FMAU下，混合物的效力最低。兩種化合物摩爾比為3∶1時，總的來說觀察到最好的相互作用。在不同混合物的較低濃度下，觀察到相對較強的協同作用。毒性評價在抗病毒評價中所用濃度下，3TC、任一測試化合物或者任一化合物的混合物均未觀察到明顯的毒性(對從未處理細胞觀察到的染料攝入水平，有大于50％的阻抑)。化合物的混合物均未明顯地增強毒性。所觀察到的化合物混合物毒性模式與單一治療所觀察到的相似或一致。IV.藥物組合物的制備對于患有由HBV感染引起的所述疾病的人可如下進行治療，對患者給以有效量的具有確定協同作用的抗-HBV藥劑，以聯合形式給藥，或者以獨立劑量形式聯合治療或交替治療，所述藥劑任選在可藥用載體或稀釋劑中。活性物質可以以液體或固體形式，通過任何適當的途徑給藥，例如口服、腸胃外給藥、靜脈注射、透皮給藥、皮下給藥或局部給藥。
將足量的活性化合物包含在可藥用載體或稀釋劑中，對患者釋放出治療有效量的化合物以抑制病毒在體內的復制，尤其是HBV的復制，而對受治療的患者不產生嚴重的毒性作用。″抑制劑量″是指足夠產生抑制作用例如按照上述測試方法測定的抑制作用的活性成分的量。
在所有的上述條件下，優選的化合物劑量可以是約1-50mg/kg，優選1-20mg/kg體重每天，更一般的情況下，每天每千克受者體重0.1-約100mg。可藥用衍生物的有效劑量范圍可以根據釋放的母體核苷的重量進行計算。如果衍生物本身具有活性，可以按照上述方法用衍生物的重量，或者按照本領域技術人員所熟知的其它方法估算有效劑量。
化合物可方便地以單位劑量形式或任何適當的劑量形式給藥，包括但不限于每單位劑量形式含有7-3000mg，優選70-1400mg的活性成分。通常50-1000mg的口服劑量是方便的，更常見的是50-300mg。
活性化合物的理想給藥方式是活性化合物的血漿峰濃度達到約0.2-70μM，優選約1.0-10μM，這一點可以通過，例如靜脈注射0.1-5％活性成分的溶液(任選在生理鹽水中)，或者以活性成分的大丸劑形式給藥來實現。
活性化合物在藥物組合物中的濃度依賴于藥物的吸收作用、失活作用和排泄速率，以及其它的本領域技術人員已知的因素。值得一提的是劑量標準也隨著治療病情的嚴重程度而變化。可以理解的還有對于具體的受治療者，應當根據個體的需要和主管給藥人員的專業判斷，隨時間調整具體的劑量配給方案。本文所述的濃度范圍僅僅是示范性的，而不是用來限定要求保護的組合物的范圍和實施。活性成分可以一次性給藥，也可以分成數個較小的劑量在不同的時間間隔給藥。
活性化合物優選的給藥方式是口服，口服組合物通常含有惰性稀釋劑或可食的載體。它們可以包封在明膠膠囊或壓成片劑。為了便于口服給藥治療，活性化合物可以與賦型劑混合，以片劑、錠劑或膠囊形式使用。藥學上適合的粘結劑和/或輔劑也可以作為部分組成包括在內。
片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可以含有以下任意組分或性質相似的化合物粘結劑如微晶纖維素、黃耆膠或明膠；賦型劑如淀粉或乳糖；崩解劑如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助滑劑如膠質二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或矯味劑如薄荷油、水楊酸甲酯或橙味調味料。如果劑量單位形式是膠囊，那么，除了上述類型物質以外，還可以含有液體載體如脂肪油。此外，劑量單位形式可以含有改善劑量單位物理形狀的其它各種物質，例如，糖衣、蟲膠包衣或其它腸衣劑。
化合物可以作為酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、咀嚼膠或類似劑型的一個組分給藥。糖漿劑除了活性化合物以外，可以含有蔗糖作為甜味劑，以及一些防腐劑、染料、著色劑和調味香料。
化合物或其可藥用的衍生物或鹽還可以和無損于所需作用的其它活性物質相混合，或者與具有增補所需作用的物質相混合，例如抗生素、殺真菌劑、抗炎劑、蛋白酶抑制劑，或其它核苷類或核苷類抗病毒劑，如上面詳細所述。用于腸胃外給藥、透皮給藥、皮下給藥或局部應用的溶液或懸浮液可以包括下面的組分無菌稀釋劑如注射用水、生理鹽水、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及張力調節劑如氯化鈉或葡萄糖。腸胃外給藥制劑可以封裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器和多倍劑量的小瓶中。
如果是靜脈注射，優選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
在優選的實施方案中，活性化合物的制劑載體能夠防止化合物從體內快速排除，如緩釋制劑，包括植入物和微囊包封的緩釋體系。可以使用能進行生物降解的、生物相容性的聚合物，如乙烯-乙酸乙烯基酯、聚酐類、聚羥基乙酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這些制劑的制備方法對本領域技術人員而言是顯而易見的，所需物質還可以從AlzaCorporation公司商購。
脂質體懸浮液(包括脂質體，其靶向帶病毒抗原單克隆抗體的受染細胞)也是優選的可藥用載體。這些均可以按照本領域技術人員所熟知的方法制備，如U.S.專利4,522,811所述。舉例來講，制備脂質體制劑可以將適當的脂質如硬脂酰磷脂酰基乙醇胺、硬脂酰磷脂酰基膽堿、二十烷酰磷脂酰基膽堿和膽固醇溶解于無機溶劑，然后蒸發，在容器表面留下一層干脂質薄膜，將活性化合物或其單磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液加入到容器中，然后用手旋轉搖動容器，以使容器壁上的脂質物質脫離并分散脂質聚集體，從而形成脂質體懸浮液。
本發明參照其優選實施方案進行了描述。從本發明上面的詳細描述，對本發明進行變化和修飾，對本領域技術人員而言是顯而易見的，這些變化和修飾均包括在本發明范圍之內。
權利要求
1.一種治療人乙肝病毒的方法，包括以聯合形式或交替形式給以協同有效量的β-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-噁噻戊環(β-FTC)或其可藥用的鹽、酯或前藥和有效量的選自噴昔洛韋、泛昔洛韋和Bis-POM-PMEA的第二種抗乙肝劑。
2.權利要求1的方法，其中β-FTC為(-)-光學異構體形式。
3.權利要求2的方法，其中第二種抗乙肝劑為噴昔洛韋。
4.權利要求2的方法，其中第二種抗乙肝劑為泛昔洛韋。
5.權利要求2的方法，其中第二種抗乙肝劑為Bis-POM-PMEA。
6.一種治療人乙肝病毒的方法，包括以聯合形式或交替形式給以協同有效量的2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯呋喃糖基尿苷(L-FMAU)或其可藥用的鹽、酯或前藥和有效量的第二種抗乙肝劑，其選自其中R是NH2、OH、Cl或H的下式化合物或其可藥用的鹽、酯或前藥 噴昔洛韋和9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)或其可藥用的鹽、酯或前藥。
7.權利要求6的方法，其中第二種抗乙肝劑為下式化合物或其可藥用的鹽、酯或前藥 其中R是OH。
8.權利要求6的方法，其中第二種抗乙肝劑為下式化合物或其可藥用的鹽、酯或前藥 其中R是NH2。
9.權利要求6的方法，其中第二種抗乙肝劑為噴昔洛韋。
10.權利要求6的方法，其中第二種抗乙肝劑為PMEA或其可藥用的鹽、酯或前藥。
11.一種治療人乙肝病毒的方法，包括以聯合形式或交替形式給以協同有效量的下式所示化合物或其可藥用的鹽、酯或前藥 其中R是NH2、OH、Cl或H，和有效量的選自PMEA或其可藥用鹽、酯或前藥的第二種抗乙肝劑。
12.權利要求11的方法，其中R是OH。
13.權利要求1l的方法，其中R是NH2。
14.協同有效量的β-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-噁噻戊環(β-FTC)或其可藥用的鹽、酯或前藥和有效量的選自噴昔洛韋、泛昔洛韋和Bis-POM-PMEA的第二種抗乙肝劑用于治療乙肝病毒的用途。
15.協同有效量的2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯呋喃糖基尿苷(L-FMAU)或其可藥用的鹽、酯或前藥和有效量的第二種抗乙肝劑用于治療乙肝病毒的用途，所述第二種抗乙肝劑選自其中R是NH2、OH、Cl或H的下式化合物或其可藥用的鹽、酯或前藥 噴昔洛韋和9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)或其可藥用的鹽、酯或前藥。
16.協同有效量的下式化合物或其可藥用的鹽、酯或前藥 其中R是NH2、OH、Cl或H，和有效量的選自PMEA或其可藥用鹽、酯或前藥的第二種抗乙肝劑用于治療乙肝病毒的用途。
17.一種藥物組合物，包括和有效量的選自噴昔洛韋、泛昔洛韋和Bis-POM-PMEA的第二種抗乙肝劑協同聯合的有效量的β-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-噁噻戊環(β-FTC)或其可藥用的鹽、酯或前藥。
18.權利要求17的藥物組合物，其中第二種抗乙肝劑為噴昔洛韋。
19.權利要求17的藥物組合物，其中第二種抗乙肝劑為泛昔洛韋。
20.權利要求17的藥物組合物，其中第二種抗乙肝劑為Bis-POM-PMEA。
21.一種藥物組合物，包括和有效量的第二種抗乙肝劑協同聯合的有效量的2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯呋喃糖基尿苷(L-FMAU)或其可藥用的鹽、酯或前藥，所述第二種抗乙肝劑選自其中R是NH2、OH、Cl或H的下式化合物或其可藥用的鹽、酯或前藥 噴昔洛韋和9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)或其可藥用的鹽、酯或前藥。
22.權利要求2l的藥物組合物，其中R是NH2。
23.權利要求21的藥物組合物，其中R是OH。
24.一種藥物組合物，包括和有效量的選自PMEA或其可藥用鹽、酯或前藥的第二種抗乙肝劑協同聯合的有效量的下式化合物或其可藥用的鹽、酯或前藥 其中R是NH2、OH、Cl或H。
25.權利要求24的藥物組合物，其中R是NH2。
26.權利要求24的藥物組合物，其中R是OH。
全文摘要
本發明涉及治療人乙型肝炎病毒感染的方法,該方法包括以聯合方式或交替方式給以協同有效量的已知的抗乙肝活性藥劑。具體講,本發明涉及治療乙型肝炎病毒感染的方法,包括以聯合形式或交替形式給以FTC和噴昔洛韋、泛昔洛韋或Bis－POM－PMEA;此外,本發明涉及治療乙型肝炎病毒感染的方法,包括以聯合形式或交替形式給以L－FMAU和DAPD、噴昔洛韋或Bis－POM－PMEA;本發明還涉及治療乙型肝炎病毒感染的方法,包括以聯合形式或交替形式給以DAPD和Bis－POM－PMEA。
文檔編號A61K31/52GK1329497SQ99814147
公開日2002年1月2日 申請日期1999年11月2日 優先權日1998年11月2日
發明者菲利普·A·弗曼, 喬治·R·佩因特, 戴維·巴里, 弗蘭克·魯索 申請人:三角藥物公司